譚舜，楊逸文，蔣小美，姜波，徐建榮，韓曉磊

（1.常熟理工學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.南京仙夏生物科技有限公司，江蘇 南京 210000）

仙女蝦（fairy shrimp）是節(jié)肢動(dòng)物門(mén)Arthropoda鰓足綱Branchiopoda 無(wú)甲目Anostraca 一類物種的統(tǒng)稱，品種繁多，在世界各地均有分布，是平時(shí)不易見(jiàn)到的季節(jié)性水生浮游動(dòng)物。目前，仙女蝦的研究和利用較為成熟的是重要的海水魚(yú)蝦蟹幼體開(kāi)口餌料海水鹵蟲(chóng)[1]。紅尾仙女蝦Branchinella thailandensis 隸屬于釵額蟲(chóng)科Thamnocephalidae 枝額蟲(chóng)屬Branchinella，為淡水仙女蝦，生活史較為簡(jiǎn)單。紅尾仙女蝦蝦卵進(jìn)行干燥處理后可長(zhǎng)時(shí)間保存，適合長(zhǎng)距離運(yùn)輸，其初孵的無(wú)節(jié)幼體體長(zhǎng)0.3～0.5 mm，適合魚(yú)蝦蟹類初孵幼體開(kāi)口攝食，故可作為新型淡水生物開(kāi)口餌料[2]。因紅尾仙女蝦生命周期較短，僅2～3 個(gè)月，對(duì)生境要求較高，多生活在水質(zhì)良好的暫時(shí)性水體；季節(jié)性較強(qiáng)，只在初夏秋末有小規(guī)模爆發(fā)，在自然界活體較少，處于較為稀有的狀態(tài)。因此，紅尾仙女蝦僅在印度和泰國(guó)有少量研究，主要涉及其地理群體分布、暴發(fā)地自然生境條件和鳥(niǎo)、魚(yú)攜帶休眠卵情況及黑斑病和桿菌病兩種病害等研究[3-7]。從2008 年至今，在新疆、云南、河北和江蘇等省先后報(bào)道了淡水仙女蝦的自然存在，但其相關(guān)研究乃至人工養(yǎng)殖還處于空白狀態(tài)[8,9]?，F(xiàn)階段，我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)急需一種類似于海水鹵蟲(chóng)的淡水開(kāi)口活餌料，紅尾仙女蝦可以適時(shí)加以開(kāi)發(fā)利用，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增（inter simple sequence repeat，ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定快速，無(wú)需預(yù)先了解基因組序列特點(diǎn)，降低了實(shí)驗(yàn)難度和實(shí)驗(yàn)成本，已被廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物遺傳多樣性分析、遺傳作圖、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等領(lǐng)域[10-13]。本研究對(duì)紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體的ISSR 分子標(biāo)記反應(yīng)體系進(jìn)行探索和優(yōu)化，由此研究分析了其遺傳多樣性，為了解紅尾仙女蝦的遺傳背景，乃至種質(zhì)資源評(píng)定、保護(hù)及利用等工作提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)用的24 個(gè)紅尾仙女蝦樣本為蘇州市長(zhǎng)江特色水產(chǎn)培育繁殖養(yǎng)殖研究中心提供的人工養(yǎng)殖F4代成體，活體保存于-80℃冰箱待用。所用引物參照UBC 公司2006 年公布的ISSR 引物序列，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，用于ISSR 反應(yīng)的PCR buffer、Mg2+、dNTP、Taq DNA 聚合酶等均購(gòu)于TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取

選取紅尾仙女蝦剝離腸道的全部組織，基因組DNA 的提取參照韓曉磊等[14]的方法并略加改進(jìn)。用分光光度計(jì)（Thermo Scientific NanoDrop 2000）測(cè)定基因組DNA 的濃度，并通過(guò)凝膠成相系統(tǒng)（UVP Biospectrum 410）檢測(cè)DNA 的完整性，檢測(cè)合格的DNA 樣本置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 退火溫度的優(yōu)化及引物篩選

以檢測(cè)后得到的24 個(gè)紅尾仙女蝦DNA 的混合樣為DNA 模板，按通用PCR 條件對(duì)90 個(gè)ISSR引物進(jìn)行初篩，選擇擴(kuò)增條帶較多、信號(hào)強(qiáng)和背景清晰的引物。退火溫度范圍設(shè)置為48～59℃，PCR 儀自動(dòng)生成12 個(gè)梯度，分別為48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃。

1.2.3 ISSR-PCR 正交試驗(yàn)

針對(duì)25 μL 的PCR 體系，選擇Mg2+、引物、Taq DNA 聚合酶因素3 水平3 進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)（表1）。正交試驗(yàn)中，PCR 反應(yīng)體系總體積為25 μL，除表1 中變化因素外，每管中2.5 μL 的10×PCR Buffer、2 μL 的dNTP 和1 μL 的模板DNA 固定不變，ddH2O 根據(jù)其他試劑的用量定容至25 μL，所用引物為上文中提取篩選出的引物。

表1 紅尾仙女蝦ISSR-PCR 正交試驗(yàn)Tab.1 The orthogonal experiment of ISSR-PCR in fairy shrimp Branchinella thailandensis

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體ISSR 的電泳圖譜進(jìn)行人工讀帶，相同引物得到的電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性，是相同位點(diǎn)的產(chǎn)物，無(wú)條帶或模糊條帶的記為0，有條帶的記為1，得到0，1 數(shù)據(jù)矩陣。利用POPGEN32 計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)比率、遺傳相似度和遺傳多樣性，并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選和正交試驗(yàn)

通過(guò)引物初篩實(shí)驗(yàn)，對(duì)90 個(gè)ISSR 引物進(jìn)行篩選；通過(guò)PCR 擴(kuò)增后的電泳檢測(cè)，確定擴(kuò)增條帶較多、信號(hào)強(qiáng)和背景清晰的引物并記錄，以便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

PCR 過(guò)程中需要多種試劑聯(lián)合反應(yīng)，各因素都會(huì)影響其結(jié)果，Mg2+、引物和Taq 酶等條件不同，其結(jié)果差異很大。由圖1 可知，在9 個(gè)不同條件處理中，3 種因素的不同組合濃度不同，擴(kuò)增結(jié)果也明顯不同。泳道4、6、7 的多態(tài)性較低，泳道5、6、7 條帶強(qiáng)度較高，其原因受多種因素所致。泳道2、3 條帶清晰，多態(tài)性高，背景對(duì)比度好。經(jīng)過(guò)比較，以特異譜帶多態(tài)性高、背景對(duì)比度好、主帶清楚、副帶明顯為標(biāo)準(zhǔn)，考慮到實(shí)驗(yàn)的成本以及效果等因素，確定該引物ISSR-PCR 的最佳反應(yīng)體系為：25 L 反應(yīng)體系中包含Taq 酶0.5 U，引物1.25 μL，Mg2+3.0 μL，模板DNA 1 μL，dNTP 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，其他引物以同樣方法確定最佳反應(yīng)體系（表2）。

圖1 引物866 的ISSR-PCR 擴(kuò)增正交試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of ISSR-PCR orthogonal test for primer 866

表2 ISSR-PCR 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Tab.2 The orthogonal design ISSR-PCR

2.2 退火溫度梯度PCR

根據(jù)已篩選的8 個(gè)引物及其建立的紅尾仙女蝦ISSR 反應(yīng)體系，優(yōu)化這8 個(gè)引物的退火溫度。結(jié)、,果發(fā)現(xiàn)引物不同，其最佳退火溫度不同。由溫度梯度PCR 結(jié)果（圖2）可知，當(dāng)溫度較低時(shí)（48～52℃），譜帶背景較低，且上半部分?jǐn)U增條帶不清楚。溫度梯度逐漸提高時(shí)（53～59℃），上半部分背景提高，條帶逐漸增多，更加清晰。

圖2 不同退火溫度對(duì)引物874 的ISSR-PCR 擴(kuò)增結(jié)果的影響Fig.2 Effect of different annealing temperature on ISSRPCR results of primer 874

2.3 ISSR-PCR 反應(yīng)最佳條件確定

根據(jù)引物篩選、正交試驗(yàn)和退火溫度梯度試驗(yàn)結(jié)果，最終確定紅尾仙女蝦的8 個(gè)ISSR 引物的最佳反應(yīng)體系（表3）。

表3 不同引物的ISSR-PCR 反應(yīng)最佳條件Tab.3 The optimal conditions of different primers for ISSR-PCR

2.4 ISSR 擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)選定效果最好的6 個(gè)ISSR 引物，對(duì)紅尾仙女蝦人工養(yǎng)殖群體的24 個(gè)DNA 樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，6 個(gè)ISSR 引物擴(kuò)增出來(lái)的條帶數(shù)在5～8之間，共擴(kuò)增出37 個(gè)可統(tǒng)計(jì)的位點(diǎn)。圖3 為引物809 在紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體24 個(gè)個(gè)體間的ISSR 擴(kuò)增譜圖。

圖3 引物809 在紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體中的ISSR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The ISSR amplification of primer 809 in cultured populations of fair shrimp B.thailandensis

2.5 養(yǎng)殖群體遺傳多樣性

在紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體擴(kuò)增出的37 個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)中，多態(tài)位點(diǎn)為32 個(gè)，多態(tài)位點(diǎn)比率為86.49%；由POPGEN32 計(jì)算得出，Nei's 指數(shù)為0.2570，Shannon's 指數(shù)為0.3962（表4）。

表4 6 個(gè)ISSR 引物在24 個(gè)紅尾仙女蝦個(gè)體間的擴(kuò)增情況Tab.4 The amplification of 6 ISSR primers in 24 individuals of fair shrimp B.thailandensis

3 討論

3.1 ISSR 反應(yīng)體系建立

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）廣泛分布于真核生物基因組DNA 中，蘊(yùn)含著大量的遺傳信息，ISSR（Inter-simple sequence repeat）引物可選擇性地對(duì)簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)遺傳信息[10,11]。本研究顯示，ISSR 反應(yīng)體系不僅展現(xiàn)了紅尾仙女蝦基因組DNA 微衛(wèi)星的分布特征，也提供了其部分遺傳背景信息。ISSR 技術(shù)多態(tài)性高、成本低、重復(fù)性好，特別是無(wú)需預(yù)先了解研究對(duì)象基因組序列特點(diǎn)即可做出分析，這對(duì)鮮有分子生物學(xué)研究的紅尾仙女蝦，乃至仙女蝦類生物都是一個(gè)很好的選擇。然而，ISSR 是基于PCR 的分子標(biāo)記技術(shù)，易受反應(yīng)體系和條件的影響;不同物種的最適PCR 條件參數(shù)也有一定程度的差異，其擴(kuò)增結(jié)果勢(shì)必受到反應(yīng)體系的DNA 模板、Taq 酶、引物、Mg2+以及退火溫度等因素的影響[15,16]，因此，有必要建立并優(yōu)化ISSR-PCR 的反應(yīng)體系，以保證其分析結(jié)果的特異性、穩(wěn)定性和可靠性。本研究在保證紅尾仙女蝦DNA 模板質(zhì)量的前提下，選取Taq 酶、引物和Mg2+3 個(gè)主要因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)優(yōu)化退火溫度，建立了紅尾仙女蝦ISSR 反應(yīng)體系，為進(jìn)一步開(kāi)展紅尾仙女蝦分子遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

3.2 遺傳多樣性水平

遺傳多樣性是生物多樣性研究的重要內(nèi)容，是物種適應(yīng)多變的環(huán)境條件、維持長(zhǎng)期生存和進(jìn)化的遺傳基礎(chǔ)[17]。平均多態(tài)位點(diǎn)比率是衡量生物群體遺傳多樣性的參數(shù)[18]。本研究中紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體平均多態(tài)位點(diǎn)比率為86.49%，與具有較高遺傳多樣性水平的兩性鹵蟲(chóng)Artemia sinica、平滑真刺水蚤Euchaeta plana、精致真刺水蚤Euchaeta concinna 和萼花臂尾輪蟲(chóng)Brachionus calyciflorus 的野生群體ISSR 數(shù)據(jù)[19-23]比較發(fā)現(xiàn)，紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體與兩性鹵蟲(chóng)野生群體處于同一水平，且高于平滑真刺水蚤、精致真刺水蚤和萼花臂尾輪蟲(chóng)的野生群體，揭示紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體遺傳多樣性處于較高水平；Nei's 指數(shù)和Shannon’s 指數(shù)分析比較同樣得出以上結(jié)論。

人工養(yǎng)殖群體受奠基者效應(yīng)、人工選擇以及遺傳漂變等作用，主要是親本近交效應(yīng)、人為選擇壓力和稀有等位基因缺失等因素的影響，致使養(yǎng)殖群體遺傳多樣性比野生群體有不同程度的降低[24,25]。本研究中，雖然紅尾仙女蝦是人工養(yǎng)殖F4代群體，但依然保持著較高的遺傳多樣性水平，究其原因：紅尾仙女蝦是浮游動(dòng)物且初始個(gè)體較小（0.3～0.5 mm），在養(yǎng)殖過(guò)程中其親本基礎(chǔ)群體的數(shù)量均在萬(wàn)級(jí)以上，這在很大程度上降低了瓶頸效應(yīng)和近交衰退的發(fā)生概率；紅尾仙女蝦屬于低等浮游生物，具有較強(qiáng)的生境適應(yīng)和種群恢復(fù)能力，加之所提供的養(yǎng)殖環(huán)境為人工營(yíng)造的較適宜的生境條件，故養(yǎng)殖環(huán)境所產(chǎn)生的人為選擇壓力較小；在人工養(yǎng)殖環(huán)境下，稀有等位基因勢(shì)必出現(xiàn)一定程度的缺失，但所占比例有限，這也是養(yǎng)殖群體種質(zhì)相對(duì)純化的必然趨勢(shì)，但其具體的缺失程度和影響還有待更深入的研究。綜上，紅尾仙女蝦養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性處于較高水平，人工養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)其遺傳多樣性的影響較小，能保證其優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)性狀和豐富的遺傳變異。