高曉茜，雷召雄，唐 林，汪書哲，楊夢麗，馬 云

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021）

牛肉肉質(zhì)鮮美，富含礦物質(zhì)、維生素、多種氨基酸和脂肪酸等營養(yǎng)成分，在人們?nèi)粘Ｉ攀持姓加兄匾匚?。隨著生活水平的提高，消費(fèi)者對高質(zhì)量牛肉需求增加。肌內(nèi)脂肪含量直接影響牛肉品質(zhì)，提高肌內(nèi)脂肪含量，可增加牛肉的大理石花紋，提高肉的嫩度，從而提升肉的色澤和風(fēng)味［1］。前期研究表明，肌內(nèi)脂肪含量除了受環(huán)境和營養(yǎng)水平等因素影響外，更多取決于基因的控制［2］。HoxC9基因（Homeobox C9）作為Hox同源異型盒家族成員之一，可提供細(xì)胞在前后軸上的特定位置識別信息，在脊椎動物胚胎肢體發(fā)育過程中具有重要調(diào)節(jié)作用［3］。發(fā)育基因是脂肪分布和脂肪組織功能的重要調(diào)節(jié)劑，且越來越多的研究證明，HoxC9基因是調(diào)控脂肪組織的重要因子，在白色脂肪組織中特異性表達(dá)［4］。因此，HoxC9基因在脂肪組織形成過程中具有重要功能。目前經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)，各物種的HoxC9基因長度、外顯子數(shù)目、編碼區(qū)長度、表達(dá)區(qū)域都有一定的差異，但關(guān)于牛HoxC9基因的表達(dá)模式以及功能研究尚未見報(bào)導(dǎo)。本研究旨在通過克隆獲得牛HoxC9基因的CDS 區(qū)序列，分析其序列特征，檢測該基因在牛7 種組織中以及脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)水平，為進(jìn)一步揭示其功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于寧夏農(nóng)墾賀蘭山牛羊產(chǎn)業(yè)（集團(tuán)）有限公司采集3 頭成年健康的2 歲干奶期荷斯坦牛心、肝、脾、肺、腎、肌肉和背部脂肪組織，樣品采集方法參見文獻(xiàn)［5］。

1.2 主要試劑

pMD-18T 載體購自Takara（大連）；膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒II 購自O(shè)mega Bio-Tek（廣州）；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基購自?？寺∩锘瘜W(xué)制品（北京）有限公司；胎牛血清購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；IBMX、地塞米松以及羅格列酮均購自Sigma 公司。

1.3 牛HoxC9 基因重組質(zhì)粒構(gòu)建

提取總RNA（組織樣和細(xì)胞樣），酶標(biāo)儀檢測總RNA 的質(zhì)量及濃度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20 ℃冰箱。根據(jù)GenBank（登錄號：XM_002687231.6）上公布的牛HoxC9序列，以肝臟組織cDNA（原液）為模板進(jìn)行基因克隆，擴(kuò)增體系參照文獻(xiàn)［7］，引物信息見表1。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性3 min (95 ℃)，變性30 s (95 ℃)，復(fù)性30 s (59 ℃)，退火54 s(72 ℃)，35 個(gè)循環(huán)，延伸5 min (95 ℃)。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化后連接于pMD18-T 載體，轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，選取陽性菌液送往通用生物系統(tǒng)（安徽）股份有限公司測序。

表1 引物信息Table 1 Primer sequences

1.4 牛HoxC9 基因生物信息學(xué)分析

通過NCBI 中的BLAST 模塊將克隆所得的牛HoxC9基因序列進(jìn)行同源性比對，運(yùn)用在線工具ProtPram (https://web.expasy.or g/protparam/) 分析HoxC9 的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；ProtScal (https://web.expasy.or g/protscale/) 分析蛋白質(zhì)的親疏水性；TMpred (https://embnet.vi-tal-it.ch/software/TMPRED_form.html)預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和跨膜方向；NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測HoxC9中潛在的磷酸化位點(diǎn)；SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 分析HoxC9 蛋白的二級結(jié)構(gòu)；SWISSMODEL (https://www.swissmodel.expasy.or g/)分析HoxC9 蛋白的三級空間構(gòu)型。

1.5 牛HoxC9 組織表達(dá)譜檢測

以組織樣cDNA（原液稀釋10 倍）為模板，以GAPDH 為內(nèi)參基因，利用Touch down PCR 進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)［5］。每個(gè)待測樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，35 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

1.6 原代脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化

脂肪細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、傳代、凍存、誘導(dǎo)分化方法參照文獻(xiàn)［6-7］。

1.7 油紅O 染色

油紅O 染色方法參照文獻(xiàn)［8］。

1.8 牛HoxC9 時(shí)序表達(dá)譜檢測

以GAPDH 為內(nèi)參基因，qPCR 檢測HoxC9以及成脂標(biāo)志基因PPARγ 在脂肪細(xì)胞分化0、2、4、6、8、10 d 時(shí)的表達(dá)水平，反應(yīng)體系同1.5。

1.9 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用2-ΔΔCT法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，SPSS 22.0軟件對HoxC9表達(dá)量進(jìn)行單因素方差（one-way ANOVA）分析、LDS 法多重比較分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛HoxC9 基因克隆

PCR 擴(kuò)增得到牛HoxC9基因預(yù)測長度為968 bp（圖1A），通過測序后分析發(fā)現(xiàn)其CDS 區(qū)長度為783 bp。Chromas 軟件分析測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)均為單一峰。利用DNAMAN 軟件將克隆得到的HoxC9序列與NCBI 已有序列進(jìn)行比對，相似度高達(dá)99.82%（圖1B），表明克隆所獲得序列是牛HoxC9基因CDS 區(qū)。

圖1 牛HoxC9 基因克隆結(jié)果與序列比對Fig.1 Analysis of the cloning results of HoxC9 gene of bovine

2.2 牛HoxC9 蛋白理化性質(zhì)分析

通過與其他物種進(jìn)行同源性比對發(fā)現(xiàn)，牛HoxC9基因在哺乳動物體內(nèi)具有較高同源性，其中與山羊(Capra hircus)同源性最高為99.62%、馬(Equus caballus) 97.83%、 大猩猩(Gorilla gorilla gorilla)97.57%、人類(Homo sapiens)97.57%、兔(Oryctolagus cuniculus) 97.19%、 小鼠(Mus musculus)96.55%。利用BioEdit 軟件分析得知牛HoxC9共編碼260 個(gè)氨基酸（見表2）。ProtScale 在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)組成該基因的氨基酸中親水性殘基占比較大（圖2A）；ProtParam 的分析結(jié)果表明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白，具有一定親水性；TMHMM 2.0 Server v. 分析發(fā)現(xiàn)該基因的編碼產(chǎn)物存在0 個(gè)跨膜螺旋 (TMHs)結(jié)構(gòu)（圖2B）；此外，TMpred 分析結(jié)果表明，HoxC9 蛋白在6 ～754 位氨基酸之間有18 個(gè)由膜內(nèi)向膜外的跨膜氨基酸，在1 ～754 位氨基酸之間有19 個(gè)由膜外向膜內(nèi)的跨膜氨基酸（圖2C）。NetPhos 3.1 Server 預(yù)測HoxC9中存在4 處潛在的磷酸化位點(diǎn), 包括Thr7、Ser8、Tyr19、Tyr23（圖2D）。

表2 HoxC9 的氨基酸組成Table 2 Composition of amino acid of HoxC9

圖2 牛HoxC9 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析Fig.2 Physicochemical property analysis and prediction of protein structure of bovine HoxC9

2.3 牛HoxC9 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測

SOPMA 預(yù)測發(fā)現(xiàn)牛HoxC9 蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲（Random coil，紫色短豎線區(qū))和α- 螺旋(Alpha helix，藍(lán)色長豎線區(qū))，分別占比65.77%、23.46%；延伸鏈(Extended strand，紅色中豎線區(qū)) 和β- 轉(zhuǎn)角(Beta turn，綠色中豎線區(qū))僅占7.31%、3.46%（圖3A）。進(jìn)一步通過SWISSMOD-EL 預(yù)測HoxC9 的三級結(jié)構(gòu)(圖3B)，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)大部分是由無規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

圖3 牛HoxC9 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.3 Prediction of protein structure of bovine HoxC9

2.3 消化法分離培養(yǎng)牛原代脂肪細(xì)胞

牛原代脂肪細(xì)胞消化分離培養(yǎng)第3 天可觀察到部分脂肪細(xì)胞貼壁（圖4A），培養(yǎng)到第5 天細(xì)胞密度達(dá)到90%以上（圖4B），隨即將細(xì)胞消化傳代，待細(xì)胞密度再次生長至90%以上時(shí)，再次將細(xì)胞消化傳代，部分細(xì)胞用于后續(xù)誘導(dǎo)分化試驗(yàn)，部分細(xì)胞凍存以備后續(xù)使用。

圖4 消化分離法培養(yǎng)牛原代脂肪細(xì)胞Fig.4 Digestion method for culture of bovine primary preadipocytes

2.4 牛原代脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化

油紅O 結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化組（圖5A）相比對照組（圖5B）脂滴增多。PPARγ的表達(dá)量自誘導(dǎo)2 d 起始終高于對照；在第4 天達(dá)到最高，極顯著高于對照組（P＜0.01）；從第6 天開始，PPARγ的表達(dá)量逐漸降低（圖5C）。這表明原代脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化成功，分離的原代細(xì)胞可用后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 牛原代脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化Fig.5 Induced differentiation of bovine preadipocytes

2.5 牛HoxC9 表達(dá)譜檢測

qPCR 技術(shù)檢測結(jié)果顯示，HoxC9在牛背脂中表達(dá)量最高，在背脂、脾中的表達(dá)量極顯著高于肌肉、心、腎、肺、肝（P＜0.01）；在肺中的表達(dá)水平顯著高于肝、腎（P＜0.05）；在肌肉和心表達(dá)量較低，且兩者之間存在極顯著差異（P＜0.01）（圖6A）。以0 d 為對照，通過qPCR 檢測HoxC9在牛前體脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，HoxC9與PPARγ的表達(dá)模式一致，呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。HoxC9的表達(dá)量在第4 天時(shí)顯著高于對照（P＜0.05）；從第6天開始，HoxC9的表達(dá)量逐漸降低，第8 天時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低，顯著低于對照（P＜0.05）（圖6B）。

圖6 HoxC9 在牛組織（A）和牛原代脂肪細(xì)胞分化過程（B）中的表達(dá)情況Fig.6 Expression of HoxC9 in tissues and preadipocyte differentiation of bovine

3 討論與結(jié)論

同源異型盒（homeobox，HOX）基因家族是一個(gè)廣泛存在于各種真核生物體、在進(jìn)化上高度保守的家族，所表達(dá)的蛋白是一組轉(zhuǎn)錄因子［9］，參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移和細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞生物學(xué)過程的調(diào)控［10-12］。牛HoxC9 的氨基酸中親水性殘基占比較大，共有37 個(gè)跨膜氨基酸，存在4 處潛在的磷酸化位點(diǎn)。研究報(bào)道，大部分蛋白可通過磷酸化與去磷酸化的方式來實(shí)現(xiàn)核質(zhì)穿梭等亞細(xì)胞定位的改變［13］，因此HoxC9 蛋白是一種能核質(zhì)轉(zhuǎn)位的親水性蛋白。牛HoxC9 具有3 個(gè)螺旋和3個(gè)轉(zhuǎn)角，形成了螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)功能區(qū)域。研究表明，Hox基因家族每個(gè)成員都具有一個(gè)由61個(gè)氨基酸組成的同源結(jié)構(gòu)域，即HTH 功能區(qū)域，HTH 結(jié)構(gòu)域與DNA 特異核苷酸序列相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)基因?qū)ο掠伟谢虻恼{(diào)控［14］。通過與其他物種同源性比對發(fā)現(xiàn)，牛HoxC9與山羊、小鼠等哺乳類動物的同源性高達(dá)96%以上，如果蛋白質(zhì)功能類似，那么可以將小鼠作為模式動物，進(jìn)一步探索HoxC9在脂肪代謝中的調(diào)控作用。

研究發(fā)現(xiàn)，HoxC9在腹股溝、腋下等皮下白色脂肪及附睪旁、腸系膜周圍、腎周等內(nèi)臟白色脂肪中高表達(dá)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)HoxC9在牛背脂中的表達(dá)量相比其他組織最高，這與現(xiàn)有研究結(jié)果一致。此外，通過將低脂飲食（CD）和高脂飲食（HFD）條件下的雄性、雌性ATHoxC9-/-小鼠（Fabp4-Cre介導(dǎo)的HoxC9敲除小鼠）與同窩仔對照研究發(fā)現(xiàn)，HoxC9的表達(dá)量與體脂變化成正相關(guān)［17］；運(yùn)動訓(xùn)練后，HoxC9表達(dá)量隨體脂的減少而降低［18］。值得注意的是，隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間的推移，HoxC9的表達(dá)量在第4 天達(dá)到最高，第8 天時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低且顯著低于0 d。雖然HoxC9與PPARγ的表達(dá)模式均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，但自誘導(dǎo)2 d 后，PPARγ的表達(dá)量始終高于0 d?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，在采用corylin 誘導(dǎo)白色脂肪褐變過程中，HoxC9表達(dá)量顯著升高［19］；有研究報(bào)道，將處于寒冷工作環(huán)境的健康礦工與生活在熱中性條件下的健康受試者進(jìn)行比較，前者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)中HoxC9的表達(dá)量顯著高于后者［20］。因此推測本研究中所存在的HoxC9與PPARγ表達(dá)模式的差異，可能是由于環(huán)境因素的影響使牛背脂在誘導(dǎo)分化過程中發(fā)生了褐變。HoxC9在白色脂肪的生成與分化中有特定的功能，但作用機(jī)制仍不明確。

本研究成功克隆牛HoxC9基因 CDS 序列(GenBank 登錄號：XM_002687231)，長度為783 bp，編碼260 個(gè)氨基酸。利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn) HoxC9蛋白是一種可發(fā)生核質(zhì)穿梭、磷酸化/去磷酸化的親水性蛋白。HoxC9基因的表達(dá)量在牛背脂中較高，在脂肪細(xì)胞分化過程中呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢。本研究提示HoxC9基因可能參與脂肪的生成與分化過程，結(jié)果可為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)資料。