白少川，李 楠，王德賀，葛琳涵，郭艷麗，樊寶良，李蘭會

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定 071001）

Sevebrovsky［1］在1922 年首次提出雛雞主翼羽與覆主翼羽生長速度不同形成的快羽和慢羽表型為伴性性狀，受1 對等位基因K 和k+控制，并且慢羽對快羽為不完全顯性［2］。羽型被廣泛應(yīng)用到雞配套系生產(chǎn)的商品代性別鑒定上，且不存在顯性白基因的上位效應(yīng)，使之應(yīng)用比羽色更廣［3］。在核心育種群中需要純合快慢羽雞，其中母雞的表型直接反映了基因型，而純合公雞ZKZK或雜合公雞ZKZk+均表現(xiàn)為慢羽。無論是建立專門的品系還是血統(tǒng)純化過程中，純合慢羽公雞的選擇，都是必不可少的。近年來，國內(nèi)地方品種相繼建立羽型自別雌雄的配套系生產(chǎn)，但不同品種雞的羽型對生產(chǎn)性能的效應(yīng)有一定差異［4-5］。

慢羽K 基因具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)［6-7］，該區(qū)域不僅包含k+ 位點(diǎn)中分別位于Z 染色體（NC_006127.5）的催乳素受體基因（PRLR）和精子鞭毛2 基因（SPEF2），還存在由于同源重組形成的部分重復(fù)基因dPRLR和dSPEF2。張秀玲［8］利用重復(fù)基因的斷裂連接點(diǎn)建立了慢羽公雞羽型基因型的半定量PCR 檢測方法。Iraqi 等［9］和Elferink等［6］分別通過Southern blot 和定量PCR 認(rèn)為K基因有180 kb 的串聯(lián)重復(fù)序列，但慢羽PRLR、SPEF2、dPRLR和dSPEF2等4 個基因的排列構(gòu)成未見試驗(yàn)報道。PRLR和SPEF2基因5'末端以“頭碰頭”形式連接，并有長477 bp 的共有區(qū)域；dPRLR與dSPEF2的3'末端“尾對尾”連接形成融合基因，推斷4 個基因的排列構(gòu)成。融合基因由SPEF2內(nèi)含子4 的1 546 bp 處與PRLR第12 外顯子的578 bp 處連接形成。Zhao 等［10］發(fā)現(xiàn)融合基因具有雙向轉(zhuǎn)錄特征。Ayako 等［11］發(fā)現(xiàn)dSPEF2基因的多個轉(zhuǎn)錄本，其4 個新的外顯子位于dPRLR反義鏈的內(nèi)含子區(qū)；dPRLR基因3'末端的4 個polyA 位于dSPEF2反義鏈的內(nèi)含子區(qū)。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)動植物基因組中很多基因同時存在正義轉(zhuǎn)錄本和反義轉(zhuǎn)錄本［12-14］。反義轉(zhuǎn)錄物參與早期胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞增殖與遷移［15］，以及癌變調(diào)控［16-18］。由于反義轉(zhuǎn)錄物可與互補(bǔ)的正義鏈形成雙鏈RNA，導(dǎo)致RNA 干擾、RNA 編輯或RNA 掩蔽［19］，對鄰近基因的表達(dá)產(chǎn)生影響［20］。

本試驗(yàn)通過半定量PCR 檢測PRLR和SPEF2基因5'末端共有區(qū)域477 bp 片段拷貝數(shù)，明確慢羽K位點(diǎn)基因的連接方式；通過特異性反轉(zhuǎn)錄確定共有區(qū)域477 bp 片段和融合基因的轉(zhuǎn)錄特征，以期為深入挖掘慢羽雞K 基因的分子結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

18 胚齡和19 胚齡太行雞胚毛囊、肝臟均采集于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)孵化室；Trans2K? Plus DNA Marker、TransFast? Taq DNA Polymerase 為北京全式金公司產(chǎn)品；Super GelRed 和2xES Taq MasterMix(Dye)為保定康為世紀(jì)公司產(chǎn)品；pMD? 19-T Vector Cloning Kit和S1 Nuclease 為大連寶生物公司產(chǎn)品，引物合成及測序由蘇州金唯智公司完成。

1.2 RNA 和DNA 提取及cDNA 合成

使用TransZol Up（北京全式金）提取太行雞毛囊總RNA，EasyPure? Genomic DNA Kit（北京全式金）提取太行雞肝臟DNA，電泳檢測提取DNA 和RNA 的完整性，調(diào)整DNA 和RNA 濃度分別為50和1 000 ng/μL； 使用TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒（北京全式金）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3 引物設(shè)計和PCR 反應(yīng)

NCBI 下載ev21全長序列（KY235336.1），利用Primer Premier 5.0 設(shè)計引物659-S 和659-A 檢測樣品ev21陰陽性。參考杜小龍［21］研究結(jié)果合成477-A 和477-S 引物擴(kuò)增PRLR和SPEF2的5'共有區(qū)域，以半定量PCR 方法明確PRLR和SPEF2基因連接方式。參考張樂超［22］融合基因（fusion）和SPEF2基因檢測引物，檢測其轉(zhuǎn)錄。

PCR 反應(yīng)體系：2×ES Taq MasterMix(Dye) 5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)齊10 μL。PCR 反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 30 s，各自退火溫度退火30 s，延伸72 ℃ 40 s，35 個循環(huán)（除半定量PCR 24 個循環(huán)），終延伸72 ℃10 min，4 ℃保存。樣品羽型和性別檢測參考張秀玲［8］和胡銳穎［23］的檢測方法。試驗(yàn)用引物信息見表1。

表1 試驗(yàn)用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.4 PRLR 和SPEF2 基因連接方式及共有區(qū)域轉(zhuǎn)錄方向

1.4.1PRLR和SPEF2基因共有區(qū)域拷貝數(shù)檢測半定量PCR 擴(kuò)增太行雞PRLR與SPEF25'共有區(qū)域。反應(yīng)體系為Mix 5 μL，477-S、477-A 各0.3 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足10 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，24 個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，ImageJ 軟件分析目的條帶灰度值。

1.4.2PRLR和SPEF2基因共有區(qū)域轉(zhuǎn)錄方向檢測利用477-S 和477-A 特異引物分別對RNA 反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA 稀釋20 倍。以此cDNA 為模板依照1.4.1 的PCR 條件和體系進(jìn)行35 個循環(huán)的擴(kuò)增，檢測PRLR和SPEF2共有區(qū)域轉(zhuǎn)錄方向。將目的條帶純化回收與pMDTM19-T 載體連接。構(gòu)建好的載體進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，菌液送金唯智公司測序，明確轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

1.5 Fusion 基因的轉(zhuǎn)錄方向的檢測

分別以Fusion-S 和Fusion-A 進(jìn)行為引物進(jìn)行特異性反轉(zhuǎn)錄，將得到的cDNA 為模板用雙引物擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠檢測PCR 結(jié)果，檢測FUSION基因是否雙向轉(zhuǎn)錄；將目的片段純化回收并連接測序，明確擴(kuò)增產(chǎn)物是否為目標(biāo)基因序列。

同樣進(jìn)行引物SPEF2-S 和SPEF2-A 以及659-S和659-A 的特異反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR），檢測SPEF2和ev21基因的轉(zhuǎn)錄方向，分別作為單向和雙向轉(zhuǎn)錄對照。

1.6 S1 酶切法檢測基因轉(zhuǎn)錄方向

以通用引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將cDNA 產(chǎn)物進(jìn)行S1 核酸酶酶切，酶切體系：cDNA 1 μg，10×S1 buffer 2 μL，S1 0.06 μL， 滅菌水加到20 μL；酶切溫度23 ℃，時間為20 min。另外，取10 μL 酶切產(chǎn)物加入0.5 mL/L EDTA。將cDNA、酶切產(chǎn)物和加EDTA 產(chǎn)物分別為模板進(jìn)行SPEF2特異性RTPCR。設(shè)置3 組通用引物反轉(zhuǎn)錄cDNA 的S1 用量和酶切時間：0.06 μL S1，酶切20 min；0.10 μL S1，酶切20 min；0.06 μL S1，酶切30 min，然后以ev21和fusion 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分析S1 酶切檢測轉(zhuǎn)錄方向的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRLR 和SPEF2 基因連接方式及共有區(qū)域轉(zhuǎn)錄方向鑒定

2.1.1PRLR和SPEF2基因共有區(qū)域拷貝數(shù)檢測對PRLR與SPEF2共有區(qū)域477 bp 片段進(jìn)行半定量PCR 擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果如圖1 所示擴(kuò)增條帶單一清晰，無拖尾現(xiàn)象。純合慢羽公雞（7和8 泳道）、雜合慢羽公雞（1 和2 泳道）、快羽公雞（3 泳道）、慢羽母雞（4 泳道）和快羽母雞（5和6 泳道）的條帶亮度存在差異。

圖1 PRLR 和SPEF2 基因共有區(qū)域半定量PCR 凝膠檢測Fig.1 Semi-quantitative PCR gel detection of shared region for PRLR and SPEF2 gene

試驗(yàn)共檢測31 只純合慢羽公雞、34 只雜合慢羽公雞、35 只慢羽母雞、28 只快羽公雞和33 只快羽母雞的477 bp 電泳條帶灰度值，得到5 種類型雞的灰度比值依次為2.5∶2.0∶1.6∶1.6∶1（見表2）。

表2 PRLR 和SPEF2 基因共有區(qū)域477 bp 灰度值Table 2 Gray value of 477 bp in PRLR and SPEF2 common region

2.1.2PRLR和SPEF2基因共有區(qū)域轉(zhuǎn)錄方向檢測分別以477-S 和477-A 引物進(jìn)行特異性RT-PCR，結(jié)果如圖2 所示：泳道1 和2 分別是以477-S 和477-A 特異反轉(zhuǎn)錄cDNA 的PCR 產(chǎn)物。回收純化擴(kuò)增條帶，連接測序，發(fā)現(xiàn)477-S 特異反轉(zhuǎn)錄cDNA的PCR 產(chǎn)物與目的序列完全一致，而477-A 的PCR主要擴(kuò)增產(chǎn)物為非特異擴(kuò)增。

圖2 477 bp 特異性反轉(zhuǎn)錄的PCR 產(chǎn)物凝膠檢測Fig.2 Gel assay of PCR product for 477 bp from specific reverse transcription

2.2 Fusion 基因轉(zhuǎn)錄方向的檢測

Fusion-S 和Fusion-A 特異反轉(zhuǎn)錄融合基因的PCR 產(chǎn)物（圖3A）可見清晰單一條帶；659-S 和659-A 特異反轉(zhuǎn)錄ev21 的PCR 產(chǎn)物（圖3B），條帶單一，雙向均有目的產(chǎn)物；SPEF-S 和SPEF-A 特異反轉(zhuǎn)錄SPEF2 產(chǎn)物（圖3C），可見2 條單一條帶。

圖3 特異反轉(zhuǎn)錄的PCR 凝膠檢測Fig.3 Gel assays of PCR for specific reverse transcription

對fusion、ev21 和SPEF2的擴(kuò)增條帶克隆測序。fusion測序結(jié)果比對（圖4）顯示，上下游引物各自的特異RT-PCR 擴(kuò)增獲得的片段與目的序列完全一致，說明fusion基因?yàn)殡p向轉(zhuǎn)錄。

ev21 的雙向特異RT-PCR 產(chǎn)物序列比對發(fā)現(xiàn)上下游引物的特異轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在SNP 位點(diǎn)。SPEF2的產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)SPEF-A 的RT-PCR 產(chǎn)物序列與原序列完全匹配，而SPEF-S 的RT-PCR 產(chǎn)物為非特異擴(kuò)增。

圖4 Fusion 特異反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增與原序列比對結(jié)果Fig.4 Sequences comparison of specific RT-PCR for Fusion

2.3 S1 酶切產(chǎn)物PCR 結(jié)果

將通用引物反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行S1 酶切后為模板進(jìn)行SPEF2目的片段擴(kuò)增，結(jié)果見圖5A。1、4、7 和10 泳道為模板cDNA 未經(jīng)處理的擴(kuò)增，可見目的條帶；2、5 和8 泳道為模板經(jīng)0.06 μL S1 酶切20 min 的擴(kuò)增，有目的條帶；3、6 和9 泳道為模板加EDTA 抑制劑的酶切產(chǎn)物擴(kuò)增，未見目的條帶。

圖5B 為ev21的擴(kuò)增，未經(jīng)處理cDNA 模板（1泳道）、0.06 μL S1 酶切20 min 模板（2 泳道）和0.06 μL S1 酶切30 min（4 泳道）的ev21 均出現(xiàn)目的條帶，而0.10 μL S1 酶切20 min（3 泳道）未出現(xiàn)目的條帶。圖5C 為Fusion 的擴(kuò)增，未經(jīng)處理cDNA 模板（1 泳道）和0.06 μL S1 酶切20 min 模板（2 泳道）出現(xiàn)目的條帶，0.10 μL S1 酶切20 min（3 泳道）和0.06 μL S1 酶切30 min（4 泳道）未出現(xiàn)目的條帶。

圖5 S1 酶切cDNA 模板PCR 擴(kuò)增凝膠檢測Fig.5 Gel detection of PCR of cDNA digested by S1

3 結(jié)論與討論

3.1 PRLR 和SPEF2 基因連接方式及共有區(qū)域轉(zhuǎn)錄方向

雞Z 染色體的PRLR與SPEF2基因“頭碰頭”連接，有477 bp 的共有區(qū)域。如果慢羽雞的dPRLR和dSPEF2重復(fù)基因插入不影響PRLR和SPEF2的連接及其與下游基因連接，那么dPRLR和dSPEF2整合在PRLR和SPEF2內(nèi)部，并且PRLR與dSPEF2以及dPRLR與SPEF2均在5'連接處存在477 bp 共有區(qū)域，因此，慢羽雞Z 染色體上有2 個拷貝的共有區(qū)域。公母雞性染色體分別為ZZ 和ZW 型，所以477 bp 共有區(qū)域在純合慢羽公雞、雜合慢羽公雞、慢羽母雞、快羽公雞和快羽母雞基因組中拷貝數(shù)分別為4、3、2、2 和1。因此，PCR 檢測477 bp 擴(kuò)增條帶灰度值在以上5 種雞的比例理論上為4∶3 ∶2 ∶2 ∶1，檢測結(jié)果為2.5 ∶2.0 ∶1.6 ∶1.6 ∶1。雖然與預(yù)期比例4∶3∶2∶2∶1 存在差異，PCR 的模板起始濃度、擴(kuò)增效率、擴(kuò)增的平臺效應(yīng)以及軟件分析的試驗(yàn)誤差等都對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，但試驗(yàn)結(jié)果一定程度上證明了預(yù)期理論值，可以推斷慢羽K 基因中PRLR和dPRLR反向定位在Z 染色體，分別與dSPEF2和SPEF2的5'末端以“頭碰頭”方式連接。慢羽K 基因分子構(gòu)造特征的明確為深入挖掘其分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

試驗(yàn)進(jìn)一步檢測PRLR和SPEF2基因共有區(qū)域的轉(zhuǎn)錄方向發(fā)現(xiàn)，只有477-S 引物特異RT-PCR 成功獲得目的片段，而477-A 出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，表明該區(qū)域僅在反義鏈的轉(zhuǎn)錄，即PRLR基因有轉(zhuǎn)錄，而SPEF2無轉(zhuǎn)錄。

3.2 Fusion 基因轉(zhuǎn)錄方向

dPPLR由PRLR基因的第1 ～11 外顯子以及第12 外顯子的558 bp 構(gòu)成，SPEF2基因的第1 ～5 外顯子重復(fù)構(gòu)成dSPEF2［6］，dSPEF2和dPPLR的3'末端區(qū)域稱為融合基因Fusion，該末端連接區(qū)域是慢羽K 基因的特異斷裂連接點(diǎn)，為慢羽雞分子檢測的靶點(diǎn)。

本試驗(yàn)對fusion、ev21及SPEF2進(jìn)行特異性RT-PCR，結(jié)果顯示Fusion 和ev21上下游引物分別反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 均可成功擴(kuò)增出目的條帶，且2 個擴(kuò)增產(chǎn)物與原序列一致，說明fusion和ev21均為雙向轉(zhuǎn)錄。這與Zhao 等［10］發(fā)現(xiàn)fusion具有雙向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一致，但尚需RACE 試驗(yàn)進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)特征。由于雙鏈RNA 可能形成RNA 干擾，即雙鏈RNA 誘發(fā)同源mRNA 高效特異性降解［24］。據(jù)此猜測fusion 可能影響PRLR和SPEF2的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響羽型，但是具體調(diào)控機(jī)制還需后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

戴振清［25］發(fā)現(xiàn)ev1的反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物lnc-ALVE1-AS1 在禽白血病病毒抗性品系雞中的表達(dá)高于易感品系，與ev1序列高度相似的ev21整合在PRLR基因內(nèi)含子中，可能存在相似的反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物參與抗禽白血病病毒感染過程。以SPEF-A 進(jìn)行特異性反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲得產(chǎn)物與SPEF2原序列完全匹配，而SPEF-S 由于上游引物出現(xiàn)錯配導(dǎo)致產(chǎn)生非特異擴(kuò)增，說明SPEF2為單向轉(zhuǎn)錄。通過以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，特異性反轉(zhuǎn)錄因引物設(shè)計容易出現(xiàn)假陽性，還需后續(xù)測序比對，才能準(zhǔn)確鑒定基因的轉(zhuǎn)錄方向。

3.3 酶切法檢測基因轉(zhuǎn)錄方向

S1 核酸酶是單鏈特異的核酸內(nèi)切酶，在最適環(huán)境下，能將單鏈核酸或雙鏈核酸中的單鏈部分降解成為可溶性5'-單核苷酸，但對雙鏈核酸相對不敏感［26］。本試驗(yàn)以3 種方式處理的cDNA 為模板（空白對照、S1 酶切處理和酶切后添加EDTA 抑制劑）擴(kuò)增SPEF2，證明S1 酶切檢測轉(zhuǎn)錄方向的可行性。結(jié)果顯示S1 處理與否均能擴(kuò)增出目的條帶，說明S1 酶切cDNA 并未將單向轉(zhuǎn)錄的SPEF2轉(zhuǎn)錄本降解，SPEF-S 引物非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物與特異性產(chǎn)物可能形成部分雙鏈，導(dǎo)致S1 酶切沒有降解單向轉(zhuǎn)錄的SPEF2轉(zhuǎn)錄本。EDTA 處理的cDNA 均未擴(kuò)增出條帶，由于EDTA 螯合了反應(yīng)體系中的Mg2+，不僅抑制了S1 核酸酶的活性，也抑制了PCR 擴(kuò)增的Taq酶的活性。調(diào)整酶量和酶切時間進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示酶量及酶切時間對試驗(yàn)結(jié)果有較大影響，S1核酸酶過量也會水解雙鏈RNA；S1 酶切30 min 造成酶切結(jié)果的不穩(wěn)定性。表明通過S1 核酸酶酶切來判斷基因轉(zhuǎn)錄方向有很大的局限性。

本試驗(yàn)通過半定量PCR 明確了雞慢羽K 基因中PRLR和dPRLR反向定位在Z 染色體上，分別與dSPEF2和SPEF2的5' 末端以“頭碰頭”方式連接；通過特異性反轉(zhuǎn)錄證明了PRLR和SPEF2的5'端共有區(qū)域只有PRLR發(fā)生轉(zhuǎn)錄，以及dPRLR和dSPEF2的“尾對尾”3'末端為雙向共轉(zhuǎn)錄；另外，發(fā)現(xiàn)S1 核酸酶酶切法驗(yàn)證基因轉(zhuǎn)錄方向存在局限性。本研究為深入探究慢羽雞K 基因的分子結(jié)構(gòu)特征、挖掘其功能調(diào)控提供理論參考。