王旭東，趙宏宇 ，邸 琳，劉新宇，張鳳清,

（1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130012；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長春 130012）

骨質(zhì)疏松是由于骨質(zhì)流失、骨密度降低、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化導(dǎo)致骨的脆性增高及負鈣平衡的一種全身骨病[1]。骨質(zhì)疏松表現(xiàn)為骨骼疼痛、易于骨折[2]。骨密度是反映骨質(zhì)量的一個重要標志，可以反映骨質(zhì)疏松程度[3]。中國大陸地區(qū)40 歲以上中老年人群中骨質(zhì)疏松的患病率約為24.6%，并且骨質(zhì)疏松對患者的生命質(zhì)量影響極大[4]。因此，研究一款增加骨密度的保健食品具有非常重要的意義。

在中醫(yī)理論中，鹿骨具有補虛羸，強筋骨等功效[5]。淫羊藿，性辛甘而溫，具有補腎陽，強筋骨，祛風(fēng)濕作用[6]。骨碎補，性溫而補，具有補腎強骨、續(xù)傷鎮(zhèn)痛功效[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，氨基葡萄糖鹽酸鹽具有良好的生物和化學(xué)穩(wěn)定性、提升補鈣效果[8]。硫酸軟骨素具有穩(wěn)定軟骨基質(zhì)，保護軟骨作用，促進新的軟骨組織的形成，降低軟骨面的退變[9]。碳酸鈣可提供骨生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，減少骨中鈣質(zhì)沉積[10]?；谶@些科學(xué)理論，實驗室擬開發(fā)一種可以增加骨密度的保健食品，將具有增加骨密度的中藥材和骨營養(yǎng)劑聯(lián)合使用，探討淫羊藿骨碎補鹿骨粉聯(lián)合骨營養(yǎng)劑對增加骨密度功能的影響，為增加骨密度、改善骨質(zhì)疏松癥功能的保健食品或藥品提供了重要的實驗依據(jù)。

本實驗將淫羊藿和骨碎補進行水提，濃縮干燥制成淫羊藿骨碎補提取物，測定淫羊藿骨碎補提取物中主要功效成分的含量。以去卵巢所致骨質(zhì)疏松大鼠為研究對象，在服用各自受試物12 周后，測定各組大鼠股骨密度和骨鈣含量并進行股骨病理學(xué)檢查。觀測中藥組、營養(yǎng)劑組和復(fù)方組能否具有增加骨密度、改善骨質(zhì)疏松的功效，進一步對比復(fù)方組與中藥組和營養(yǎng)劑組的效果，以期為骨質(zhì)疏松癥相關(guān)保健食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級SD雌性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，48 只，動物及飼料 長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，實驗動物許可證號：SCXK（吉）-2018-0007，由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物倫理委員會審核通過，符合實驗動物倫理委員會規(guī)定；淫羊藿 安國市安興中藥有限公司，批號：190301；骨碎補 河北國松堂制藥有限公司，批號：318 080001；鹿骨粉 長春世鹿鹿業(yè)有限公司，批號：20 180512；氨基葡萄糖鹽酸鹽浙江金殼藥業(yè)有限公司，批號：M-AT-1 904020；硫酸軟骨素 嘉興恒杰生物制藥有限公司，批號：HS1 904270；碳酸鈣 南通勵成生物工程有限公司，批號：20 190115；蘆丁標準品（批號：100080-201811）、淫羊藿苷標準品（批號：110737-201516）中國食品藥品檢定研究院；注射用青霉素鈉 華北制藥股份有限公司，批號：F9 027101；戊酸雌二醇片DELPHARMLilleS.A.S，批號：469A。

HHS型水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KFL-400 純水機 凱弗隆科技有限公司；KP5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-5500PC紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；YP10001 大鼠秤 上海佑科儀器儀表有限公司；XTL-340E體式顯微鏡 上海長方光學(xué)儀器有限公司；Ultra Focus雙能X射線小動物骨密度儀 美國Faxitron公司產(chǎn)品；1100 型高效液相色譜儀，配有自動進樣器、四元泵、柱溫箱、脫氣機和二極管陣列檢測器 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 淫羊藿骨碎補提取物的制備 在預(yù)實驗中，分別以料液比、提取次數(shù)和提取時間為考察因素，設(shè)計三因素三水平試驗，得出最優(yōu)工藝為料液比1:14，提取次數(shù)3 次，提取時間為1.5 h。取淫羊藿和骨碎補各900 g，加入14 倍量的水，25 ℃預(yù)浸30 min，水提3 次，每次提取1.5 h，合并濾液，濃縮干燥，粉碎，得淫羊藿骨碎補提取物，出膏率為17.3%。

1.2.2 淫羊藿骨碎補提取物中淫羊藿苷和總黃酮含量測定

1.2.2.1 淫羊藿苷的含量測定 對照品溶液的制備：精密稱取淫羊藿苷標品適量，用甲醇溶解并配制成0.1 mg/mL的對照品溶液，備用。

樣品溶液的制備：取1.2.1 中的提取物粉末0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇40 mL，稱定重量，超聲處理1 h（溫度為25 ℃），冷卻至室溫，用稀乙醇補足重量，取續(xù)濾液，備用。

樣品測定：利用高效液相色譜對淫羊藿苷進行檢測，流動相為乙腈:水（30:70），檢測波長為270 nm，柱溫為30 ℃，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL[11]。

1.2.2.2 總黃酮的含量測定 蘆丁標準溶液的制備：精密稱取蘆丁標品適量，加甲醇制成每1 mL含蘆丁150 μg的溶液，備用。

標準曲線繪制：準確吸取蘆丁標準溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL相當于蘆丁0、75、150、300、450、600 μg移入10 mL比色管中，加入30%乙醇定容至5 mL，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，振搖后放置5 min，加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置6 min，加1.0 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，用30%乙醇定容至刻度，以零度管為空白，搖勻后用1 cm的比色杯，在510 nm處測定吸光值，繪制蘆丁含量（μg）與吸光值（A）的標準曲線。

樣品處理：稱取1.2.1 中的提取物粉末1 g，用濾紙包緊，置于平底燒瓶中，加入100 mL 70%乙醇溶液，浸潤后，在80 ℃水浴下回流2 h，洗滌濾渣，合并濾液。在50 ℃下減壓蒸餾，直至燒瓶內(nèi)無醇味，倒出溶液，并用熱水洗滌燒瓶，合并溶液，以75 mL氯仿分3 次萃取脫脂，待完全分層后，收集各次下層水溶液，于50 mL容量瓶定容。吸取上述水溶液2 mL，沿聚酰胺樹脂層析柱慢慢滴入，靜置10 min，待測液被充分吸附后，用70%乙醇洗脫，流速為1 mL/min，至流出液基本無色，收集于20 mL容量瓶，定容后用于測定。

樣品測定：利用紫外分光光度計測定總黃酮，取1 mL待測液按標準曲線制備操作步驟于510 nm處進行吸光度的測定[12]。

1.2.3 動物去勢模型制備及分組給藥 48 只SD雌性大鼠，選40 只進行雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)，以戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，肋骨下沿至骨盆上沿位置除毛備皮，碘伏消毒，在距離肋骨下沿2 cm，距離脊柱2 cm的脊柱兩側(cè)，分別切開1 cm大小皮膚層切口，從皮膚切口下操作，切開小于1 cm的腹腔壁肌肉層切口，切口視野達到腹腔，拉出卵巢脂肪團，結(jié)扎卵巢與子宮連接部，摘除雙側(cè)卵巢，腹腔壁肌肉層和皮膚層分層縫合，消毒傷口。其余8 只作為假手術(shù)組，大鼠按照去勢手術(shù)方法處理，但保留雙側(cè)卵巢，僅切除部分脂肪。術(shù)后及連續(xù)3 d，肌注青霉素（4×104U/kg），以防感染。術(shù)后3 d，將40 只雌性SD大鼠隨機分為5 組：模型組、陽性藥組、中藥組、營養(yǎng)劑組、復(fù)方組。

將各組藥物分別灌胃，大鼠的灌胃劑量為人體推薦量的10 倍（人體質(zhì)量以60 kg計），陽性藥組灌胃劑量為戊酸雌二醇片1.0 mg/kg·bw；中藥組的灌胃藥物劑量為淫羊藿骨碎補提取物0.17 g/kg·bw，鹿骨粉0.08 g/kg·bw；營養(yǎng)劑組灌胃藥物劑量為氨基葡萄糖鹽酸鹽0.17 g/kg·bw，硫酸軟骨素0.08 g/kg·bw，碳酸鈣0.17 g/kg·bw；復(fù)方組灌胃藥物劑量為淫羊藿骨碎補提取物0.17 g/kg·bw，鹿骨粉0.08 g/kg·bw，氨基葡萄糖鹽酸鹽0.17 g/kg·bw，硫酸軟骨素0.08 g/kg·bw，碳酸鈣0.17 g/kg·bw。假手術(shù)組和模型組大鼠經(jīng)口給予0.5%羧甲基纖維素溶液，受試樣品均用0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液配制。灌胃溶液的體積均為10 mL/kg·bw，1 次/d，連續(xù)灌胃12 周，每周稱量體重并按體重調(diào)整灌胃量。

1.2.4 動物處理及測定指標

1.2.4.1 動物處理 大鼠末次灌胃1 h后以10%水合氯醛溶液3 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血后處死大鼠，取出雙側(cè)股骨，其中左側(cè)股骨用于骨密度測定，之后于105 ℃干至恒重，精密稱重，記錄數(shù)值，用于骨鈣測定，右側(cè)股骨用于骨組織病理學(xué)檢查。

1.2.4.2 骨密度測定 將左側(cè)股骨擺放在生物學(xué)X射線小動物骨密度儀的吸收測量平臺上，直接掃描左側(cè)股骨骨密度。

1.2.4.3 骨鈣測定 大鼠左側(cè)股骨灰化，然后加酸消化，用EDTA滴定法測骨鈣含量。

1.2.4.4 骨組織病理學(xué)檢查 病理組織學(xué)檢查，剝離大鼠右側(cè)股骨迅速放入10%福爾馬林固定，氯化鋁法脫鈣，石蠟包埋、切片，HE染色，茜素紅S染色光鏡觀察。

觀察指標：HE觀察指標：骨皮質(zhì)（增厚、變薄、疏松），骨小梁（減少、變細、疏松、斷裂），軟骨退變及其他改變；茜素紅S染色觀察指標：鈣質(zhì)沉積呈橘紅色，其它呈復(fù)染色（淡綠）。

評分標準：

a：“0”分表示HE染色結(jié)果基本正常，或是茜素紅S染色陰性；

b：“1”分表示HE染色結(jié)果偶見輕微病變，或是茜素紅S染色疑似陽性；

c：“2”分表示HE染色結(jié)果輕度病變，或是茜素紅S染色弱陽性，范圍≤1/4 視野；

d：“3”分表示HE染色結(jié)果中度病變，或是茜素紅S染色中等陽性，范圍≤1/2 視野；

e：“4”分表示HE染色結(jié)果重度病變，或是茜素紅S染色強陽性，病變范圍≥3/4 視野；

f：如觀察結(jié)果在“0～1”之間，則可記為“0.5”分，依次類推。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0 作圖，采用SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)分析，各數(shù)值用均數(shù)X±S表示。組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿骨碎補提取物中的淫羊藿苷、總黃酮含量測定結(jié)果

經(jīng)1.2.2.1 中的方法檢測淫羊藿苷的含量，以淫羊藿苷含量（mg/mL）與峰面積的標準曲線為y=11389x?37.65，R2=0.9994，淫羊藿苷含量為0.78%，淫羊藿苷對照品和淫羊藿骨碎補提取物的色譜圖如圖1 所示；經(jīng)1.2.2.2 中的方法檢測總黃酮的含量，以蘆丁含量（mg/mL）與吸光值（A）的標準曲線為y=11.887x+0.0015，R2=0.9993，總黃酮的含量為4.38%。

圖1 淫羊藿苷對照品（a）和淫羊藿骨碎補提取物（b）色譜圖Fig.1 Chromatograms of icariin reference substance (a) and Epimedium Rhizoma Drynariae extract (b)

2.2 各組藥物對大鼠體重的影響

由表1 可知，各組大鼠初始體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），模型組從第4 周開始，體重均顯著高于假手術(shù)組（P<0.01），大鼠體重異常改變的原因可能是由于卵巢被切除后雌激素合成迅速減少，從而引起激素水平紊亂。雌激素可抑制脂肪的合成代謝，因此雌激素水平降低后出現(xiàn)脂肪沉積的現(xiàn)象，進而造成體重增加[13?16]。與模型組相比，陽性藥組的每周體重和體重增重均顯著降低（P<0.01 或P<0.05）；與模型組相比，中藥組和復(fù)方組的體重增重均顯著增加（P<0.05），表明包含中藥材的受試物可能對于大鼠體重增加有一定影響。

表1 各組藥物對大鼠體重的影響Table 1 Effect of each group of drugs on the body weight of rats

2.3 各組藥物對大鼠股骨干重/體重、骨密度、骨鈣含量的影響

由表2 可知，與假手術(shù)組相比，模型組的股骨干重/體重、骨密度、骨鈣含量均極顯著降低（P<0.01），即大鼠骨密度低下模型造模成功；與模型組相比，陽性藥組的股骨干重/體重極顯著增加（P<0.01），骨密度和骨鈣含量顯著增加（P<0.05），表示陽性藥組藥物有效；與模型組相比，中藥組、營養(yǎng)劑組的骨鈣含量和骨密度未見顯著性差異（P>0.05），復(fù)方組中骨鈣含量和骨密度值均有顯著增加（P<0.05）；與模型組相比，其他組的股骨干重、股骨干重/體重均未見明顯差異（P>0.05），結(jié)果表明復(fù)方組相較中藥組和營養(yǎng)劑組，效果更加顯著。各組大鼠股骨骨密度掃描圖片見圖2。

圖2 各組大鼠股骨骨密度掃描圖片F(xiàn)ig.2 Scanning pictures of femur bone mineral density of rats in each group

表2 各組藥物對大鼠股骨的重量、骨鈣及骨密度的影響Table 2 Effect of each group of drugs on the weight,bone calcium,and bone density of rat femur

2.4 骨組織病理學(xué)觀察

股骨病理學(xué)檢查結(jié)果見圖3，結(jié)果顯示假手術(shù)組骨小梁分布面積較大，骨小梁連續(xù)、完整，彼此連接，間隔內(nèi)多見造血組織成分分布，少見脂肪成分，骨小梁粗壯，呈網(wǎng)狀分布，鏡下分布數(shù)量多（圖3a）。模型組骨小梁分布面積減少，主要集中在股骨干骺段，多已斷裂，無完整的，切面較細，間隔增加，分布造血組織成分減少，可見脂肪組織增多（圖3b）。與假手術(shù)組比較，模型組骨小梁成分減少，骨小梁稀疏，變細、斷裂，結(jié)構(gòu)紊亂，表明骨質(zhì)疏松造模成功。陽性藥組與模型組比較，骨小梁成分增加，骨小梁稀疏，變細、斷裂的程度減輕（P<0.01），有效減輕了骨質(zhì)疏松的程度，增加了骨小梁成分（圖3c）。中藥組與模型組比較，骨小梁成分有所增加，骨小梁稀疏，變細、斷裂的程度有所減輕，可以減輕骨質(zhì)疏松的程度（圖3d）。營養(yǎng)劑組與模型組比較，骨小梁稀疏，變細、斷裂的程度有所減輕，緩解了骨質(zhì)疏松的程度（圖3e）。復(fù)方組與模型組比較，骨小梁成分增加，骨小梁稀疏，變細、斷裂的程度減輕（P<0.01），有效減輕了骨質(zhì)疏松的程度，增加了骨小梁成分（圖3f）。

圖3 各組藥物對假手術(shù)大鼠、去卵巢大鼠股骨病理學(xué)影響Fig.3 Effect of each group of drugs on pathology of femur in sham-operated rats and ovariectomized rats

茜素紅S染色觀察：鈣質(zhì)沉積呈橘紅色，其它呈復(fù)染色（淡綠）。依據(jù)評分標準，對股骨染色結(jié)果進行評分，統(tǒng)計結(jié)果見表3 與表4。

表3 動物股骨組織常規(guī)染色觀察結(jié)果Table 3 Observation results of routine staining of animal femur tissue

表4 動物股骨組織茜素紅S染色觀察結(jié)果Table 4 Observation of alizarin red S staining in animal femur

3 討論與結(jié)論

常見的骨質(zhì)疏松癥為原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。主要分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（Ⅰ型）和老年性骨質(zhì)疏松癥（Ⅱ型）[17]。其中，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥主要是由于自然絕經(jīng)或卵巢切除后導(dǎo)致體內(nèi)雌激素含量下降而引起骨量丟失的癥狀。雌激素的抗骨吸收作用可能與其抑制成骨細胞凋亡和促進破骨細胞凋亡有關(guān)，但其機制尚未完全清楚[18]。老年性骨質(zhì)疏松癥一般指老人70 歲后發(fā)生的骨質(zhì)疏松，表現(xiàn)為“低轉(zhuǎn)換”型骨質(zhì)疏松，主要是由于老年人骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞方向分化受抑制，成骨細胞分裂增殖緩慢，骨形成因子合成代謝受阻，活性衰退致骨形成期延長，骨形成率降低，同時破骨細胞對骨的吸收增強，使骨重建處于負平衡，骨量丟失[19]。

依中醫(yī)理論，以淫羊藿其補腎陽，益腎精之功而為君藥。以鹿骨主治虛勞骨弱之功作為本方中的臣藥。以骨碎補其補益肝腎，又可活血祛瘀之功為佐使藥。諸藥同用，重在補益腎精，溫壯腎陽，使精血充盈，髓海充盛，骨髓得養(yǎng)，而使筋骨強健。同時，又發(fā)揮其活血祛瘀之能，使之補而不滯，補力更強?？茖W(xué)研究表明，淫羊藿苷是通過促進成骨細胞的生成和活化[20?21]，抑制破骨細胞的形成來緩解骨質(zhì)疏松[22]。淫羊藿總黃酮是通過促進骨組織中OPG mRNA的表達來抑制破骨細胞的分化與成熟，從而治療骨質(zhì)疏松[23]。鹿骨中含有骨膠原、蛋白質(zhì)、軟骨素、磷脂質(zhì)和磷蛋白，利于促進骨形成，促進體內(nèi)膠原蛋白及彈性蛋白的更新，抑制骨吸收，促進軟骨內(nèi)骨化等過程[24]。骨碎補總黃酮通過改善骨質(zhì)疏松的超微結(jié)構(gòu)及脯氨酸羥化程度，從而為骨質(zhì)疏松的防治研究提供思路[25]。

氨基葡萄糖可以通過刺激黏多糖的合成來增加骨鈣的攝取量，提高骨與軟骨組織的吸收和代謝，亦能改善滑膜液的粘稠度。氨基葡萄糖也是蛋白多糖合成的基本物質(zhì)，可以作用于關(guān)節(jié)軟骨，恢復(fù)軟骨細胞的代謝功能，刺激軟骨細胞產(chǎn)生蛋白多糖，也可抑制損傷軟骨的酶如膠原蛋白酶和磷脂酶A2 的活性[26?27]。硫酸軟骨素通過抑制絲裂原活化蛋白激酶p38MAPK和信號調(diào)節(jié)激酶ERK1/2 的活性，降低核轉(zhuǎn)錄因子kappa B的核易位，降低蛋白水解酶、炎癥誘導(dǎo)酶以及促炎細胞因子的合成來發(fā)揮作用[28]。氨基葡萄糖和硫酸軟骨素聯(lián)合作用能促進人關(guān)節(jié)軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白的合成，降低軟骨細胞死亡，保持軟骨細胞外基質(zhì)的合成與分解的代謝平衡[29]。據(jù)報道，硫酸軟骨素、碳酸鈣也具有補充和促進骨鈣吸收的作用[30?31]。因此，通過上述一系列作用機理，氨基葡萄糖和硫酸軟骨素可以保護關(guān)節(jié)軟骨細胞，控制骨質(zhì)疏松癥增加骨密度。

本實驗將具有增加骨密度功效的中藥材和骨營養(yǎng)劑聯(lián)合使用，探討淫羊藿骨碎補鹿骨粉聯(lián)合骨營養(yǎng)劑對增加骨密度功能的影響。是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，選用益腎精、補腎、強筋骨中藥：鹿骨、淫羊藿、骨碎補為根本，配合其他營養(yǎng)物質(zhì)（氨基葡萄糖鹽酸鹽、碳酸鈣），及保護軟骨的硫酸軟骨素組成，起到既治標又治本，促進鈣吸收的組方思路。實驗結(jié)果表明，復(fù)方組具有增加大鼠骨密度和骨鈣含量的作用，與模型組相比，復(fù)方組可以增加骨小梁成分，減輕骨小梁稀疏，變細、斷裂的程度，有效減輕骨質(zhì)疏松的程度，增加骨小梁成分。并且，與復(fù)方組相比，中藥組和營養(yǎng)劑組對于骨小梁成分同樣有所增加，骨小梁稀疏，變細、斷裂的程度同樣有所減輕，但是增加骨密度和骨鈣效果并不顯著，實驗結(jié)果證明復(fù)方組比單用中藥或營養(yǎng)劑效果更加顯著。本研究為增加骨密度、改善骨質(zhì)疏松癥功能的保健食品或藥品提供了重要的理論基礎(chǔ)，并且建議多關(guān)注中醫(yī)理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的結(jié)合。但本實驗所用藥材提取物為粗提物，復(fù)方的具體作用機制還有待于今后從分子水平、體外實驗等進一步闡明。