李亞軍，易 鵲，楊軍衡，鄧小美，梁忠厚,2,

（1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥技術(shù)學(xué)院,湖南衡陽 421005；2.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林學(xué)院,湖南衡陽 421005）

黑老虎（Kadsura coccinea（Lem.））為南五味子屬（KadsuraKaempf.ExJuss.）藤本植物，又稱過山風(fēng)、紅鉆、冷飯團(tuán)等，在我國常見于湖南、海南、江西、廣西等地[1]。黑老虎根、莖及果實具有行氣活血、通經(jīng)止痛等作用，在民間廣泛用于治療關(guān)節(jié)腫痛及婦科疾病等，為苗族及侗族等少數(shù)名族中常用的一味野生藥材[2]。黑老虎含有多種化學(xué)成分，如木脂素[3]、三萜類[4]、黃酮類[5]及甾體類[2]等，除此之外，其果實含有大量微量元素、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[6]。藥理活性研究表明，黑老虎根、莖及果實中的化學(xué)成分具有抗腫瘤[7]、抗氧化[8]、降血脂[9]、抗HIV[10]、保肝[11]等多種生物學(xué)活性。從數(shù)據(jù)分析來看，目前關(guān)于黑老虎成分的研究主要集中在其根、莖及果實[3?11]。近年來，湖南省通道縣通過引種野生黑老虎，并且大面積種植獲得藥食同用的黑老虎果的方式走上了脫貧致富道路。黑老虎仿生態(tài)種植的研究成為熱點[12]，但是黑老虎花卻隨著生長凋謝而浪費。目前關(guān)于黑老虎花中有效成分提取及藥理活性研究未見報道。因此，研究黑老虎花中具有生物活性的天然成分是提高黑老虎不同部位資源利用、減少環(huán)境污染的重要途徑。該方面的研究也能夠輔助并推進(jìn)該藥用植物的栽培、采摘、二次利用等方面的開展，從而促進(jìn)湖南仿生態(tài)藥用資源廢棄物在食品抗氧化劑方面的合理開發(fā)。

黃酮為具有2-苯基色原酮的一大類天然化合物，在植物的花、葉及果實中含量較高[13]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，天然黃酮類化合物具有抗氧化[14]、抗腫瘤[15]、抗炎[16]等作用。超聲提取法具有提取方法簡便、提取溶劑用量少及提取效率高的優(yōu)點，已廣泛用于黃酮類化合物的提取。目前，關(guān)于黑老虎花中黃酮的超聲輔助提取及抗氧化活性的研究未見報道。本研究以高效環(huán)保的超聲輔助提取法為手段，比較不同生長期黑老虎花中總黃酮含量的差異，優(yōu)化最佳提取工藝條件；此外，測試了其抗氧化能力，以期為民間草藥黑老虎的多部位綜合利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑老虎花 分別于4 月份（花蕾期）、6 月份（全開期）采摘于湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院，仿生態(tài)林下種植基地內(nèi)，經(jīng)鑒定為五味子科（Schisandraceae）南五味子屬（Kadsura Jussieu）植物黑老虎（Kadsura coccinea）[1];蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%）上海源葉生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、維生素C、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UC4120 超聲波清洗儀 朗杰超聲儀器有限公司；FA-2004 電子分析天平 賽多利斯公司；R201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司；UV-2600 紫外可見分光光度計 SHIMADZU/島津；CGCG-9160 粉碎機 中山市長柏電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮提取工藝流程 采摘新鮮黑老虎花于太陽下曬1 h，50 ℃下烘干至恒重，粉碎后過60 目篩得黑老虎花粉末。稱取2 g黑老虎花粉末，石油醚脫脂，一定條件下超聲輔助提取，過濾，提取液濃縮后用70%乙醇溶解后定容于100 mL容量瓶中，得樣品溶液。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 根據(jù)NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[17]，電子分析天平稱取20 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，少量溶劑溶解，定容于100 mL容量瓶中。移取0、2、4、6、8、10 mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于6 個50 mL容量瓶中。按順序加入5% NaNO2、10% Al（NO3）3各2 mL，每次加入試劑后搖勻，反應(yīng)6 min；然后再加入20 mL的4% NaOH，70%乙醇定容，搖勻后靜置15 min。在波長為505 nm處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.01205x?0.0010，R2=0.9994。

1.2.3 總黃酮得率測定 取1.2.1 中的樣品溶液2 mL，依照1.2.2 方法測定吸光度，并將結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃酮濃度C（μg/mL）。通過以下公式計算總黃酮提取量（mg/g）：提取量=C×n×V×10?3÷m，式中，V：提取液體積（mL），n：稀釋倍數(shù)，m：黑老虎花粉末質(zhì)量（g）。

1.2.4 采摘花期的確定 比較花蕾期和全開期總黃酮得率差異：按照1.2.1 的方法，在一定超聲頻率下，分別以4 月份（花蕾期）、6 月份（全開期）隨機采收的黑老虎花為原材料，60 ℃、35 min、1∶20 g/mL、60%乙醇進(jìn)行超聲輔助提取，確定最佳采收時間。

1.2.5 單因素實驗 選擇最佳采摘期的黑老虎花為原料，稱取干燥好的黑老虎花粉末2 g，60%乙醇為提取溶劑，料液比為1:20 g/mL，60 ℃下提取35 min?；谝陨显O(shè)置，在其他3 個條件不變的情況下，根據(jù)以下參數(shù)進(jìn)行單因素實驗。超聲時間：15、25、35、45、55 min；料液比：1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL；乙醇濃度：50%、60%、70%、80%、90%；超聲溫度：35、40、50、60、70、80 ℃。

1.2.6 正交試驗 基于單因素實驗情況，正交試驗相關(guān)情況如表1 所示，采用L9（34）正交試驗進(jìn)行優(yōu)化，總黃酮提取率(Y)作為評價指標(biāo)[18]。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.7 抗氧化測試

1.2.7.1 清除DPPH自由基能力 根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法，取最優(yōu)條件下提取的黑老虎花總黃酮濃縮液，稀釋成0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的9 個待測試溶液[19]。準(zhǔn)確量取以上測試溶液 0.6 mL，分別加入一定濃度DPPH溶液2.4 mL，搖勻，反應(yīng)30 min，最大吸收波長處測定吸光度，按照下式計算清除率。該實驗以抗維生素C為參照物。

DPPH自由基清除率（%）=（A對照?A樣品+A空白）÷A對照×100

1.2.7.2 清除ABTS自由基能力 根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法，將最優(yōu)條件下提取的黑老虎花總黃酮濃縮液，稀釋成0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的9 個待測試溶液[20]。量取以上測試溶液，各加入一定濃度ABTS溶液，搖勻，反應(yīng)10 min，最大吸收波長處測定吸光度，按照下式計算清除率。該實驗以抗維生素C為參照物。

ABTS自由基清除率（%）=（A空白?A樣品）÷A空白×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗平行測定3 組，取平均值。采用Microsoft Excel 2016、SPSS 22.0 軟件進(jìn)行繪圖、數(shù)據(jù)處理等。

2 結(jié)果與分析

2.1 采摘花期的確定

由圖1 可知，黑老虎在花蕾期總黃酮提取量為（6.25±0.05）mg/g，全開期總黃酮提取量為（9.97±0.06）mg/g。顯著性分析結(jié)果為P<0.01，表明采收花期對黑老虎花總黃酮得率的影響顯著。當(dāng)黑老虎花全開后，總黃酮得率明顯高于花蕾期。有相關(guān)研究表明，植物中總黃酮含量與植物生長時間有一定的關(guān)系[21]，所以后續(xù)的實驗均以采摘于全開期（6 月份）的黑老虎花為原料。

圖1 黑老虎花不同花期總黃酮提取量測試結(jié)果Fig.1 Results of total flavonoids yield in different florescence of Kadsura coccinea flowers

2.2 單因素實驗

2.2.1 不同超聲時間對提取量的影響 如圖2 所示，在25 min前，黑老虎花總黃酮提取量增加緩慢，25～45 min黃酮提取量大幅上升，在45 min達(dá)到最大值10.63 mg/g；繼續(xù)提取，總黃酮提取量有所降低。短時間內(nèi)提取，隨著時間的增加溶劑的滲透及擴散作用增強，從而導(dǎo)致得率的增加；當(dāng)提取完全后，繼續(xù)加熱可增加雜質(zhì)的溶出率而導(dǎo)致得率下降；其次，加熱提取時間過長，也可能造成黃酮結(jié)構(gòu)的破壞而導(dǎo)致得率下降[22]。因此，優(yōu)化實驗范圍為35、45、55 min。

圖2 不同超聲時間對黑老虎花總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids from Kadsura coccinea flowers

2.2.2 不同乙醇濃度對提取量的影響 如圖3 所示，在乙醇濃度低于80%，隨著乙醇濃度的增加，黑老虎花總黃酮提取量逐漸上升，在80%時得率最大為14.25 mg/g；當(dāng)乙醇濃度大于80%后，提取量大幅下降。該現(xiàn)象可能是由于黑老虎花中的黃酮類大多以苷的形式存在，極性與80%的乙醇相似，所以在80%乙醇中溶解度最大[23]。當(dāng)乙醇濃度再增大時，原料中總黃酮的溶解度下降，而其他極性較大雜質(zhì)溶出量增大，從而使總黃酮提取量降低。優(yōu)化條件選擇為75%、80%、85%。

圖3 乙醇濃度對黑老虎花總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of concentration of ethanol on the yield of total flavonoids from Kadsura coccinea flowers

2.2.3 不同料液比對得率的影響 如圖4 所示，料液比在1:15～1:25 范圍內(nèi)，總黃酮得率隨著溶劑用量的增加逐漸增大，在1:25 處得率達(dá)到峰值12.37 mg/g，然后隨著溶劑用量的增加得率反而下降。這可能是在1:25 之前，溶劑用量未達(dá)到飽和，所以得率隨著溶劑用量的增加而增大[24]。當(dāng)料液比已達(dá)到飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加溶劑用量，其他可溶性雜質(zhì)的提取量增大，所以總黃酮得率反而降低。因此，優(yōu)化實驗選擇為1:20、1:25、1:30 g/mL。

圖4 料液比對黑老虎花總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of material liquid ratio on the yield of total flavonoids from Kadsura coccinea flowers

2.2.4 不同超聲溫度對得率的影響 如圖5 所示，60 ℃以前，隨著溫度的增加，總黃酮得率大幅度提升，在60 ℃時達(dá)最大值9.97 mg/g；當(dāng)溫度高于60 ℃后，隨著溫度的增加，得率逐漸下降。分子運動速度與溫度相關(guān)，隨著溫度的升高，分子運動加快。因此，溫度的升高加快了溶劑分子在植物細(xì)胞內(nèi)外的往返運動；但是溫度太高，則可能破壞黑老虎花中黃酮的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致得率下降。所以優(yōu)化實驗條件為55、60、65 ℃。

圖5 超聲溫度對黑老虎花總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids from Kadsura coccinea flowers

2.3 正交試驗

由表2 可知，各因素對總黃酮得率的影響大小如下：超聲時間（A）>料液比（B）>超聲溫度（D）>乙醇濃度（C）。最優(yōu)工藝條件為A2B3C3D2，即超聲時間為45 min、料液比1:30 g/mL、乙醇濃度85%、超聲溫度60 ℃。此條件下黑老虎花總黃酮得率為（19.25±0.12）mg/g。由表3 可知，各因素對黑老虎花總黃酮提取影響顯著（P<0.05）。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results for orthogonal test

表3 正交設(shè)計方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal design

2.4 抗氧化測試

2.4.1 清除DPPH自由基能力 由圖6 可知，在測定濃度范圍內(nèi)，黑老虎花總黃酮清除DPPH自由基的能力逐漸增大，與濃度成量效關(guān)系。在0.8 mg/mL處，清除率為82.1%，相當(dāng)于該濃度下維生素C抗氧化能力的87.9%。通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得黑老虎花總黃酮及VC對DPPH清除率的IC50值分別為0.13、0.093 mg/mL，鐵皮石斛花[25]對DPPH自由基抑制能力的IC50為1.01 mg/mL，說明黑老虎花總黃酮具有較好的清除DPPH自由基作用。

圖6 黑老虎花總黃酮對DPPH自由基抑制作用Fig.6 Inhibitory effect on DPPH free radical of total flavonoids from Kadsura coccinea flowers

2.4.2 清除ABTS自由基能力 由圖7 可知，在測試濃度范圍內(nèi)，黑老虎花總黃酮對ABTS自由基抑制作用逐漸加強，這也說明，植物中總黃酮抗氧化活性與其含量相關(guān)[26]。在0.4 mg/mL時，清除率達(dá)到最大值94.7%，清除能力與維生素C相當(dāng)（96.1%），通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得黑老虎花總黃酮及VC對ABTS清除率的IC50值分別為0.046、0.035 mg/mL，雖然清除能力低于VC，但該提取物也具有較強的清除ABTS自由基能力。黑老虎花中的黃酮類化合物具有抗氧化作用可能是由于其結(jié)構(gòu)上存在羥基，其能夠通過與自由基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，干擾自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)生，從而產(chǎn)生抗氧化作用[27]。

圖7 黑老虎花總黃酮對ABTS自由基清除能力Fig.7 Scavenging ability on ABTS free radical of total flavonoids from Kadsura coccinea flowers

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取黑老虎花總黃酮，通過單因素確定黑老虎花在全開期時（6 月份）黃酮含量更高，又通過正交試驗優(yōu)化其工藝條件：黑老虎花全開期采摘，超聲時間45 min、料液比1:30 g/mL、乙醇濃度85%、超聲溫度60 ℃，最優(yōu)條件下提取量為（19.25±0.12）mg/g。黑老虎花總黃酮在濃度為0.8 mg/mL時，對DPPH自由基清除率為82.1%，IC50為0.13 mg/mL；在濃度為0.4 mg/mL時，其對ABTS自由基的清除率達(dá)到最大值，與維生素C清除DPPH自由基能力相當(dāng)，IC50為0.046 mg/mL。實驗結(jié)果表明黑老虎花中總黃酮具有較強的抗氧化能力，可開發(fā)為天然抗氧化劑。