譚敏華，張巧苑，于立梅,，曾曉房，陳海光

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院，廣東廣州 510225；3.東莞海關(guān)綜合技術(shù)中心，廣東東莞 523073）

琯溪蜜柚有“天然罐頭”之稱，其果皮呈黃色，具有清甜微酸、瓤肉潔白等特點(diǎn)，在我國(guó)西周時(shí)期已有栽培，主要分布在東南沿海地區(qū)[1]?，g溪蜜柚不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如礦物質(zhì)、維生素等[2?3]，還能增強(qiáng)人體免疫力和預(yù)防疾病的發(fā)生[4]，是一種老少咸宜的保健食品。

柚子全果果酒是以柚子皮和瓤肉為原料經(jīng)破碎等工序釀造而成的低度酒，含有多種抗氧化活性成分和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，受到人們的青睞[5?6]。適量飲酒有益于人體健康，降低心血管疾病的發(fā)生[7?9]、抑制動(dòng)脈平滑肌收縮[10]、促進(jìn)血液循環(huán)和抗癌[11]等功效。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，果酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)逐漸增多。香氣成分的測(cè)定是柚子全果果酒在釀造過程中的重要指標(biāo)之一，可直接反映出果酒品質(zhì)的好壞，并影響消費(fèi)者的選購(gòu)心理。頂空固相微萃取和氣質(zhì)（Gas Chromatography Mass Spectrometer，GCMS）聯(lián)用技術(shù)是目前應(yīng)用于發(fā)酵果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定分析的主要方法[12]。

目前果酒的品種逐漸增多，但柚子酒相關(guān)的研究相對(duì)較少，多數(shù)柚子的加工中是以柚子肉為原料，柚子皮被舍棄。柚子皮中含有多種功效成分如柚皮苷等，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[13]。柚子皮在加工過程中常常被丟棄，這會(huì)對(duì)環(huán)境造成巨大的污染。此外，國(guó)內(nèi)外關(guān)于柚子全果果酒的抗氧化性和香氣成分鮮見報(bào)道。本研究以新鮮的柚子皮和瓤肉為原料，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化并測(cè)定成品酒的體外抗氧化活性和香氣成分，為柚子酒工業(yè)化、規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福建琯溪蜜柚 購(gòu)于廣州華潤(rùn)超市；釀酒活性干酵母 購(gòu)于安琪酵母旗艦店；1,1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）、氯化鈉、食用小蘇打、六水三氯化鐵、七水硫酸亞鐵、偏重亞硫酸鉀、無水乙醇、冰乙酸、果膠酶（500U/mg）、三吡啶基三嗪（TPTZ）、醋酸鈉、白砂糖、食鹽、檸檬酸（食品級(jí)）購(gòu)于廣州碩瑪實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；試劑均為分析純。

WYT-J手持糖度計(jì) 成都豪創(chuàng)光電儀器有限公司；DFG-02.300 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；PHB-3pH便攜式pH計(jì) 上海三信儀表廠；HH-s4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；WYA-2W阿貝折射儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV759 紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；BSP-250 程控生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；6890-5973N氣相色譜質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent科技有限公司；PDMS50 固相微萃取裝置 深圳市東方藍(lán)泰科技有限公司；57330-U萃取手柄 美國(guó)Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柚子果酒加工工藝流程及操作要點(diǎn) 新鮮柚子→清洗→切粒→皮肉配比選定→脫苦→打漿→酶解處理→滅酶→添加SO2→調(diào)糖調(diào)酸→接種→發(fā)酵→過濾→陳釀→成品

操作要點(diǎn)：

清洗、切粒：新鮮柚子洗凈后剝皮，去籽，取全肉，柚子皮削掉表面青皮留白皮，并將其切成1 cm3的顆粒，備用。

皮肉配比選定：選擇三個(gè)具有代表性的比例，分別是①肉:皮=1:1、②肉:皮=1:2、③肉:皮=2:1，按以上比例加入等比例的蒸餾水混合進(jìn)行釀造。發(fā)酵7 d時(shí)測(cè)定酒精度，選出最合適的皮肉配比進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

脫苦：往柚子皮上撒5%食鹽，反復(fù)揉搓后擠去汁液，重復(fù)三次，用蒸餾水將柚子皮中的鹽分洗凈，擠干，備用。

打漿：原料與純凈水等比例混合（m:V=1:1），放入打漿機(jī)中打成糊狀，有利于下一步酶解[14]。

酶解與滅酶：往打漿后的原料中加入0.025%果膠酶，于40 ℃水浴鍋中酶解2 h，并在90～95 ℃下滅酶5 min。

添加SO2：將全果發(fā)酵液與80mg/L偏重亞硫酸鉀充分混合，攪拌均勻。

調(diào)糖：由于柚子全果含糖量不高，制得的原液含糖量較低（3%～4%），所以要根據(jù)酵母釀酒所需的糖度來進(jìn)行發(fā)酵前的調(diào)配。向原液中加入精制白砂糖后充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙?，使用手持糖度?jì)測(cè)定其糖度，以確定是否達(dá)到發(fā)酵所需糖度?？偺呛坑?jì)算公式如下：

式中，A為總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%），B為柚子汁的質(zhì)量（g），C為糖的添加量（g），D為原柚子汁的含糖量（%）。

調(diào)pH：使用檸檬酸或小蘇打?qū)㈣肿釉旱膒H控制在3.0～5.0 之間，達(dá)到最好的發(fā)酵條件。

酵母活化與接種：取10%的活性干酵母加入到含糖量為4%的溫水（34～40 ℃）中，混勻后靜置，攪拌20～30 min后直接加入柚子原液進(jìn)行發(fā)酵。

確定發(fā)酵時(shí)間：取600 mL發(fā)酵液于錐形瓶中在20 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，每隔1 d測(cè)定一次酒精度，直到所測(cè)數(shù)據(jù)趨于穩(wěn)定時(shí)，方可確定發(fā)酵時(shí)間。

過濾：發(fā)酵結(jié)束后用濾布濾去酒渣，再將濾液離心取得上清液。

陳釀：離心后得到的上清液進(jìn)行低溫后發(fā)酵（15 ℃）。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 含糖量對(duì)柚子全果果酒酒精度的影響 取200 mL柚子原液在溫度20 ℃，含糖量分別為16%、18%、20%、22%、24%，偏重亞硫酸鉀120 mg/L，酵母菌接種量1.0%，初始pH4.0 的條件下進(jìn)行釀制，發(fā)酵7 d時(shí)測(cè)定酒精度。

1.2.2.2 偏重亞硫酸鉀添加量對(duì)柚子全果果酒酒精度的影響 取200 mL柚子原液在溫度20 ℃，含糖量20%，偏重亞硫酸鉀分別為0、40、80、120、160 mg/L，酵母菌接種量1.0%，初始pH4.0 的條件下進(jìn)行釀制，發(fā)酵7 d時(shí)測(cè)定酒精度。

1.2.2.3 酵母接種量對(duì)柚子全果果酒酒精度的影響 取200 mL柚子原液在溫度20 ℃，含糖量20%，偏重亞硫酸鉀120 mg/L，酵母菌接種量分別為0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6%，初始pH4.0 的條件下進(jìn)行釀制，發(fā)酵7 d時(shí)測(cè)定酒精度。

1.2.2.4 初始pH對(duì)柚子全果果酒酒精度的影響 取200 mL柚子原液在溫度20 ℃，含糖量20%，偏重亞硫酸鉀120 mg/L，酵母菌接種量1.0%，初始pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 的條件下進(jìn)行釀制，發(fā)酵7 d時(shí)測(cè)定酒精度。

1.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取含糖量、偏重亞硫酸鉀添加量、酵母接種量和初始pH4 個(gè)因素，以酒精度為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以確定柚子全果果酒的最佳發(fā)酵工藝。正交試驗(yàn)因素水平如表1 所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal test factors level design

1.2.4 理化指標(biāo)測(cè)定 乙醇體積分?jǐn)?shù)的測(cè)定：酒精計(jì)；pH的測(cè)定：PHB-3pH便攜式pH計(jì)；可溶性固形物的測(cè)定：手持糖度計(jì)。

1.2.5 體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 參考Kilani等[15]的方法并稍作修改。柚子全果果酒是在含糖量22%，偏重亞硫酸鉀分別為40 mg/L，接種量1.0%，初始pH 4.0 的條件下制作的。取0.2 mL柚子全果果酒加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液在常溫暗處反應(yīng)30 min測(cè)517 nm的吸光度A1，從發(fā)酵第1～9 d每隔2 d測(cè)一次吸光度A1。以0.2 mL 50%乙醇代替樣品為對(duì)照，測(cè)517 nm的吸光度A2。以無水乙醇為空白。按式（1）計(jì)算DPPH·清除率：

1.2.5.2 鐵離子還原能力測(cè)定 參照Iris等[16]的方法并稍作修改。柚子全果果酒是在含糖量22%，偏重亞硫酸鉀分別為40 mg/L，接種量1.0%，初始pH 4.0 的條件下制作的。取2.5 mL TPTZ（10 mmol/L）、2.5 mL FeCl3·6H2O（20 mmol/L）和25 mL pH3.6 醋酸緩沖液（0.3 mol/L）充分混勻得到FRAP溶液，在37 ℃恒溫水浴鍋中貯藏備用。取3mL FRAP溶液加入3 mL超純水和0.1 mL柚子全果果酒充分混合后于37 ℃水浴鍋中避光放置5 min，以超純水代替柚子全果果酒為空白，從發(fā)酵第1～9 d每隔2 d測(cè)一次吸光度（593 nm）。以FeSO4·7H2O為標(biāo)品制作標(biāo)曲：y=0.0071x+0.0692（R2=0.9988），根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算硫酸亞鐵的濃度（mmol/L）。

1.2.6 香氣成分分析

1.2.6.1 香氣成分的富集 柚子全果果酒是在含糖量22%，偏重亞硫酸鉀分別為40 mg/L，接種量1.0%，初始pH 4.0 的條件下制作的。取7 mL柚子全果果酒和1 g NaCl于15 mL頂空瓶中，用萃取頭（57330-U）在40 ℃下吸附45 min，解析5 min，進(jìn)行分析。

1.2.6.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件 色譜柱：HP-5MS色譜柱（19091S-413，30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣He；進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：35 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至50 ℃，再以6 ℃/min升至110 ℃，最后以8 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；柱流量0.8 mL/min；不分流進(jìn)樣；質(zhì)量掃描范圍50～550 amu；離子源溫度250 ℃；電離方式EI；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

由圖1 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，柚子全果果酒的酒精度先上升后趨于平緩，在第7 d達(dá)到了13%vol。在第7～9 d時(shí)，柚子全果果酒的酒精趨于平緩，可能是酵母菌在發(fā)酵過程中逐漸衰老，使得糖的轉(zhuǎn)化率逐步下降，導(dǎo)致果酒的酒精度增加漸緩。故可以確定柚子全果果酒的發(fā)酵時(shí)間為7 d。

圖1 柚子全果果酒在發(fā)酵過程中酒精度的變化Fig.1 Changes in alcohol content of grapefruit whole fruit wine during fermentation

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 含糖量對(duì)柚子全果果酒酒精度的影響 由圖2可知，隨著含糖量增加，柚子全果果酒的酒精度逐漸升高后趨于平緩，在20%時(shí)達(dá)到了13.4%vol，說明當(dāng)含糖量偏高時(shí)，發(fā)酵液中酵母菌將部分糖醇化，使多余糖分無法被消耗變成酒精，導(dǎo)致果酒中殘留總糖過多，造成品質(zhì)下降。此結(jié)果與于斌等[17]研究含糖量對(duì)沙果果酒發(fā)酵中酒精度變化的結(jié)果相似。因此，含糖量選擇為20%。

圖2 含糖量對(duì)柚子全果果酒酒精度的影響Fig.2 The effect of sugar content on the alcohol content of grapefruit whole fruit wine

2.2.2 偏重亞硫酸鉀添加量對(duì)柚子全果果酒酒精度的影響 果酒制作過程中添加偏重亞硫酸鉀能產(chǎn)生SO2，對(duì)果酒的抗氧化、澄清、增酸、護(hù)色和抑菌起著重要作用。由圖3 可知，隨著偏重亞硫酸鉀添加量的增加，柚子全果果酒的酒精度先升高后下降，在80 mg/L時(shí)達(dá)到了13.3%vol。當(dāng)偏重亞硫酸鉀添加量為80～160 mg/L時(shí)，柚子全果果酒的酒精度有所下降，可能是添加偏重亞硫酸鉀后產(chǎn)生SO2過多不利于酵母菌利用糖類發(fā)酵生成酒精[5]。此結(jié)果與王婭玲等[18]研究SO2添加量對(duì)木奶果果酒發(fā)酵中酒精度變化的結(jié)果相似。因此，偏重亞硫酸鉀添加量選擇為80 mg/L。

圖3 偏重亞硫酸鉀對(duì)柚子全果果酒酒精度的影響Fig.3 Effect of potassium bisulfite on the alcohol content of grapefruit whole fruit wine

2.2.3 接種量對(duì)柚子全果果酒酒精度的影響 由圖4可知，隨著酵母接種量的增加，柚子全果果酒的酒精度先升高后下降，在1.0%時(shí)達(dá)到了14.2%vol。當(dāng)接種量為1.0%～1.6%時(shí)，柚子全果果酒的酒精度有所下降，可能是接種量過多，大量微生物代謝會(huì)消耗部分糖分，造成發(fā)酵液中糖分不足，導(dǎo)致果酒中乙醇體積分?jǐn)?shù)下降[19?20]；或代謝產(chǎn)物持續(xù)累積抑制了酵母菌的生長(zhǎng)，加快酵母菌的衰老，造成果酒中酒精度下降[21?22]。此結(jié)果與王孝榮等[5]研究酵母接種量對(duì)草莓果酒發(fā)酵中酒精度變化的結(jié)果相似。因此，酵母接種量選擇為1.0%。

圖4 接種量對(duì)柚子全果果酒酒精度的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on the alcohol content of grapefruit whole fruit wine

2.2.4 初始pH對(duì)柚子全果果酒酒精度的影響 由圖5 可知，隨著初始pH增加，柚子全果果酒的酒精度逐漸升高后趨于平緩，在4.5 時(shí)達(dá)到了14.2%vol。當(dāng)初始pH為4.5～5.0 時(shí)，柚子全果果酒的酒精度趨于平緩，可能是酵母菌的最適pH在4.5～5.0 之間，酵母菌穩(wěn)定生長(zhǎng)，果酒中的糖被醇化，使果酒中的酒精度趨于穩(wěn)定，有利于維持果酒的發(fā)酵和成品質(zhì)量[23?24]。因此，初始pH選擇為4.5。

圖5 初始pH對(duì)柚子全果果酒酒精度的影響Fig.5 Effect of initial pH on the alcohol content of grapefruit whole fruit wine

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

以酒精度為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)方法，確定柚子全果果酒的最佳發(fā)酵工藝。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and results

由表2 可知，影響柚子全果果酒發(fā)酵工藝的因素依次是A>D>B>C，即影響柚子全果果酒發(fā)酵工藝的因素依次為含糖量、初始pH、偏重亞硫酸鉀添加量、酵母接種量。由表3 可知，因素A為差異顯著因素（P<0.05），因素B、C、D為差異不顯著因素（P>0.05），此結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致。最佳發(fā)酵工藝分別為A3B1C2D1和A3B2C2D1，即含糖量22%，偏重亞硫酸鉀添加量分別為40、80 mg/L，酵母接種量1.0%，pH4.0，在此條件下柚子全果果酒的酒精度分別為14.4%vol和14.2%vol。因此柚子全果果酒的最優(yōu)發(fā)酵工藝為A3B1C2D1，對(duì)應(yīng)柿子全果果酒酒精度為14.4%vol。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

2.4 體外抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力分析 由圖6 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，柚子全果果酒中DPPH·清除能力逐漸下降后趨于平緩。發(fā)酵時(shí)間到第9 d時(shí)，DPPH·清除率下降了5.01%，發(fā)酵到第7 d時(shí)基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)。分析原因有以下三個(gè)方面：第一，活性酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，同時(shí)其細(xì)胞壁吸附了果酒中的抗氧化物質(zhì)[25]。第二，在微生物酶催化下，柚子細(xì)胞壁會(huì)分解生成蛋白質(zhì)、糖苷等物質(zhì)，使DPPH自由基清除率下降。第三，果酒發(fā)酵過程中的pH、溫度、酒精度等均可影響DPPH自由基清除率[26]，導(dǎo)致果酒在發(fā)酵過程中多酚和黃酮類化合物含量下降，使其抗氧化活性下降[27]。

圖6 柚子全果果酒DPPH·清除率的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)Fig.6 Kinetic reaction of DPPH free radical scavenging rate from grapefruit wine

2.4.2 鐵離子還原能力分析 由圖7 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，柚子全果果酒中FRAP值逐漸下降后趨于平緩，在第1 d時(shí)達(dá)到了164.39 mmol Fe2+/L。分析原因可能是果酒中各種活性成分在發(fā)酵階段不斷被浸出，使其抗氧化活性較強(qiáng)。發(fā)酵時(shí)間到第9 d時(shí)，鐵離子還原能力下降了13.99 mmol Fe2+/L，發(fā)酵到第7 d時(shí)基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)。分析原因有以下三個(gè)方面：第一，果酒在過濾時(shí)與氧氣充分接觸，其抗氧化活性成分在發(fā)酵階段被氧化，造成鐵離子還原能力下降[28]；第二，單體酚和酚酸等抗氧化物質(zhì)在發(fā)酵階段參與了果酒中尚未結(jié)束的生化反應(yīng)，不斷合成、分解產(chǎn)生花色苷衍生物和結(jié)合態(tài)酚酸衍生物，使其抗氧化能力下降[29?30]；第三，果酒在密閉環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵，氧氣幾乎完全消耗，使抗氧化能力趨于穩(wěn)定。

圖7 柚子全果果酒鐵離子還原能力的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)Fig.7 Kinetic reaction of iron reduction ability from grapefruit whole fruit wine

2.5 香氣成分分析

圖8 為柚子全果果酒香氣物質(zhì)的GC-MS分析離子流色譜圖，各組分鑒定的結(jié)果如表4 所示。由表4 可知，采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)初步鑒定出柚子全果果酒的香氣物質(zhì)有23 種。其中，相對(duì)含量>1%的香氣物質(zhì)為：苯乙醇（22.54%）、醋酸（9.10%）、辛酸乙酯（8.90%）、3-甲基-1-丁醇乙酸酯（13.01%）、芳樟醇（8.83%）、癸酸乙酯（8.04%）、乙醇（3.21%）、9-溴壬酸乙酯（2.59%）、3-甲基丁醇（1.61%）、正己酸乙酯（20.29%）、乳酸乙酯（2.02%）、1-甲氧基-2-丁醇(1.25%)。康明麗等[31]研究柑橘果酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)苯乙醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯和正己酸乙酯等為果酒作出主要貢獻(xiàn)。苯乙醇為柚子果酒提供清甜的玫瑰花香，不僅能夠殺菌，還能用于制作香精香料[32]。大多數(shù)酯類物質(zhì)具有花果香味或濃郁的酒香味，如辛酸乙酯、癸酸乙酯和正己酸乙酯分別為柚子果酒提供酒香味、椰子香和水果香[31]。

圖8 柚子全果果酒香氣物質(zhì)的GC-MS分析離子流色譜圖Fig.8 GC-MS analysis ion chromatogram of aroma substances from grapefruit whole fruit wine

表4 柚子全果果酒中主要香氣成分Table 4 Main flavor compounds from grapefruit whole fruit wine

通過對(duì)柚子全果果酒的香氣成分分析，共鑒定出酯類化合物10 種，醇類化合物9 種、酸類化合物4 種。酯類的相對(duì)含量為58.36%；醇類的相對(duì)含量為40.69%；酸類的相對(duì)含量為11.38%。

3 結(jié)論

以瓤肉和柚子皮為原料釀制果酒，不僅能夠增加柚子的附加值，還能避免資源浪費(fèi)問題。利用正交試驗(yàn)對(duì)4 個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化分析，獲得最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)為：含糖量22%，偏重亞硫酸鉀添加量40 mg/L，酵母接種量1.0%，pH4.0，在此條件下柚子全果果酒的酒精度為14.4%vol。DPPH自由基清除率和鐵離子還原能力結(jié)果表明隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，柚子全果果酒的體外抗氧化能力逐漸下降。采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS技術(shù)分析柚子全果果酒的香氣成分，初步鑒定出23 種香氣物質(zhì)，其中酯類化合物的種類和相對(duì)含量分別占總香氣物質(zhì)的43.48%和58.36%。