謝 芳，謝華德，唐振華，謝耀鋒，郭艷霞，黃鈺涵，楊承劍

（中國農(nóng)業(yè)科學院廣西水牛研究所，廣西水牛遺傳繁育重點實驗室，廣西南寧 530001）

我國水牛資源豐富，廣西水牛數(shù)量更是位居全國首位。近年來，在政府扶植和政策驅(qū)動下，奶水牛產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為廣西的特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)[1]，水牛奶產(chǎn)量也升至全國之最。水牛奶因其優(yōu)良的品質(zhì)和香醇的口感而被世界公認為“奶中珍品”[2]，其蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、維生素等含量均高于黑白花奶[3]與荷斯坦奶牛相比，水牛適應能力強，具有較強的抗病性和免疫力，迄今尚未有水牛瘋牛病例報道[4]，尤其是水牛初乳，因其含有大量的免疫和生長因子而一度成為市場新寵，更有研究表明水牛初乳中的免疫球蛋白G、溶菌酶、類胰島素生長因子等是普通牛乳的5～10 倍[5]，因此，水牛乳具有較好的食用安全性和較高的商業(yè)價值，深加工優(yōu)勢明顯。

近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，高通量測序作為“下一代”測序技術已迅速發(fā)展，它避開了微生物分離培養(yǎng)的過程，能檢測到純培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術不能發(fā)現(xiàn)的低豐度細菌種類，相較傳統(tǒng)的測序技術，具有準確率高、耗時短以及信息處理量大等優(yōu)點[6]。目前，高通量測序技術現(xiàn)已應用于各個領域，包括海洋、土壤、植物和腸道環(huán)境，而利用高通量測序?qū)θ槠奉I域進行研究的報道較少[7]，以往通過傳統(tǒng)測序可以檢測到可培養(yǎng)和含量較高的菌落，但很難從樣品中獲得曾經(jīng)存活或難以分離的微生物，進而不能全面了解微生物的多樣性[8]。牛乳是微生物最好的培養(yǎng)基，這些微生物可能來自患乳房炎奶牛的乳房、擠奶工具亦或是牛棚環(huán)境[9]，而生奶中致病細菌以及腐敗細菌的分布可反映奶水牛的健康狀況、水牛奶的污染情況等[10]。作為生產(chǎn)乳品的基礎，其微生物含量則是衡量水牛乳品質(zhì)的關鍵指標，故了解水牛原料乳中微生物多樣性至關重要。

本研究擬利用16S rDNA高通量測序技術，對廣西水牛研究所種畜場存欄量較大的三品雜水牛（摩拉×尼里-拉菲×本地沼澤型）初乳和常乳組樣本中的細菌群落結構進行比較分析，以期全面了解水牛初乳和常乳中細菌群落結構和多樣性差異，旨在為后續(xù)水牛乳加工、安全評估等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生水牛乳樣本 均取自廣西水牛研究所水牛種畜場；E.Z.N.A.? Soil DNA Kit DNA抽提試劑盒，美 國Omega Bio-Tek公 司；biowest agArose瓊 脂糖 西班牙Biowest；NEXTFLEX ? Rapid DNASeq Kit建庫試劑盒 美國Bioo Scientific；MiSeq Reagent Kit v3 測序試劑盒 美國Illumina；磷酸緩沖鹽溶液 賽默飛世爾科技；蔗糖緩沖液 北京雷根生物；溶菌酶、變?nèi)芫?上海聯(lián)碩寶為生物；蛋白酶K、RNase、PE Buffer上海生工生物；氯化鈉、冰異丙醇、苯酚、氯仿、異戊醇 上海北諾生物科技；糖原 北京百奧萊博。

Eppendorf 5430 R離心機、Eppendorf 5424R高速臺式冷凍離心機 德國Eppendorf；NanoDrop2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific；BioTek ELx800 酶標儀美國Biotek；Quantus?Fluorometer微型熒光計 美國Promega公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠；ABI GeneAmp?9700 型PCR儀 美國ABI；Illumina Miseq測序儀 美國Illumina。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本采集 生水牛乳樣本隨機選取9 頭處于圍產(chǎn)期的三品種高代雜交水牛（摩拉×尼里-拉菲×本地沼澤型水牛），于每頭牛產(chǎn)犢后的第1 d開始取樣，連續(xù)采集3 d，每頭牛采集2 管平行，將每頭牛采集到的6 管奶樣混勻為混合奶樣，定義為初乳（CR4），共9 個樣本，編號為C1、C2、C3、C4、C5、S2、S3、S4、S5。于每頭牛產(chǎn)犢后的第7 d開始采集奶樣，連續(xù)3 d，每頭采集2 管平行，同樣將6 管奶樣混勻成混合奶樣，定義為常乳（PR），共9 個樣本，編號為M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9。采樣前用溫水清洗乳頭，人工佩戴無菌手套擠奶，去掉前數(shù)把奶后再留樣，樣本經(jīng)50 mL無菌PC離心管密封好，置于采樣冷藏保溫箱迅速帶回實驗室，于30 min內(nèi)進行生乳中細菌總脫氧核糖核酸（DNA）的粗提取。

1.2.2 總DNA粗提和PCR擴增 取40 mL生水牛乳樣本，添加8 mL乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）（500 mmol/L，pH8.0），在6500 r/min下4 ℃冷凍離心30 min，用滅菌脫脂棉去掉乳脂層，棄上清液，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）至10 mL，12000 r/min高速冷凍離心10 min，用1 mL蔗糖緩沖液沖洗兩次（每次12000 r/min，離心10 min），后懸浮400 μL蔗糖緩沖液及2U變?nèi)芫睾?00 μg溶菌酶，37 ℃培養(yǎng)1 h；取上述培養(yǎng)后的樣液，分別加入5 μL SDS，12 μL EDTA，5 μL蛋白酶K及78 μL蔗糖緩沖液，55 ℃孵育1 h，再加入65 μL蔗糖緩沖液和135 μL氯化鈉）（5 mmol/L），最后加入2 μL RNase于37 ℃孵育30 min，用700 μL苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）消除蛋白，上下?lián)u勻10 次以上，然后18000×g、4 ℃離心15 min提取上清，重復3 次，最后加入700 μL冰異丙醇（?20 ℃預冷）和20 μg糖原（glycogen,Roche Diagnostic），混勻放置5 min，然后-20 ℃沉淀過夜。取出過夜樣本，18000×g離心30 min獲取沉淀，用70%冰乙醇清洗兩遍（500～750 μL，彈起白色沉淀，13000 r/min離心10～15 min），傾倒上清，將離心管倒放，風干DNA，加入50 μL PE Buffer,70 ℃孵育5 min，用NanoDrop2000 測定DNA濃度。

用NanoDrop2000 檢測DNA純度和濃度，為避免序列太長影響測序，同時兼顧擴增特異性，選用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對16S rDNA基因V3-V4 可變區(qū)進行PCR擴增，反應條件如下：95 ℃預變性3 min，27 個循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)，然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進行保存。聚合酶鏈式反應（PCR）反應體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補足至20 μL。每個樣本3 個PCR重復，將3 個重復的PCR產(chǎn)物混合，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。

1.2.3 Illumina Miseq測序 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺標準操作規(guī)程，將純化后的擴增片段構建PE 2*300 文庫。文庫構建步驟：a.接“Y”字形接頭；b.使用磁珠篩選去除接頭自連片段；c.利用PCR擴增進行文庫模板的富集；d.磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300 平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。原始數(shù)據(jù)上傳至美國國家生物信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫進行比對分析。

1.2.4 細菌組成與豐度差異分析

1.2.4.1 稀釋曲線分析 構建方法是統(tǒng)計每個樣本中，每個OTU所含的序列數(shù)，將OTUs按豐度（所含有的序列條數(shù)）由大到小等級排序，再以OTU的排序等級為橫坐標，以每個OTU中所含的序列數(shù)（也可用OTU中序列數(shù)的相對百分含量）為縱坐標作圖。

1.2.4.2 OUT、韋恩圖分析 選用相似水平為97%的OTU對序列進行分類操作單元（OUT）聚類。軟件:采用R語言工具統(tǒng)計和作圖。

1.2.4.3 群落柱形圖（Bar圖）直觀呈現(xiàn)各樣本在（如域、界、門、綱、目、科、屬、種、OTU等）分類學水平上含有哪些優(yōu)勢物種以及樣本中各優(yōu)勢物種的相對豐度（所占比重）。軟件：基于tax_summary_a文件夾中的數(shù)據(jù)表，利用R語言工具作圖。

1.2.5 細菌多樣性比較分析

1.2.5.1 Heatmap圖 根據(jù)物種或樣本間豐度的相似性進行聚類，并將結果呈現(xiàn)在群落Heatmap圖上，可使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色變化來反映不同分組（或樣本）在各分類學水平上群落組成的相似性和差異性。軟件及算法：R語言vegan包。

1.2.5.2 主成分分析（PCA分析）通過分析不同樣本群落組成可以反映樣本間的差異和距離，PCA運用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標圖上，坐標軸取能夠最大反映樣品間差異的兩個特征值。如樣本物種組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。軟件：R語言PCA統(tǒng)計分析和作圖。

1.2.5.3 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）是多變量數(shù)據(jù)分析技術中的判別分析法。通過對主成分適當?shù)男D(zhuǎn)，PLS-DA可以有效地對組間觀察值進行區(qū)分，并且能夠找到導致組間區(qū)別的影響變量。這種分析方法有利于發(fā)現(xiàn)組間的異同點。軟件：R語言mixOmics包中plsda分析和作圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Trimmomatic軟件原始測序序列進行質(zhì)控，使用FLASH軟件進行拼接：過濾reads尾部質(zhì)量值20 以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads；根據(jù)PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，最小overlap長度為10 bp；拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣本，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2。使用的 UPARSE軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根據(jù)97%的相似度對序列進行分類操作單元（OUT）聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對 Silva數(shù)據(jù)庫（SSU128），設置比對閾值為70%。

菌群多樣性分析及繪圖：均采用R語言進行統(tǒng)計分析和作圖[11]。

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)、OTU及稀釋曲線分析

通過對初乳和常乳組共計18 個樣本進行16S rDNA測序、數(shù)據(jù)質(zhì)控后，共得到有效序列783372條，初乳組和常乳組分別得到優(yōu)化序列條數(shù)為392724 條和390648 條。如圖1 所示，兩組樣本的優(yōu)化序列長度均主要分布在401～440 bp，集中在421～440 bp，與設計引物擴增長度300 bp左右接近，可滿足序列分析要求。

圖1 樣本有效序列長度分布Fig.1 Distribution of effective column length of sample order

在97%相似性水平下對所有樣本序列進行聚類分析[12]，結果見圖2，初乳組和常乳組共注釋出1176 個OTU，兩組共有的OTU為669，各自獨有的OTU分別為79 和428。初乳組共產(chǎn)生748 個OTU，常乳組共產(chǎn)生1097 個OTU，由此可知，常乳組OTU數(shù)遠高于初乳組，兩組水牛乳樣本間存在大量共有的細菌菌群，且常乳組中細菌多樣性高于初乳組。

圖2 樣本OTU分布韋恩圖Fig.2 Venn diagram of sample OTUs distribution

稀釋性曲線主要反映測序深度，根據(jù)曲線是否達到平緩來判斷本次測序數(shù)量是否足夠，也間接反映樣本中菌群的豐富度和多樣性。Sobs和Shannon指數(shù)分別評估樣本群落的豐富度和多樣性[13]。樣本基于OTU的Sobs和Shannon稀釋曲線結果如圖3 所示。各樣本的群落豐富度Sobs指數(shù)稀釋曲線大部分還在上升期，但群落多樣性Shannon指數(shù)稀釋曲線在3000 條時就已經(jīng)平緩，說明增加測序數(shù)量可能會發(fā)現(xiàn)少量新的OTU，但樣本群落多樣性不會增加[14]，說明本次測序數(shù)量足以滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析要求。

圖3 Sobs（a）、Shannon（b）指數(shù)稀釋性曲線Fig.3 Rarefaction curves for Sobs (a) and Shannon (b) index

2.2 細菌組成與豐度差異分析

基于OTU注釋結果，分析樣本在不同分類水平上的群落組成。本次測序，Coverage（覆蓋率）為0.999，可代表99.9%的樣本信息。兩組樣本共注釋到1176 個OUT，26 個細菌門，97 個目，197 個科，495 個屬和767 個種。初乳組樣本共得到19 個門，52 個目，113 個科，292 個屬和437 個種。而常乳兩組樣本共得到7 個細菌門，45 個目，84 個科，203 個細菌屬和330 個菌種，相對而言，初乳組的細菌多樣性高于常乳組。為可視化呈現(xiàn)各樣本的物種豐度信息，本研究采用柱形圖來展示各樣本在門水平和屬水平的菌落分布及差異性[15]，結果如圖4、圖5 所示。由圖4 可知，在門分類水平上，以相對豐度≥0.01%為閾值，將<0.01%的菌門歸為others，初乳和常乳組共得到5 個細菌門，從高到低依次為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria ）、Patescibacteri。其中變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria ）在常乳組中占比較多，而擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）則在初乳組中較占優(yōu)勢，同一菌門在不同樣本中的相對豐度差異較大。變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門為兩組樣本中的絕對優(yōu)勢菌門，相對豐度分別為35.4%、27.6%、24.8%，合計達88%。

圖4 門水平菌落豐度圖Fig.4 Abundance map of horizontal colony of phylum

在屬水平上，豐度≥0.1%的細菌屬有15 個（圖5），其中含量較高的有9 個屬：金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、假單胞菌屬（Pseusomonas）、巨型球菌屬（Macrococcus）、棲水菌屬（Enhydrobacter）、乳球菌屬（Lactococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、鏈球菌屬（Streptococcus），各屬的相對豐度依次為24.7%、9.1%、6.6%、5.2%、5.2%、5.0%、4.7%、3.4%、2.9%，豐度和為61.6%，另外6 個屬的豐度和為25.2%，其它<0.1%的菌屬歸為others，豐度為13.2%。

圖5 屬水平菌落豐度圖Fig.5 Abundance map of horizontal colony of genus

由圖5 可知，不同樣本中主要菌屬占比差異較大，相對而言，常乳組樣本中菌群多樣性要高于初乳組。在種水平上，將初乳和常乳兩組樣本中各自的同名菌種豐度求和，其占比如表1 所示，兩組樣本間優(yōu)勢細菌豐度差異較大。初乳組中的炭疽金桿菌（Chryseobacterium anthropi）、溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）、奧斯陸莫拉菌（Moraxella osloensis）占比較大，而這幾種菌在常乳組中的占比相對較少，尤其是炭疽金桿菌和溶酪大球菌。常乳組中占優(yōu)勢的菌為意大利腸球菌（Enterococcus italicus）、烏爾辛不動桿菌（Acinetobacter ursingii）、炭疽金桿菌（Chryseobacterium anthropi）。而別雷斯不動桿菌、假單胞菌、喬斯特金桿菌這三株菌在初乳組樣本中的相對豐度較高，但在常乳組樣本中卻未檢出或相對豐度小于<0.1%。

表1 豐度較高的細菌及其在門水平上的歸類Table 1 Bacteria with high abundance and their classification at phylum level

在屬分類水平，取樣本平均總豐度前30 的菌屬，按其物種和樣本層級聚類方式繪制群落豐度聚類熱圖（圖6），使高豐度和低豐度菌落分區(qū)聚集[16]，通過顏色梯度變化來反映不同分組樣本在屬水平群落組成的相似性和差異性。由圖6 可知，初乳組和常乳組整體并沒有分區(qū)聚集，但兩組樣本中優(yōu)勢菌群的豐度明顯不同，金黃桿菌（Chryseobacterium）、巨型球菌屬（Macrococcus）、棲水菌屬（Enhydrobacter）在初乳組樣本中的含量顯著高于常乳組，而假單胞菌屬（Pseudomonas）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、腸球菌屬（Enterococcus）在常乳組中的豐度均高于初乳組。金黃桿菌（Chryseobacterium）和不動桿菌（Acinetobacter）在兩組樣本中均占比較高，葡萄球菌屬（Staphylococcus）在兩組樣本中均有低豐度出現(xiàn)。

圖6 樣本基于屬水平的菌落聚類熱圖Fig.6 Community clustering heatmaps of samples based on genus level

2.3 細菌多樣性比較分析

采用樣本層級聚類樹來分析初乳和常乳組間群落組成的相似性。18 個樣本基于OTU的樣本層級聚類樹如圖7 所示，不同顏色代表不同分組，樹枝長度和寬度分別表示樣本間的距離和遠近，相似度越高，距離越小[17]。通過樣本聚類樹可以清楚地看出樣本間分支距離遠近，直觀反映出各樣本間菌群的相似度和差異性[18]。由圖7 可知，除去個別異常樣本，初乳組樣本（紅色）主要聚成一類，相似度較高，其中C1 和C2 是最相似的兩個樣本。常乳組（藍色）則分成兩類，其中M2、M3、M6 聚成一類，而M1、M5、M7、M8、M9 聚成另一類，其中M7、M9 相似度最高，這兩聚類樣本間相似度差異較大。整體而言，初乳組與常乳組組間樣本差異不明顯，初乳組組內(nèi)樣本間菌落組成相似度較高，而常乳組組內(nèi)樣本間菌落組成差異較大。

圖7 樣本層級聚類分析Fig.7 Sample level cluster analysis

對初乳（CR4）與常乳（PR）樣本中細菌屬（相對豐度閾值>0.1%）進行主成分（PCA）分析，以便找出兩組樣本間菌群組成的相似性和差異性。樣本通過降維后，在主成分上會顯示相對坐標點，樣本點越接近，表明兩樣本物種組成越相似[19]，同理，各點之間距離越大，表明它們之間的菌群差異越大[20]，由圖8 可知，初乳（CR4）與常乳（PR）兩組樣本代表的點都按各自分組相對聚集，但兩組樣本點之間的距離較近，在空間上沒有完全分開，這說明初乳組與常乳組組間樣本個體之間菌群組成有一定的差異，導致少部分樣本菌群結構相似，大部分樣本菌群存在差異性。主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對樣本差異性的貢獻分別達到了41.21%和17.66%，共計58.87%，可以代表大部分變量信息。由圖8 可知，初乳組與常乳組在第一主成分PC1 所在的X軸方向，兩組樣本的微生物組成有明顯的分離趨勢，這說明PC1 因素有較高的可能性影響了樣本的組成，表明結果數(shù)據(jù)組內(nèi)重復性好，組內(nèi)樣本差異性大，且PC1 貢獻值為41.21%，可以作為有效的主成分，來解釋兩組樣本的組間差異。

圖8 樣本基于屬水平的主成分分析Fig.8 The sample principal component analysis on the genus level

PLS-DA（偏最小二乘法判別分析Partial Least Squares Discriminant Analysis）也是一種常見的檢驗樣本組間差異的方法，此方法是根據(jù)分組方案，弱化組內(nèi)樣本差異，突出組間樣本差異[21]，更便于發(fā)現(xiàn)組間樣本的差異性。由PLS-DA（圖9）顯示，除去M8、S3 兩個離群嚴重的異常樣本，其余樣本點均按初乳與常乳所代表的分組相對聚集，兩組樣本點在COMP1（X軸）和COMP2(Y軸)方位能夠很好地區(qū)分開來，說明初乳與常乳兩組樣本在組間的微生物組成存在明顯差異。這種一目了然的分離效果在之前的PCA分析圖中是沒有得到體現(xiàn)的。初乳組（CR4）所代表的樣本點都比較集中，說明初乳組組內(nèi)樣本之間菌群組成較相似，而常乳組（PR）所代表的樣本點都比較分散，這說明常乳組組內(nèi)樣本間菌群組成有一定的差異性。結合PCA和PLS-DA可知，初乳與常乳組組間差異顯著，組內(nèi)差異不明顯。

圖9 樣本基于屬水平的PLS-DA分析Fig.9 Sample PLS-DA analysis based on the genus level

3 討論

相較傳統(tǒng)的涂片、劃線等細菌培養(yǎng)和API試劑條等其它檢測方法，16S rDNA高通量測序更全面和準確地反映了樣本中菌群的多樣性和豐度信息，解決了以往不可培養(yǎng)及低豐度菌在傳統(tǒng)方法中無法分離鑒別的局限[22]。依據(jù)測序結果，本次試驗Coverage（覆蓋率）為0.999，顯示樣本細菌99.9%的信息得到了反映，且樣本的Shannon稀釋性曲線都趨于平緩，說明本次實驗的測序深度合理，測序量足夠，可代表樣本中絕大數(shù)的菌群多樣性信息。

本次測序，在門水平上，初乳和常乳組主要分屬于變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes），在屬水平上，初乳和常乳組主要菌群種類不盡相同，初乳組中的主要菌群有金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas），而常乳組中的優(yōu)勢菌屬主要為金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、乳球菌屬（Lactococcus ）和腸球菌屬（Enterococcus）。黃衛(wèi)強[23]在研究母乳微生物群落構成中，鑒定出的優(yōu)勢菌門與本試驗結果相同，而在屬水平上的差異較大。這可能是因為人乳和水牛乳因品種和乳源不同所致。Mazmanian等[24]的研究表明，Bacteroides（擬桿菌）在人類初乳中含量非常豐富，它可能在新生兒腸道早期定群中發(fā)揮主要作用。同樣，本次試驗水牛初乳樣本中，擬桿菌的占比也較大。

研究[25?26]表明，金黃桿菌、不動桿菌、假單胞菌屬均具有一定的抗感染能力，且假單胞菌屬和腸球菌屬與糖類和酶類代謝存在重要聯(lián)系。綜合本實驗結果，水牛初乳和常乳組所擁有的這些核心菌屬及其所具備的抗感染、修復能力以及糖和酶代謝功能，不論是對奶水牛產(chǎn)后乳房炎的修復還是犢牛早期腸道菌群定殖、消化等，都起到重要作用。

不論是在初乳還是常乳組中，炭疽金桿菌Chryseobacterium anthropi均被檢測到占有較高比例（見表1），而炭疽桿菌屬于需氧芽孢桿菌屬[27]，能引起人畜共患的炭疽病，牛、羊、駱駝等草食動物是其主工傳染源[28]。炭疽桿菌對社會公共衛(wèi)生和經(jīng)濟發(fā)展的危害，迄今仍占相當大的比重[29]。通過此次實驗，說明水牛所種畜牧場大部分奶水?？赡芑蛞呀?jīng)感染了炭疽病，應馬上采取針對性的防治措施應對。

同樣是水牛乳樣本，在本實驗檢出的部分低豐度菌群，在某些研究中卻是優(yōu)勢菌群[30]，有研究[31?32]顯示，水牛乳中Staphylococcus（葡萄球菌）、Streptococci（鏈球菌）在陽性組中所占比例較大，其組合感染是引起奶水牛乳腺病變的主要原因。本試驗在兩組樣本中均檢測到低豐度的Staphylococcus（葡萄球菌）和Streptococci（鏈球菌），盡管這些奶水牛在樣本采集時并沒表現(xiàn)出乳腺炎的病癥[33]。這將為本所種畜廠奶水牛乳腺炎針對性的預防治療提供依據(jù)。

4 結論

采用16S rDNA高通量測序技術，對廣西水牛研究所種畜廠內(nèi)的三品雜奶水牛初乳與常乳組樣本中的細菌組成及多樣性進行了比較分析，結果顯示，兩組樣本共注釋到1176 個OUT，26 個細菌門，97 個目，197 個科，495 個屬和767 個種。其中初乳組樣本共得到292 個細菌屬和437 個細菌種。初乳組較常乳組細菌多樣性豐富。通過PCA和PLSDA分析顯示，初乳與常乳兩組樣本，組內(nèi)差異較小，組間差異明顯，各樣本優(yōu)勢菌群和豐度差異較大。通過本次測序，得知了水牛研究所種畜場三品雜水牛乳中的菌群分布狀況，對后續(xù)改善該種畜場奶源衛(wèi)生條件、防止原料乳污染、乳腺炎的前期預警等均有指導意義。