段燦燦，王清純，趙澤粉，蔡秋雪，劉 方，晏仁義，何天目，王雅芝，李桂琳，張建永,

（1.遵義醫(yī)科大學基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州遵義 563003；2.遵義醫(yī)科大學藥學院，貴州遵義 563009；3.雙鶴藥業(yè)（海南）有限責任公司，海南海口 570311；4.云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學研究所，云南瑞麗 678600）

神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)自身免疫病、神經(jīng)系統(tǒng)感染等在內的一組系統(tǒng)性疾病[1]。隨著社會的老齡化嚴重，神經(jīng)系統(tǒng)疾病已成為導致人類死亡和殘疾的主要原因之一。據(jù)調查，截止到2017 年5 月，全球約4700 萬阿爾茲海默癥患者，預計到2030 年，將達到7470 萬[2]。目前臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物雖然較多，但是藥物會造成一定的不良反應，如心理狀態(tài)異常、支氣管痙攣和血管性水腫等[3]。特別是阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病目前仍無較理想的藥物可用，因此研發(fā)新的神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物具有重要意義。

金釵石斛（Dendrobium nobileLindl）為蘭科植物金釵石斛的莖，因形像古代頭上的發(fā)釵而得名。主產(chǎn)廣西、貴州等地，具滋陰清熱，生津止渴等功效。目前從金釵石斛中已經(jīng)分離到了生物堿、酚類、黃酮類、等生物活性成分[4]?，F(xiàn)代藥理學發(fā)現(xiàn)，金釵石斛具有抗腫瘤、抗衰老、增強免疫、改善記憶及抗白內障等多種藥理活性[5]。如金釵石斛提取物能有效改善小鼠抑郁模型的行為學表現(xiàn)，提高小鼠腦內的多巴胺和5-羥色胺水平[6]；金釵石斛可以通過提高超氧化物歧化酶水平及降低過氧化脂質含量達到提高記憶的效果[7]；金釵石斛生物總堿對脂多糖誘導大鼠海馬tau蛋白的高度磷酸化和炎癥等具有明顯的改善作用，同時可減輕海馬周圍神經(jīng)細胞的凋亡[8]；金釵石斛多糖可保護神經(jīng)元免受炎癥因子的毒性作用，通過拮抗脂多糖對膠質細胞-神經(jīng)元混合培養(yǎng)體系，降低炎癥因子表達及抑制小膠質細胞激活等機制[9?11]。因此，金釵石斛在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有很大的潛力，亟需深入挖掘金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的活性成分和作用靶點，厘清金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在治療靶點及分子機制。

由于中藥多成分-多靶點-多通路的特點，難以厘清其具體治病機制。網(wǎng)絡藥理學是由系統(tǒng)生物學及多向藥理學等多學科的交叉融合，運用基因組學、代謝組學、可視化和分子對接等多種技術，揭示“化合物-基因-通路-疾病”之間復雜的網(wǎng)絡關系，多維度分析疾病的致病基礎，探索藥物干預后的藥理學機制，并通過相應的實驗來驗證、評估藥物的有效性、作用機制及不良反應，從而發(fā)現(xiàn)高效、低毒的藥物[12]。如有研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法，探討了二至丸預防阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease,AD）的物質基礎和機制，發(fā)現(xiàn)了二至丸治療AD的有效成分可能是槲皮素、香葉醇、β-谷甾醇、橙花醇和厄立地黃，其作用機制可能與Wnt、MAPK和PI3K-AKT-M Tor三種信號途徑有關[13]。有研究基于中藥網(wǎng)絡藥理學的方法，分析得出四逆散可以通過調節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號通路、cAMP系統(tǒng)神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)遞質分泌等途徑發(fā)揮抗抑郁作用[14]。故本研究基于網(wǎng)絡藥理學探索金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的分子機制，以期為后續(xù)深入研究其藥效物質基礎及治療機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）；PubChem數(shù)據(jù)庫；Chemical Book數(shù)據(jù)庫；ADMETlab數(shù)據(jù)庫；Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫；TargetNet數(shù)據(jù)庫；UniProt數(shù)據(jù)庫；比較毒理基因組學數(shù)據(jù)庫（CTD）；功能關聯(lián)蛋白網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫（STRING）；生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫（DAVID）；AutoDock Vina軟件；ChemBioDraw 13.0 軟件；Cytoscape 3.6.1軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1 金釵石斛化學成分的收集 檢索國內外文獻數(shù)據(jù)庫，包括中國知網(wǎng)、萬方、數(shù)據(jù)庫SinoMed (http://www.sinomed.ac.cn)、Pubmed (http://pubmed.com.cutestat.com)和TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)[15?16]，得到金釵石斛中的活性成分。再利 用 Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、Chemical Book（http://www.chemicalbook.com）和ADMETlab (http://admet.scbdd.com)數(shù)據(jù)庫等平臺驗證其成分結構，并采用ChemBioDraw13.0 軟件繪制其分子結構，保存為“sdf”文件。

1.2.2 金釵石斛成分潛在靶點預測 采用TargetNet(http://targetnet.scbdd.com) 在線數(shù)據(jù)庫預測成分的潛在靶點，以準確性（Accuracy，AUC）≥0.7 為遴選條件，其中AUC代表采用模型方法的預測準確率，篩選Uniprot_ID、Protein、Prob（>0.9）等靶點的作用的潛在靶點群，同時本研究是針對人體，故再利用Uniprot (http://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫篩選人源的潛在靶點。

1.2.3 金釵石斛成分-靶點互作網(wǎng)絡 采用Cytoscape 3.6.1 軟件，構建金釵石斛“成分-靶點”網(wǎng)絡，運用Network analysis插件分析網(wǎng)絡特征指標度（degree）和介數(shù)（Betweenness），獲取主要藥效物質基礎和關鍵靶點。

1.2.4 靶點-疾病互作網(wǎng)絡 將靶點導入CTD數(shù)據(jù)庫（https://ctdbase.org/tools/batchQuery.go）進行相關疾病的分析，剔除非神經(jīng)系統(tǒng)疾病的靶點。采用Cytoscape 3.6.1 軟件，構建“靶點-疾病”互作網(wǎng)絡，進一步以Network analysis插件對網(wǎng)絡的Degree和Betweenness進行分析。同時根據(jù)人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org）對不同類別疾病歸納和分類。

1.2.5 作用靶點的PPI網(wǎng)絡 將獲取的相關神經(jīng)系統(tǒng)疾病靶點進行整合，采用STRING (https://stringdb.org)數(shù)據(jù)庫在線分析，獲取靶點之間的相互作用數(shù)據(jù)，導入Cytoscape 3.6.1 軟件，重新構建金釵石斛潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡，利用Analyze network工具對網(wǎng)絡進行分析，采用gnoyiacGenerate style from statistics工具根據(jù)degree值的大小對靶點的大小和顏色進行變換。

1.2.6 靶點蛋白的基因功能和通路分析 本研究采用在線分析數(shù)據(jù)庫DAVID（https://david.ncifcrf.gov）對金釵石斛作用的靶點進行富集分析，基于ClueGO插件進行基因功能及KEGG通路富集分析。設定閾值P-value<0.05，篩選主要靶點信號通路。并使用Omicshare（http://www.omicshare.com/tools/index.php/Home/Soft/trend）在線分析平臺對富集分析結果進行可視化，進一步整合探析金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要信號通路，揭示金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在分子機制。

1.2.7 分子對接 選擇成分-靶點網(wǎng)絡中degree排名前6 的靶點，同時選擇金釵石斛degree排名前10 的成分，采用AutoDock Vina軟件，將靶點與成分進行分子對接驗證，以其結合能（Binding energy）評價化合物和靶點的結合活性。一般認為結合能越高，配體與受體的結合性越穩(wěn)定。當結合能大于5.0，表明化合物靶點結合具有較好的結合活性。首先通過RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫獲取靶點蛋白晶體結構，用OpenBabel軟件將成分的化學結構SDF格式轉化為PDB格式。使用AutoDock Vina得到對接活性位點、結合能和均方根偏差(RMSD)。最后運用Pymol軟件對對接結果進行可視化分析。

2 結果與分析

2.1 金釵石斛目標化合物的篩選

本研究通過檢索中國知網(wǎng)、萬方、數(shù)據(jù)庫SinoMed(http://www.sinomed.ac.cn)、Pubmed (http://pubmed.com.cutestat.com)和TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中報道的金釵石斛化學成分，共收集到47 個（表1）。

表1 金釵石斛中的化學成分信息Table 1 Chemical constituents of Dendrobium nobile

2.2 金釵石斛成分-靶點網(wǎng)絡構建與分析

如圖1 所示，金釵石斛“成分-靶點”網(wǎng)絡得到135 個節(jié)點，其中47 個為化合物成分，88 個為預測靶點。它們由946 條邊相連構成一個完整的網(wǎng)絡，邊代表化合物和靶點的相互作用關系，度值平均值為7，其中度值排名前6 的成分是Nobilin D（果香菊素D，degree=42）、Nobliomethylene（-，degree=38）、decumbic acid B（癸二酸B，degree=33）、(+)-dendrolactone（(+)-樹內酯，degree=32）、(?)-denobilone A（(?)-二苯酮A，degree=30）和 Nobilin（果香菊素，degree=30），度值排名前6 個靶點分別是巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）、雌激素受體 2（ERS2）、芳香化酶（CYP19A1）、人乳腺癌抵抗蛋白（ABCG1）、Toll樣受體9（TLR9）、多巴胺受體-D5 抗原（DRD5），degree分別為37、37、35、33、32、32。

圖1 金釵石斛成分-靶點網(wǎng)絡圖Fig.1 Composition target network of Dendrobium nobile

2.3 靶點-疾病網(wǎng)絡分析

將靶點蛋白導入CTD數(shù)據(jù)庫中進行相關疾病的分析，查詢靶點關聯(lián)的疾病，刪除重復項后，列取前20 種疾病名稱及疾病分類，如表2 所示。再采用Cytoscape 3.6.1 軟件，構建“靶點-疾病”網(wǎng)絡，如圖2所示。

圖2 金釵石斛靶點-疾病網(wǎng)絡圖Fig.2 Target disease network of Dendrobium nobile

表2 金釵石斛前20 個潛在作用靶點疾病名稱及疾病分類Table 2 Disease names and disease classification of the first 20 potential targets of Dendrobium nobile

2.4 金釵石斛作用靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡構建與分析

對金釵石斛成分的潛在作用靶點進行合并整合，同時刪除重復的作用靶點，總共得到88 個靶點蛋白，進一步導入STRING數(shù)據(jù)庫中在線分析，限定人源物種，獲取88 個靶點的相互蛋白作用關系，將結果整合后導入Cytoscape 3.6.1 軟件構建蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡圖，如圖3 所示。PPI網(wǎng)絡共包括84 個節(jié)點，1338 條邊，每一個節(jié)點表示一個靶點蛋白，節(jié)點越大、顏色越紅，正方形越大，其degree值變大；邊表示蛋白之間的關聯(lián)。根據(jù)網(wǎng)絡拓撲學性質，獲得 degree值排前 10 的關鍵蛋白分別為APP（degree=38）、SRC（degree=36）、CASP3（degree=34）、DRD2（degree=34）、TNF（degree=33）、PTGS2（degree=32）、OPRM1（degree=31）、CNR1（degree=31）、ADRA2A（degree=31）、HTR1A（degree=30），表明這些靶點蛋白在PPI網(wǎng)絡圖中的中心度較高，能與多個蛋白發(fā)生相互作用，提示其可能是金釵石斛作用的重要靶點。

圖3 金釵石斛潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡圖Fig.3 PPI network of potential targets of Dendrobium nobile

2.5 GO(Gene ontology)生物進程分析

將金釵石斛作用的88 個靶點進行GO生物進程分析，得到生物進程層級關系（如圖4 所示），共有759 個生物進程，其中排名前10 的生物進程（表3），主要涉及細胞對藥物的反應、痛覺、對雌二醇的反應、肽酰蘇氨酸磷酸化、阿片受體信號通路、慢性炎癥反應等方面，提示金釵石斛可能調控以上生物進程來治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

圖4 靶點的GO生物進程層級關系Fig.4 The hierarchy of go biological process of target

表3 金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病靶點的生物進程分析結果Table 3 Biological process analysis results of Dendrobium nobile in the treatment of nervous system diseases

2.6 KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析

采用DAVID在線分析平臺對金釵石斛作用的88 個靶點進行KEGG通路富集分析，結果如圖5 所示。KEGG的富集程度主要通過影響因子（Rich factor，RF）、P值及參與調控通路上的基因個數(shù)進行綜合分析，其中RF指差異表達的基因中位于該通路條目的基因數(shù)目與所有注釋基因中位于該通路條目的目的基因總數(shù)的比值，富集的程度隨RF大小變化。對結果整合分析發(fā)現(xiàn)靶點主要富集于Sphingolipid signaling pathway、Cocaine addiction以及Serotonergic synapse這三條信號通路。

圖5 前20 個KEGG通路富集氣泡圖（P<0.05）Fig.5 Enrichment bubble diagram of the first 20 KEGG pathways (P<0.05)

2.7 分子對接驗證

為驗證金釵石斛成分預測靶點的準確性，本研究采用AutoDock Vina軟件對11 個degree較大的成分和6 個靶點根據(jù)默認參數(shù)進行分子對接，以結合能（Binding energy）作為篩選條件，結合能越小表明對接結果越好。對于多構象的對接結果，篩選出結合能最低的對接構象，如表4 所示。大部分化合物與分子靶點對接結合能絕對值大于5.0，表明分子對接結果良好，驗證了網(wǎng)絡構建預測的準確性。運用Pymol軟件，根據(jù)結合能的大小選出每個靶點蛋白對接最好的化合物進行可視化分析，結果如圖6 所示，其中ESR2 與化合物C25、MIF與化合物C42、CYP19A1 與化合物C32 均可以形成氫鍵。實驗結果為進一步整合探析金釵石斛的藥效物質提供理論參考。

表4 金釵石斛作用的4 個靶點與11 個成分的分子對接得分Table 4 Molecular docking scores of 4 targets and 11 components of Dendrobium nobile

圖6 ESR2、MIF、ABCG2、CYP19A1 與化合物結合能最低的最佳對接構象Fig.6 The best docking conformation of ESR2,MIF,ABCG2,CYP19A1 and the compounds with the lowest binding energy

3 討論與結論

石斛作為藥用始見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，金釵石斛是藥用石斛主流品種之一，具有益胃生津、滋陰清熱的功效[17?18]。有研究發(fā)現(xiàn)金釵石斛葉總黃酮具有較好的抗氧化、抑制Aβ42 蛋白聚集及螯合金屬離子的能力，體外具有抗AD活性[19]；金釵石斛總堿對APP/PS1 轉基因小鼠空間學習記憶能力具有改善作用[20]。然而其具體作用機制尚不清楚，因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學接和分子對接整合分析。

本研究通過構建多元生物網(wǎng)絡，篩選到金釵石斛活性成分47 個，作用靶點88 個，富集疾病多與帕金森、阿爾茨海默癥及精神、記憶障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關，可能與鞘脂信號通路和5-羥色胺突觸有關。根據(jù)degree的大小，成分-靶點網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)金釵石斛發(fā)揮作用來源的主要活性成分有Nobilin D（degree=42）、Nobliomethylene（degree=38 ）、decumbic acid B（degree=33）、（+）-dendrolactone（degree=32）、（?）-denobilone A（degree=30）和 Nobilin（degree=30）。表明這些成分可能是金釵石斛發(fā)揮治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要藥效物質基礎。上述成分的實驗藥理學結果也進一步佐證了預測，其中有研究發(fā)現(xiàn)Nobliomethylene可顯著增加貓免疫缺陷病毒模型誘導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能病理變化，如腦干聽覺誘發(fā)電位延遲[21]。但其他Nobilin D、decumbic acid B、（+）-dendrolactone、（?）-denobilone A、Nobilin的相關活性尚不清楚，亟需對其潛在靶點進一步驗證分析。進一步探尋這些化合物的靶點發(fā)現(xiàn)，根據(jù)網(wǎng)絡分析可知，金釵石斛這些成分作用的核心靶點包括MIF（degree=37）、ERS2（degree=37）、CYP19A1（degree=35）、ABCG2（degree=33）、TLR9（degree=32）、DRD5（degree=32）等。目前，關于以上主要活性成分作用于核心靶點的研究的文獻報道較少，但分子對接結果顯示，MIF、ERS2、CYP19A1D等核心靶點能夠與Nobliomethylene、decumbic acid B、（?）-denobilone A等主要活性成分較好對接，因此，對金釵石斛中的活性化合物及作用機制值得進一步深入研究。

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis,MS）是一種進行性免疫介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病。隨著時間的推移，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內炎癥和神經(jīng)退行性通路的慢性激活會導致永久性神經(jīng)功能障礙的累積。MIF是一種多功能細胞因子，在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental Allergic Encephalomyelitis,EAE）的MS小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)MIF在調節(jié)炎癥病理發(fā)展中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應器機制中起關鍵作用。在MS腦組織的檢查中，發(fā)現(xiàn)MIF在活躍炎癥區(qū)域高度表達，提示MIF可能對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應有深遠的影響。這些研究說明了MIF在EAE期間促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)巨噬細胞活化和募集的能力：這兩種中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應器機制對EAE進展至關重要。MIF對小膠質細胞具有有效的促炎作用，并使與中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫介導的組織損傷相關的促炎基因表達譜極化[22?24]。有研究發(fā)現(xiàn)AD女性受試者中ESR2 等位基因（s4986938,rs867443）對AD具有顯著的保護作用，相反CYP19A1 的G等位基因（rs11638442,rs11632698）可能提升AD的發(fā)病風險[22]。有研究發(fā)現(xiàn)ABCG2 在人體腦內皮組織高表達，提示其可能與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關[25]。有研究發(fā)現(xiàn)EAE小鼠的發(fā)育過程中，TLR9 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達，且與EAE發(fā)展有關[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，樹突狀細胞的DRD5 受刺激后可增強炎癥，加速EAE的進展，進一步研究發(fā)現(xiàn)EAE小鼠樹突狀細胞中的DRD5 缺乏可導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有炎癥潛能的CD4+T細胞亞群的頻率降低[27]。綜上可知，金釵石斛可通過多靶點治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。此外，通過“化合物-靶點”網(wǎng)絡和“靶點-疾病”網(wǎng)絡整合分析，為后期在各類型神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中，選取具有潛力的活性化合物及靶點進行研究，可進一步有效揭示其分子機制。

本研究基于在線分析系統(tǒng)DAVID進行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，核心靶點主要與3 個通路Sphingolipid signaling pathway、Cocaine addiction以及Serotonergic synapse有關。其中，可卡因通過阻斷多巴胺轉運蛋白并抑制多巴胺再攝取，從而導致突觸間隙中多巴胺持續(xù)作用于DRD1、DRD5 等相應受體，誘發(fā)Cocaine addiction[28]，而核心靶點TLR9 激動劑可拮抗可卡因成癮，并能阻止運動過度效應[29]。核心靶點ABCG2 是重要的ABC轉運蛋白，可通過靶向腦毛細血管內皮細胞內Sphingolipid signaling pathway向P-糖蛋白的信號轉導，提高CNS藥物治療療效[30]。核心靶點MIF和IL-6 等細胞因子可透過受損的血腦屏障，影響多巴胺、五羥色胺和去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質的代謝，引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內的炎性反應[31?33]。

有研究報道AD患者存在Sphingolipid代謝異常，進一步分析發(fā)現(xiàn)淀粉樣β沉積可能促使酸性鞘磷脂酶激活，提示Sphingolipid signaling pathway參與Sphingolipid代謝異?？赡蹵D的發(fā)病機制[34]。有研究發(fā)現(xiàn)Cocaine addiction患者出現(xiàn)包括注意力、學習、記憶等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常，提示Cocaine addiction通路可能參與了Cocaine引起的神經(jīng)毒性[35]。進一步研究發(fā)現(xiàn)Cocaine反復使用會導致神經(jīng)系統(tǒng)生理學和結構的永久性改變，引起精神疾病[36]。有研究發(fā)現(xiàn)Serotonergic synapse通路的一些多功能調節(jié)劑具有神經(jīng)保護、抗炎等潛力，且一種對Serotonergic synapse和多巴胺受體具有高度親和力的血清素轉運體抑制劑-Lumateperone已經(jīng)在癡呆、雙相抑郁疾病上進行臨床試驗[37]。

綜上所述，本研究基于整合網(wǎng)絡藥理學研究方法，通過“成分-靶點”網(wǎng)絡、“靶點-疾病”網(wǎng)絡及KEGG通路富集分析等一系列整合網(wǎng)絡分析，從系統(tǒng)層面揭示金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥效物質基礎及分子機制。但由于網(wǎng)絡預測的局限性，仍需進一步實驗對其關鍵成分及靶點進行驗證，為后續(xù)深入研究金釵石斛治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥效物質基礎及分子機制提供參考。