陳 明，方希修，嚴(yán)雅瑤

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

耳葉牛皮消又稱濱海白首烏，為蘿摩科鵝絨藤屬耳葉牛皮消種，是中國歷史上較為珍貴的中藥保健品，耳葉牛皮消的藥理成分主要包括C21甾苷、多糖、多肽、氨基酸、脂類（磷脂、揮發(fā)油、不飽和氨基酸、苯乙酮類化合物）等（孫彥敏等，2015），其入口微甜后甘苦、藥性微溫，可提升機(jī)體特異性及非特異性免疫力，還可增強(qiáng)氣血、促進(jìn)開胃消食、解毒化瘀。

本試驗(yàn)選擇耳葉牛皮消粉加工過程中的廢渣廢水（耳葉牛皮消二級漿）為原料，選用各種芽孢桿菌、乳酸菌屬細(xì)菌菌株的最佳培養(yǎng)基（焉兆萍等，2019；李慧芬，2018；王德培等，2011），菌種經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)大后接種到以耳葉牛皮消二級漿為原料的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中。最終根據(jù)發(fā)酵液中的粗蛋白質(zhì)含量分析出耳葉牛皮消二級漿最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料及菌種 新鮮耳葉牛皮消由江蘇康諾農(nóng)業(yè)有限公司市場采購；鮮牛奶（脫脂），蔗糖（食品級），泰州某超市購買；微生物菌制劑、芽孢桿菌、鏈球菌、乳桿菌及乳酸菌由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院微生物飼料與營養(yǎng)研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：胰胨10 g，牛肉膏5.0 g，酵母膏5.0g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL。設(shè)置pH為（7.2～7.4）。高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，設(shè)置溫度為121℃，設(shè)置時(shí)間為20 min，最后滅菌后冷卻備用。

保加利亞乳桿菌（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：胰胨10 g，牛肉膏5.0g，酵母膏5.0 g，葡萄糖5.0 g，吐溫80 1.0 g，L-半胱氨酸0.1 g，檸檬酸鈉1.0 g，硫酸鎂0.6 g，硫酸錳 0.3 g，蒸餾水1000 mL（李慧 芬，2018）。設(shè) 置pH為（6.8～7.0）。高 壓 蒸汽滅菌鍋滅菌，設(shè)置溫度為121℃，設(shè)置時(shí)間為 15 min，最后滅菌后冷卻備用。

嗜酸乳酸菌、嗜熱鏈球菌用培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：胰胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二銨2 g，硫酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.6 g，硫酸錳0.3 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1000 mL。設(shè)置pH為（6.2～6.4）。高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，設(shè)置溫度為121℃，設(shè)置時(shí)間為15 min，最后滅菌后冷卻備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固態(tài)復(fù)合微生物制劑的制備 制備流程見圖1。

圖1 固態(tài)復(fù)合微生物制劑的制備流程

將培養(yǎng)的二代乳酸菌菌株接種到乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種條件為厭氧。接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基的5%，隨后混勻、靜置、密封發(fā)酵2.5 d，備用。

將培養(yǎng)的二代芽孢桿菌菌株接種到芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，提供一定濃度的氧氣。接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基的5%，隨后混勻、靜置、發(fā)酵2.5 d，備用。

1.2.2 耳葉牛皮消二級漿的制備流程

耳葉牛皮消二級漿的制備流程見圖2，通常在秋末冬初選購耳葉牛皮消。選擇直徑大于0.8cm，外觀完整、新鮮、無霉變、無病斑的作為原料。耳葉牛皮消清洗之后放入低速滾筒去皮機(jī)中，勻速加注耳葉牛皮消原料體積3倍量的清水，翻滾30 min完成去皮。去皮后將新鮮白首烏放入粉碎機(jī)中按一定比例進(jìn)行注水搗碎，過濾。過濾好的漿放入沉淀桶中沉淀1 d左右，待分層后，棄去上層透明清水層，收集中間灰白層，棄去底層乳白淀粉層。重復(fù)步驟沉淀、收集2～3次，即得到較為純粹的耳葉牛皮消二級漿，接著放入烘箱烘干成塊并過30目篩，最后滅菌冷卻后保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 耳葉牛皮消二級漿的制備流程

1.2.4 活菌數(shù)的測定 在超凈工作臺下進(jìn)行無菌操作，用滴管吸取一定量的發(fā)酵液移入無菌干燥試管內(nèi)，混合無菌生理鹽水或其他滅菌稀釋液，充分混勻。復(fù)合微生物制劑活菌數(shù)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；發(fā)酵后活菌數(shù)用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，將細(xì)菌培養(yǎng)液用涂布器置于MRS瓊脂（3%）平板上，隨后覆蓋一層薄薄的營養(yǎng)瓊脂，靜置。待營養(yǎng)瓊脂完全凝固，即可將平板倒扣。放入恒溫箱中培養(yǎng)，設(shè)置溫度時(shí)間。最終根據(jù)固體培養(yǎng)皿上的微生物菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5 理化指標(biāo)

1.2.5.1 蛋白質(zhì)的測定 量取充分混勻的耳葉牛皮消發(fā)酵液至干燥的消化管內(nèi)，加入硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸等試劑，將消化管放入消化爐中消化，使用全自動(dòng)凱氏定氮儀，實(shí)現(xiàn)加液、蒸餾、滴定和記錄等操作。

1.2.5.2 總酸的測定 根據(jù)酸堿中和的特性，在無菌干燥的錐形瓶中加入一定量發(fā)酵液和酚酞指示劑備用。將堿液置于滴定管中進(jìn)行滴定，觀察溶液顏色變化，試驗(yàn)進(jìn)行3次，減少誤差，最后記錄堿液的消耗量，計(jì)算出總酸含量。

1.2.5.3 脂肪的測定 通過低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑萃取的方法測定脂肪，選擇石油醚作為萃取劑，量取一定量的發(fā)酵液，混合海沙一同置于無菌干燥的蒸發(fā)皿中，將蒸發(fā)皿置于沸水中加熱，使發(fā)酵液蒸干。隨后將各蒸發(fā)皿放入干燥箱中，設(shè)置溫度與時(shí)間，干燥結(jié)束后冷卻、研細(xì)，后移入濾紙包，用石油醚溶液進(jìn)行抽提，最后蒸干稱重，計(jì)算可得脂肪含量。

1.2.6 微生物指標(biāo) 總菌數(shù)、大腸桿菌均采用平板計(jì)數(shù)法，其他致病菌如沙門氏菌的檢測需通過平板分離后進(jìn)行生化鑒定實(shí)驗(yàn)和血清檢測才能最終鑒定成功（梁智安，2011）。

1.3 數(shù)據(jù)整理采用L9（34）正交表作正交試驗(yàn)，以粗蛋白質(zhì)含量（CP%）為指標(biāo)，采用SPSS19.0分析因變量的影響程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)復(fù)合微生物制劑中活細(xì)菌數(shù)含量通過制作發(fā)酵菌株的最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)增的二代細(xì)菌，各菌種主要包括嗜酸乳酸菌（36%）、保加利亞乳桿菌（20%）、枯草芽孢桿菌（18%）、嗜熱鏈球菌（16%）、蠟狀芽孢桿菌（10%），每克復(fù)合微生物菌劑的有效活菌數(shù)為3.09×109，各菌按照比例其數(shù)量如下：1.11×109（嗜酸乳酸菌）、0.62×109（保加利亞乳桿菌）、0.56×109（枯草芽孢桿菌）、0.49×109（嗜熱鏈球菌）、0.31×109（蠟狀芽孢桿菌）。結(jié)果表明，復(fù)合微生物菌劑中的活菌可進(jìn)行正常的新陳代謝，從而在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)發(fā)揮促進(jìn)作用。

2.2 耳葉牛皮消二級漿發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化采用L9（34）正交表，以發(fā)酵液中粗蛋白質(zhì)含量（CP%）為指標(biāo)，優(yōu)化發(fā)酵條件，并通過極差分析評價(jià)影響產(chǎn)品質(zhì)量的因素程度。因素和水平如表1所示，根據(jù)CP確定白首烏二級漿發(fā)酵的最佳工藝條件，結(jié)果見表2、表3。

表2 白首烏二級漿發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果

表3 白首烏二級漿發(fā)酵條件優(yōu)化的方差分析

由表1、表2可知，發(fā)酵溫度（A）為30%、發(fā)酵時(shí)間（B）為24 h、復(fù)合微生物制劑添加量為1.5%時(shí)，發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量最高為3.89%，可見該組為最佳搭配。根據(jù)表格中所計(jì)算的極差可知：A＞B＞C，表明發(fā)酵效果中的主要影響因素為A，其次為B，C影響效果最小。即發(fā)酵溫度對液體中蛋白質(zhì)量影響最大，其次為發(fā)酵時(shí)間和微生物添加量。對表格整體分析可知，耳葉牛皮消二級漿發(fā)酵條件可設(shè)定為A2（30℃）、B2（24 h）、C2（1.5%），此發(fā)酵條件下發(fā)酵液的營養(yǎng)價(jià)值最高。

2.3 質(zhì)量指標(biāo)

2.3.1 感觀指標(biāo) 樣品液呈奶白色，黏稠均勻，濃度適中，風(fēng)味有濃郁的酸乳香味和白首烏特有的香味，無酸臭異味；口感自然爽滑，細(xì)膩溫和。表面無乳清、結(jié)塊析出，無分層渾濁等異常現(xiàn)象。

2.3.2 理化指標(biāo) 蛋白質(zhì)2.78 g、酸度56.9° T、脂肪2.35 g。

2.3.3 微生物指標(biāo) 發(fā)酵液中細(xì)菌總數(shù)≤62 CFU/mL、大腸桿菌＜28 MPN/100mL、致病菌數(shù)未檢出。

3 討論

目前國內(nèi)耳葉牛皮消的市場空前膨脹，但其生產(chǎn)研發(fā)程度不高。傳統(tǒng)耳葉牛皮消粉的加工材料大部分為淀粉，而活性成分C21甾苷、多糖、揮發(fā)油、各種氨基酸等在加工過程中流失于廢渣和廢水中。現(xiàn)代藥理研究表明，甾苷類物質(zhì)擴(kuò)散至細(xì)胞內(nèi)可清除自由基，增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性，從而提升機(jī)體非特異性及特異性免疫力，增強(qiáng)機(jī)體監(jiān)測系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的識別，進(jìn)而抑制腫瘤；脂類等物質(zhì)大多數(shù)為揮發(fā)性脂肪酸，分子量較小機(jī)體易于吸收，可降低膽固醇。耳葉牛皮消二級漿的排放不但給環(huán)境帶來了巨大壓力，更重要的是浪費(fèi)了耳葉牛皮消的藥用價(jià)值。需要開展變“廢”為寶的創(chuàng)新性研究，發(fā)揮耳葉牛皮消廢渣廢水中活性物質(zhì)的藥用價(jià)值是本試驗(yàn)的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

試驗(yàn)根據(jù)不同菌株的生化特點(diǎn)（好氧菌、厭氧菌）制備不同的培養(yǎng)基進(jìn)行菌株擴(kuò)大，又將各二級菌進(jìn)行配合制成復(fù)合微生物制劑。耳葉牛皮消二級漿的最佳發(fā)酵條件是發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時(shí)間為24 h、復(fù)合微生物制劑接種量為1.5%時(shí)，發(fā)酵后二級漿粗蛋白質(zhì)含量（%）最高為3.89。