孔曉蕓 繆 旭 張冬梅 崔恒祥 施 健 劉念念

南通大學第二附屬醫(yī)院，江蘇南通，226000

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細胞，是最常見的皮膚惡性腫瘤之一，占所有皮膚惡性腫瘤的20%[1]，具有較強的遷移力和侵襲性。日光性角化病(actinic keratosis, AK)被認為是CSCC的癌前病變，鮑溫病(Bowen’s disease, BD)則是表皮全層角質(zhì)形成細胞不典型增生的原位CSCC[2]，兩者均可向CSCC轉(zhuǎn)化。CSCC的病因主要包括紫外線輻射、免疫抑制、HPV感染等，目前局部外科手術(shù)為最常用的治療方法[3]，但部分患者存在復發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡的不良預后，并且其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，因此對于CSCC的治療在臨床中仍然面臨挑戰(zhàn)。抗增殖蛋白2(prohibitins 2, PHB2)屬于抗增殖蛋白家族，是一類高度保守并廣泛表達的蛋白，具有多種生物學功能，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、維持線粒體功能、調(diào)節(jié)細胞增殖等[4]，并且在食管鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中已有相關(guān)研究[5-8]，證實了PHB2在癌癥組織及細胞中存在差異表達，并參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學過程，而對于PHB2在CSCC中的研究國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。CSCC是具有高度突變性的人類癌癥之一，其致病相關(guān)分子基礎(chǔ)的研究有助于我們更深入地了解并開發(fā)新的治療靶點。蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT)的過度活化是人類惡性腫瘤的常見分子特征，研究發(fā)現(xiàn)AKT和PHB2在細胞內(nèi)定位及功能中存在重疊，參與不同腫瘤發(fā)展過程。本研究通過免疫組織化學的方法研究了PHB2在CSCC、BD、AK以及正常皮膚組織(normal tissue, NT)中的表達情況，分析其在CSCC中的表達與臨床資料的相關(guān)性，并研究了PHB2敲除對CSCC細胞A431細胞增殖的影響，對AKT的蛋白表達及其磷酸化產(chǎn)物水平進行分析，以初步闡述這種調(diào)控效應(yīng)產(chǎn)生的分子機制，為CSCC的靶向治療提供可能的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2015年3月至2020年8月南通大學第二附屬醫(yī)院皮膚科資料完整且病理診斷明確的標本蠟塊，其中AK組織17例，BD組織18例，CSCC組織40例，NT 9例，所有患者術(shù)前均未經(jīng)過放療、化療或光動力等治療，記錄患者一般信息，CSCC組織病理分級為高、中、低分化，Broder分級為I至IV級：I級，未分化細胞數(shù)<25%；II級，未分化細胞數(shù)25%～50%；III級，未分化細胞數(shù)50%～70%；IV級，未分化細胞數(shù)>70%。

1.2 主要試劑 免疫組化試劑盒(#SP-9000,北京中杉金橋)，人CSCC細胞株A431(#ZQ0043，上海中喬新舟)，兔抗人PHB2多克隆抗體(#12295-1-AP，武漢Proteintech)、鼠抗β-actin抗體(#20536-1-AP，武漢Proteintech)，CCK8試劑盒(#PF00004，武漢Proteintech)，AKT抗體(#9272s，美國CST)，p-AKT抗體(#4060L，美國CST)，DMEM培養(yǎng)基(#C11995500BT，美國Gibco)，0.25%胰蛋白酶(#25200-056，美國Gibco)，胎牛血清(#A511-001，烏拉圭lonsera)，100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素雙抗(#C0222，江蘇碧云天)、蛋白上樣緩沖液(2×)(#P0015B，江蘇碧云天)、化學發(fā)光試劑盒(#P0018S，江蘇碧云天)、嘌呤霉素(#ST551，江蘇碧云天)，PAGE凝膠快速制備試劑盒(#PG113，上海雅酶)，Lipofectamine 2000試劑(#11668019，美國Invitrogen)，質(zhì)粒小提試劑盒(#D6943-03，美國Omega)，膠回收試劑盒(#D0056，江蘇碧云天)，EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶(#R3101S，美國Biolab)，CutSmart Buffer(#B7204S，美國Biolab)，6xDNA上樣染料(#R1161，美國Thermo Scientific)，T4 DNA連接酶(#D2011A，日本Takara)。人胚腎細胞HEK293T、感受態(tài)細胞DH5α、慢病毒載體系統(tǒng)lentiCRISPR v2、psPAX2、pMD2.G均為本實驗室保存。

1.3 主要儀器 切片機(RM2245，德國Leica)，烘片機(HI1220，德國Leica)，攤片機(HI1210，德國Leica)，離心機(5424R，德國Eppendorf)，電熱恒溫鼓風干燥箱(DK-500S，上海精宏)、電熱恒溫水浴箱(DK-500S，上海精宏)，顯微鏡(ECLIPSE Ni-U，日本Nikon)，蛋白電泳儀(PowerPac Basic Power Supply，美國BIO-RAD)，凝膠采集成像系統(tǒng)(Chemi Doc MP，美國BIO-RAD)、PCR儀(T100，美國BIO-RAD)，電熱恒溫細胞培養(yǎng)箱(HERACELL 240i，美國Thermo Scientific)，微量分光光度計(Nanodrop one，美國Thermo Scientific)，搖床(TS-92，江蘇其林貝爾)，恒溫金屬浴儀(#K30，北京佳源興業(yè))，震蕩培養(yǎng)箱(ZQZY-85CN，上海知楚)，多功能微孔板檢測儀(H1M，美國Biotek)。

1.4 實驗方法

1.4.1 免疫組織化學染色 切片機切取4 μm厚石蠟組織切片，粘貼于載玻片上，60℃烘箱烘片30 min，經(jīng)松節(jié)油、梯度濃度酒精脫蠟后于檸檬酸鹽溶液中進行高壓抗原修復，冷卻后PBS沖洗3次，滴加過氧化物酶封閉30 min，PBS沖洗3次，甩干后滴加PHB2抗體，4℃濕盒孵育過夜，次日室溫復溫1 h，滴加二抗，37℃烘箱放置30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，經(jīng)梯度濃度酒精脫水、松節(jié)油透明，中性樹膠封片。

1.4.2 判讀方法 免疫組織化學結(jié)果采用半定量評分法。將染色后的切片置于顯微鏡下觀察，在40倍物鏡下隨機挑選5個視野，計數(shù)陽性細胞百分比(<25%為1分、25%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分)及染色強度(無色為0分、淡黃色為1分、黃色為2分、棕黃色或棕色為3分)，兩者乘積即為其免疫組織化學評分，按其評分分為陰性(-，0～3分)，弱陽性(+，4～6分)，陽性(++，7～9分)，強陽性(+++，10～12分)。其中陰性、弱陽性表達按低表達計，陽性、強陽性表達按高表達計。

1.4.3 gRNA設(shè)計 利用NCBI獲得PHB2完整基因序列，利用CRISPER線上設(shè)計工具依據(jù)設(shè)計原則[9]，最終選擇該基因的299 bp及320 bp起始的序列作為sgRNA構(gòu)建兩組敲除PHB2-sgRNA表達質(zhì)粒。設(shè)計序列分別為：sgRNA-KO299 5'-GGGAGATATTCACCATCTGT-3'；sgRNA-KO320 5'-TGGGTCGAGACAACACTCGC-3'。開始堿基不是G，則在最前加入堿基G，在正向序列前加入堿基CACC，在反向序列前加入堿基AAAC。

1.4.4 表達載體構(gòu)建 由擎科生物公司合成sgRNA，將引物經(jīng)過退火后，形成具有黏性末端的雙鏈DNA，利用EcoRI核酸內(nèi)切酶得到酶切產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳鑒定、膠回收，得到gRNA/cas9質(zhì)粒與雙鏈DNA進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，搖菌、培養(yǎng)獲得單克隆，質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒獲得重組表達載體lentiCRISPRv2-PHB2-KO。

1.4.5 細胞培養(yǎng) 將A431細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，放入37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，定期換液。

1.4.6 嘌呤霉素濃度篩選 在6孔板內(nèi)每孔種1.5×105個293T細胞，次日起更換按照濃度梯度(0.4 μg/mL、0.6 μg/mL、0.8 μg/mL、1.0 μg/mL、1.2 μg/mL、1.5 μg/mL)制備的含有嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，將3天后細胞全部死亡的劑量作為嘌呤霉素篩選濃度。

1.4.7 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期293T細胞移植于培養(yǎng)皿中，待細胞生長至融合度達80%以上時，轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000操作說明，將慢病毒gRNA/cas9載體(Addgene-52961，Zhangfeng Lab)包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G一起轉(zhuǎn)染到293T細胞中，6～8 h后換液。

1.4.8 細胞感染及篩選 取對數(shù)生長期A431細胞移植于培養(yǎng)皿中，待細胞生長至融合度達40%～50%時，開始進行感染。293T細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用0.45 μm分離的濾器過濾，收集含病毒上清，每個10 cm培養(yǎng)皿中加10 mL含病毒上清液，加入嘌呤霉素(根據(jù)預實驗最佳篩選濃度1.0 μg/mL)進行藥物篩選。

1.4.9 CCK8細胞計數(shù)實驗 取感染篩選后A431細胞(PHB2敲除組與對照組)分別移植于96孔板，細胞數(shù)為3000個/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，酶標儀測定450 nm處的OD值。實驗重復3次。

1.4.10 細胞克隆形成實驗 取感染篩選后A431細胞(PHB2敲除組與對照組)分別移植于35 mm培養(yǎng)皿，細胞數(shù)為50個/皿，繼續(xù)培養(yǎng)2周，肉眼觀察培養(yǎng)皿中出現(xiàn)克隆后中止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，計算克隆形成數(shù)。實驗重復3次。

1.4.11 免疫印跡檢測蛋白表達 取蛋白質(zhì)樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，膜使用相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加入二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，暗室顯影，采用Image J分析軟件處理，測定各組蛋白條帶灰度值，以目的條帶和內(nèi)參條帶的比值作為蛋白表達水平(或p-AKT和AKT條帶的比值)。每個蛋白樣品重復3次。

2 結(jié)果

2.1 PHB2在CSCC、BD、AK及NT組織中的表達情況 免疫組織化學染色結(jié)果顯示，PHB2的表達定位大多位于細胞核，少量定位于胞質(zhì)中。在NT中PHB2少量表達于表皮基底層細胞中，在AK中主要表達于基底層及棘層中下1/3細胞的細胞中，在BD中主要表達于表皮全層非典型性增生角質(zhì)形成細胞中，在CSCC中主要在鱗狀細胞癌巢中彌漫表達(圖1a)。根據(jù)陽性細胞百分比及染色強度進行免疫組化組織學評分，并把陽性、強陽性表達定義為高表達，PHB2在CSCC、BD、AK及NT組織中的高表達率依次為90.00%、66.70%、41.18%、0.00%(圖1b)，可見PHB2的表達在四組之間呈現(xiàn)逐漸遞增的表達趨勢，有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，見表1。接下來對兩兩組間進行表達強度比較，結(jié)果提示AK與NT、BD與NT、CSCC與NT以及AK與CSCC之間表達強度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明了PHB2在CSCC、BD、AK組織中的表達均顯著高于NT組織，并且CSCC組織中的表達顯著高于AK組織，見表2。

1a：免疫組化結(jié)果(SP法，×400)；1b： PHB2在四組中的高表達率

表1 PHB2在NT、AK、BD、CSCC組織中的表達差異

表2 PHB2在NT、AK、BD、CSCC組織中的表達強度比較

2.2 PHB2在CSCC中的表達與臨床病理參數(shù)相關(guān)性 PHB2表達與性別、年齡、部位、病程、腫瘤直徑、浸潤深度、分化、Broder分級等臨床病理資料均無顯著相關(guān)性(P>0.05)，見表3。

表3 CSCC組織標本中PHB2的表達與臨床特征的關(guān)系

2.3 構(gòu)建PHB2敲除的CSCC細胞A431細胞 運用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了兩組靶向敲除PHB2的CSCC A431細胞(KO299組以及KO320組)，以空載體轉(zhuǎn)染的NC組為對照細胞。Western印記結(jié)果顯示，NC組與KO299組PHB2與內(nèi)參β-actin比率為1.478±0.276和0.461±0.165，t=5.485，P<0.01；NC組與KO320組PHB2與內(nèi)參β-actin比率為1.565±0.413和0.658±0.070，t=3.752，P<0.05，均有統(tǒng)計學差異，驗證了PHB2的敲除效果，見圖2。

圖2 Western印跡法分析PHB2蛋白在敲除組與對照組細胞中的表達情況(***，P<0.05)

2.4 PHB2敲除對CSCC細胞A431細胞增殖的影響 通過CRISPR-Cas9法構(gòu)建了兩組靶向敲除PHB2的CSCC細胞A431細胞模型(KO299組以及KO320組)，以空載體轉(zhuǎn)染的NC組為對照細胞。CCK8細胞增殖實驗結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)24 h后，NC組細胞相對活力為0.996±0.144，兩組敲除組中，KO299組細胞相對活力為0.339±0.023，與NC組比較A431細胞活力顯著下降，t=7.820，P<0.01；KO320組細胞相對活力為0.475±0.079，與NC組比較A431細胞活力顯著下降，t=5.502，P<0.01，見圖3。細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)2周后，NC組細胞克隆形成數(shù)為139.333±24.947，兩組敲除組中，KO299組細胞克隆形成數(shù)為41.667±5.132，與NC組比較細胞克隆形成數(shù)顯著下降，t=6.642，P<0.01；KO320組細胞克隆形成數(shù)為42.667±9.292，與NC組比較細胞克隆形成數(shù)顯著下降，t=6.290，P<0.01，見圖4。

圖3 CCK8細胞增殖實驗驗證PHB2敲除對A431細胞增殖的影響(***，與NC組比較P<0.01)圖4 細胞克隆形成實驗驗證PHB2敲除對A431細胞增殖的影響(***，與NC組比較P<0.01)

2.5 PHB2敲除對AKT蛋白磷酸化的影響 Western印跡結(jié)果驗證了NC組與KO299組之間的p-AKTSer473/AKT比率分別為1.319±0.283和0.387±0.081，t=5.472，P<0.01；NC組與KO320組之間的p-AKTSer473/AKT比率分別為1.383±0.242和0.648±0.031，t=5.221，P<0.01，初步說明了p-AKT表達隨PHB2表達水平的降低而顯著下調(diào)，見圖5。

圖5 Western印跡法分析PHB2敲除對A431細胞AKT蛋白表達及其ser473位點磷酸化產(chǎn)物水平的影響(***，P<0.01)

3 討論

抗增殖蛋白家族包括PHB1以及PHB2，均在生物體細胞內(nèi)分布廣泛，包括細胞核、線粒體和細胞質(zhì)，不同的亞細胞定位使其表現(xiàn)出獨特的生物學功能，在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、核信號傳導、維持線粒體結(jié)構(gòu)與功能、細胞增殖與凋亡中產(chǎn)生重要作用，在癌癥、神經(jīng)肌肉病變和其他代謝性疾病等病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的作用[10-12]。目前，PHB2對于腫瘤的調(diào)控機制尚存在爭議，一種解釋是腫瘤細胞通過提高線粒體呼吸作用維持能量代謝，導致線粒體受到氧化損傷，而線粒體中PHB2的增加提高了腫瘤細胞線粒體的穩(wěn)定性，另一種解釋則是細胞核定位的PHB2可以直接或間接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡、細胞周期等[4]。來自癌癥基因組圖譜和人類蛋白質(zhì)圖譜的數(shù)據(jù)表明，PHB2在食管鱗癌、前列腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤中均在mRNA和蛋白質(zhì)水平上廣泛表達，促進相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

在食管鱗狀細胞癌中，2018年Cai等[5]對229例患者通過免疫組織化學證實了腫瘤組織中的PHB2表達明顯高于癌旁組織，臨床病理特征中，PHB2的表達與年齡、性別、腫瘤分化、TMN分期等因素無關(guān)，高水平的PHB2表達與總生存期相關(guān)，提示PHB2的低表達可能提高了食管鱗癌患者的總生存期。本研究中，我們對CSCC、BD、AK組織石蠟切片進行免疫組織化學染色，觀察到了PHB2主要的胞核以及少量胞質(zhì)定位，在CSCC癌巢細胞中呈現(xiàn)彌漫表達，其表達與正常組織之間有顯著差異。此外，AK及BD作為臨床上有可能向CSCC演化的疾病，其組織中PHB2表達也高于正常組織。在臨床病理資料方面，我們結(jié)果表明PHB2與年齡、性別、腫瘤直徑及分化程度等臨床病理特征沒有顯著相關(guān)，我們推測其可能原因是PHB2與CSCC的發(fā)生相關(guān)，而不參與其惡性發(fā)展，需后期擴大樣本量進一步證實。

PHB2在許多腫瘤細胞如食管鱗癌、乳腺癌、前列腺癌等中高表達[5,7,8]，在肝細胞癌細胞中，PHB2的表達在腫瘤早期上調(diào)，而在晚期表達下調(diào)[13]。在細胞生物學功能方面，已有研究通過siRNA建立PHB2敲減的食管鱗癌細胞模型，細胞計數(shù)和transwell實驗證實了PHB2的敲減可以抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲能力[5]。在2017年Shen等[8]對前列腺癌的研究中，以siRNA干擾PHB2表達，通過細胞劃痕及transwell實驗證實了PHB2的表達敲減可以抑制腫瘤細胞的遷移。在CSCC中，通過CCK8細胞增殖實驗和細胞克隆形成實驗，我們同樣發(fā)現(xiàn)PHB2敲除后，A431細胞的增殖能力顯著降低，此結(jié)果初步證實了PHB2與CSCC的發(fā)生相關(guān)。

AKT是PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路中重要的蛋白激酶，為PI3K下游的靶分子之一，Ser473是其主要的磷酸化位點之一[14]，其在細胞存活和凋亡中起重要作用，研究證實，AKT相關(guān)通路的激活在CSCC發(fā)生發(fā)展中起重要作用[15]。值得注意的是AKT和PHB2在細胞內(nèi)定位以及調(diào)節(jié)細胞功能過程中存在一些重疊，表明它們之間可能存在潛在的功能相關(guān)性。在食管鱗癌中，PHB2通過增加p-AKT的表達促進了腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[5]。在前列腺癌中，已有研究證實了PHB2可能通過抑制AKT2的表達來促進腫瘤細胞遷移[8]。在CSCC的A431細胞中，我們的研究發(fā)現(xiàn)，PHB2敲除抑制了腫瘤細胞增殖能力，并且p-AKT表達顯著降低，因此，PHB2可能通過調(diào)節(jié)AKT蛋白活化從而影響CSCC的發(fā)生。

綜上所述，PHB2在CSCC組織中較正常組織表達上調(diào)，可能與CSCC的發(fā)生相關(guān)。此外，PHB2可以促進CSCC腫瘤細胞增殖，其機制可能與促癌基因AKT蛋白活化相關(guān)。本研究為CSCC的治療靶點提供了理論基礎(chǔ)，但需進一步擴大臨床樣本量、就分子機制進行更加深入的研究，為設(shè)計具有臨床價值的治療CSCC的靶向藥物奠定基礎(chǔ)。