繆夢(mèng)宇 王真真 孫樂樂 劉 紅 張福仁

1濱州醫(yī)學(xué)院，山東煙臺(tái)，264003；2山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院,山東省皮膚病性病防治研究所)，山東濟(jì)南，250022

反常性痤瘡(acne inversa, AI)，又名毛囊閉鎖三聯(lián)征，是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、消耗性的皮膚毛囊疾病，1839年Velpeau等首次報(bào)道并描述，1975年P(guān)lewig等[1]提出反常性痤瘡的命名。國(guó)外報(bào)道，AI發(fā)病率從1/103～40/103不等[2]，女性多于男性，臨床表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性的排出性竇道和膿腫后疤痕形成，主要好發(fā)于大汗腺區(qū)，常累及腋窩、腹股溝、肛門及生殖器等褶皺部位。吸煙、肥胖、飲酒和衣物摩擦等是該病的危險(xiǎn)因素[3]，可伴發(fā)鱗癌、關(guān)節(jié)炎、角膜炎-魚鱗病-耳聾綜合征、克羅恩病等[4]。研究已經(jīng)證實(shí)，約40%AI患者有家族遺傳史[5]，屬常染色體顯性遺傳，2010年Wang等[6]首次確定AI的致病基因?yàn)镻SENEN、PSEN1和NCSTN。迄今，已報(bào)道至少18個(gè)AI家系及4例散發(fā)病例的22個(gè)致病突變位點(diǎn)[7,8]。本研究中，收集到1家系并通過全基因組外顯子測(cè)序和Sanger測(cè)序確定了NCSTN基因的1個(gè)新的突變位點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究的4例AI患者來自山東省的1個(gè)反常性痤瘡家系，在山東省皮膚病醫(yī)院就診，臨床表現(xiàn)和組織病理符合AI[7]。該家系共3代13人(圖1)，其中患者5例(1男4女)，在世患者4例，符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。先證者，女，49歲，有34年的炎性丘疹、膿皰、膿腫和遍及背部的增生性瘢痕病史，尤其頸部較為嚴(yán)重(圖2)。既往史和個(gè)人史無特殊，父母及家系內(nèi)無近親結(jié)婚。體格檢查：一般狀況良好，心肺腹未見明顯異常。皮膚科檢查：背部可見散在的凹陷性疤痕及條索狀不規(guī)則的增生性瘢痕，頸部可見囊腫、膿腫、糜爛及滲出。先證者母親(I2)、哥哥(II3)和侄女(III2)軀干部均與先證者有相似的臨床表現(xiàn)，先證者侄女癥狀較輕，考慮可能與該患者年齡較小有關(guān)。組織學(xué)檢查：送檢為鱗狀上皮及多量炎性肉芽組織，可見表皮角化過度、灶性角化不全，棘層增厚，真皮內(nèi)膠原纖維增生，血管周圍大量急慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 家系圖

圖2 2a：頸部可見糜爛、滲出、膿腫及囊腫；2b、2c：背部可見凹陷性疤痕，條索狀不規(guī)則的增生性瘢痕及散在分布的囊腫

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 共收集4例AI患者，9名健康親屬及100名健康對(duì)照者的外周血5 mL。使用Biorupter(Diagenode，比利時(shí))從外周全血DNA提取，并使用全波長(zhǎng)紫外/可見光掃描分光光度計(jì)(NanoDrop公司，ND-8000)進(jìn)行DNA含量及純度測(cè)定。研究經(jīng)山東省皮膚病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2014-KYKT-23)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2.2 全基因組外顯子測(cè)序 對(duì)先證者外周血DNA進(jìn)行全基因組外顯子測(cè)序。首先使用AIExome Enrichment Kit V4試劑盒(艾吉泰康生物科技北京有限公司)捕獲完整的外顯子及相鄰內(nèi)含子區(qū)域,后通過Illumina HiSeq 6000平臺(tái)對(duì)基因組文庫(kù)進(jìn)行高通量、高深度測(cè)序。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)FastQC v0.11.8檢測(cè)質(zhì)量后，使用TRIMMOMIC v0.38軟件將數(shù)據(jù)進(jìn)行修剪過濾，最終篩選出來的數(shù)據(jù)通過BWA v0.7.17軟件比對(duì)到hg19版本的參考基因組，比對(duì)好的數(shù)據(jù)用GATK v4.0.12.0軟件進(jìn)行突變位點(diǎn)尋找，所有的突變位點(diǎn)用ANNOVAR進(jìn)行注釋。

1.2.3 DNA測(cè)序驗(yàn)證突變 根據(jù)先證者全基因組外顯子測(cè)序獲得的致病基因上突變，對(duì)收集的其他血液DNA樣本進(jìn)行突變位點(diǎn)的Sanger測(cè)序驗(yàn)證。對(duì)篩選出的突變位點(diǎn)所在的基因序列區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用網(wǎng)頁(yè)版BLAST軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)待擴(kuò)增區(qū)域序列的引物序列：NCSTN-F:GGAAACACGAACTTCCGGTC，NCSTN-R: ACTTCTGTCGTGGGAACGAA，交由北京華大基因科技有限公司合成。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s、61℃退火45 s、72℃延伸1 min共35個(gè)循環(huán)，之后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳切膠純化后，直接在ABI 3500Xl Dx Genetic Analyzer測(cè)序儀(Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行測(cè)序，并運(yùn)用Chromas軟件與NCSTN基因參考序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 AI患者外顯子測(cè)序分析 注釋后的結(jié)果顯示，該患者未在已報(bào)道致病基因PSENEN和PSEN1上攜帶致病突變；在AI相關(guān)致病基因NCSTN上攜帶突變位點(diǎn)c.85+2T>C，該位點(diǎn)位于第1號(hào)外顯子與1號(hào)內(nèi)含子交界處(圖3)，dbscSNV軟件預(yù)測(cè)該突變位點(diǎn)分值為0.99，提示該位點(diǎn)可導(dǎo)致剪切異常為有害變異。這一突變?cè)谒膫€(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)[dpSNP142, 1000 Genomes Project, HapMap and Exome Aggregation Consortium (ExAC, http://exac.broadinstitute. org/)]中均不存在。

2.2 Sanger測(cè)序驗(yàn)證突變 對(duì)家系中全部4例AI患者(I2、II3、II5、III2)、9名健康親屬(II2、II4、II6、III1、III3、III4、III5、III6、III7)以及100名健康對(duì)照者的DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過Sanger測(cè)序?qū)CSTN基因的新突變進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，該家系的其余3例患者均攜帶同一突變(NCSTN c.85+2T>C)，家系中9名健康親屬以及100名健康對(duì)照者中均未發(fā)現(xiàn)該突變。

3a：I2患者1號(hào)外顯子與1號(hào)內(nèi)含子交界處存在一個(gè)剪接位點(diǎn)突變c.85+2T>C；3b：II3患者1號(hào)外顯子與1號(hào)內(nèi)含子交界處存在一個(gè)剪接位點(diǎn)突變c.85+2T>C；3c：II5患者1號(hào)外顯子與1號(hào)內(nèi)含子交界處存在一個(gè)剪接位點(diǎn)突變c.85+2T>C；3d：III2患者1號(hào)外顯子與1號(hào)內(nèi)含子交界處存在一個(gè)剪接位點(diǎn)突變c.85+2T>C；3e：正常對(duì)照序列

3 討論

反常性痤瘡以聚合性痤瘡、化膿性汗腺炎和頭皮膿腫性穿掘性毛囊周圍炎三聯(lián)特征為臨床表現(xiàn)。本家系的4例患者均具有典型的臨床特征，包括：(1)典型的皮損：早期深在的痛性結(jié)節(jié)或者隨后的膿腫、竇道、疤痕及簇集的黑頭粉刺；(2)典型的發(fā)病部位：腋窩、腹股溝、會(huì)陰部、肛周、臀部及乳房下褶皺部位；(3)慢性和復(fù)發(fā)性，符合AI的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。

目前，反常性痤瘡的發(fā)病機(jī)制尚不明確，30%～40%的AI患者具有家族史，為常染色體顯性遺傳。2010年Wang等首先發(fā)現(xiàn)家族性反常性痤瘡的發(fā)病與編碼γ分泌酶不同亞基的基因發(fā)生功能性突變有關(guān)[6]。γ分泌酶是一個(gè)膜內(nèi)切蛋白酶復(fù)合體，由 Nicastrin(NCSTN)、早老素1(PSEN1)、早老素增強(qiáng)子2(PSENEN)、前咽缺陷蛋白(Aph1)4個(gè)基因編碼的蛋白亞基組成，這些基因發(fā)生突變?cè)斐搔梅置诿竼伪扼w合成缺陷或不足是AI發(fā)生機(jī)制之一[10]。目前已證實(shí)NCSTN、PSEN1和PSENEN基因突變會(huì)導(dǎo)致AI的發(fā)生[11]，其中NCSTN基因突變占81.8%[12]。NCSTN基因位于1q23.2，包括17個(gè)外顯子，是γ分泌酶最大的活性亞基，其含有高度糖基化大的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(extracellular domain，ECD)和單跨膜螺旋(transmembrane helice，TM)，便于識(shí)別底物蛋白N端[13]，且納卡斯楚因蛋白參與γ分泌酶的組裝、成熟及穩(wěn)定，常引起AI患者NCT蛋白表達(dá)下調(diào)[14]。已有研究表明將γ分泌酶基因敲除的小鼠表現(xiàn)出毛囊濾泡角質(zhì)化、皮脂腺萎縮以及上皮囊腫形成[15]，因此AI的發(fā)生可能通過NCSTN突變從而影響γ分泌酶的正?；钚?，最終造成γ分泌酶單倍體不足。不過在其他疾病中也檢測(cè)出γ分泌酶基因突變，例如白血病、乳腺癌、擴(kuò)張性心肌病[16]。另外，有報(bào)道[17]稱AI患者中除了γ分泌酶組成成分基因突變外，還存在著啟動(dòng)子區(qū)域PSTP1P1變異及TNF基因多態(tài)性等。

本研究在1個(gè)AI家系的1號(hào)外顯子與1號(hào)內(nèi)含子交界處發(fā)現(xiàn)一新發(fā)剪接位點(diǎn)突變，即c.85+2T>C，該突變位于剪接位點(diǎn)處，結(jié)構(gòu)域在翻譯過程中起到終止作用，檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)并未發(fā)現(xiàn)有關(guān)此位點(diǎn)突變的報(bào)道。我們推測(cè)此種突變可能導(dǎo)致NCSTN基因編碼蛋白翻譯異?；虮磉_(dá)單倍劑量不足，引起γ分泌酶正?；钚?，從而影響到對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的維持及毛囊外根鞘細(xì)胞正常增殖和分化等[18]，最終導(dǎo)致AI的發(fā)生。本家系中四例患者攜帶相同的突變位點(diǎn)，I2、II3、II5患者的病情均較重，只有III2患者的癥狀較輕，可能與該患者年齡較小有關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)新發(fā)致病突變，在國(guó)內(nèi)外為首次報(bào)道，豐富了NCSTN基因的突變譜系，有助于進(jìn)一步探討NCSTN突變與AI之間的關(guān)系，進(jìn)而為今后AI的遺傳咨詢和基因診斷提供依據(jù)。