衣俊羽,王圓媛,劉相萍,聶衛(wèi)紅,劉加秀,王海波

(青島大學附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 乳腺病診療中心;2 醫(yī)學研究中心)

沃伯格效應(Warburg效應)是腫瘤代謝重編程的重要標志之一[1],這種能量代謝異常也存在于乳癌中[2]。表柔比星(EPI)作為乳癌化療中常用的一線蒽環(huán)類藥物,具有很好的抗腫瘤效果[3],但由于乳癌具有高異質(zhì)性,某些類型乳癌對此類藥物并不敏感[4]。有研究結(jié)果證明,甘露糖能抑制黑色素瘤細胞增殖,增加其對順鉑類或阿霉素類化療藥物的敏感性[5]。本文擬探討甘露糖在乳癌細胞中的作用,以及甘露糖是否對EPI具有增敏作用,旨在為乳癌的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

RPIM-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購于BI公司,甘露糖、葡萄糖、四甲基偶氮唑藍(MTT)粉末、EPI均購于Solarbio公司(北京),二甲基亞砜(DMSO)及GAPDH、Tubin、Caspas3、Caspase-8、Bax、Bcl-2 單克隆抗體均購于美國Sigma公司。磷酸甘露糖異構酶(MPI)單克隆抗體購于Proteintech公司,正常乳腺細胞MCF-10A 和乳癌細胞株T-47D、BT-549、HCC1937、MCF-7均來自青島大學附屬醫(yī)院醫(yī)學研究中心。

1.2 實驗方法

1.2.1Western blot方法檢測MPI蛋白表達水平分別取對數(shù)生長期的MCF-10A、T-47D、BT-549、HCC1937和MCF-7細胞,加入RIPA 裂解液裂解蛋白,超聲處理2～3次,室溫下、12 000 r/min離心10 min,吸取上清后用BCA 法測量蛋白濃度。以每孔30μg 計算上樣量,SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上,脫脂奶粉封閉1.5 h,分別加入MPI(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)一抗于4 ℃搖床過夜,用PBST 洗膜3次,加相應二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h,使用ECL顯色,待顯出條帶后進行圖像分析。用Image J軟件分析條帶灰度值。實驗重復3次,取平均值。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示MPI的表達。

1.2.2MTT 方法檢測甘露糖對乳癌細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期T-47D 和MCF-7 細胞,以2×107/L密度接種于24孔板,每孔加入100μL 細胞懸液,每組設置2個復孔,于37℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h,細胞融合度達20%～30%時用于實驗。為篩選甘露糖的實驗濃度,將細胞隨機分為對照組(加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清的普通培養(yǎng)液)、甘露糖組(分別加入10、25、50 mmol/L甘露糖)和葡萄糖組(分別加入10、25、50 mmol/L葡萄糖),于120 h后每孔加入5 g/L 的MTT 溶液50μL,置于孵箱中4 h 后棄上清,再加入DMSO 500μL,室溫避光靜置15 min,分裝于96 孔板中(每孔150μL),應用酶標儀檢測490 nm 波長處吸光度(A)值。以單糖濃度為橫坐標,以細胞增殖率為縱坐標,繪制濃度曲線,確定甘露糖最終臨界濃度為25 mmol/L。為觀察甘露糖作用,細胞隨機分為對照組(加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清的普通培養(yǎng)液)、甘露糖組(加入25 mmol/L 甘露糖)和葡萄糖組(加入25 mmol/L葡萄糖),在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2活細胞工作站中觀察120 h。采用MTT法檢測各組細胞培養(yǎng)40、80和120 h細胞活性,并計算細胞增殖率。細胞增殖率=(A實驗組-A空白)/(A對照組-A空白)×100%。

1.2.3MTT 方法檢測甘露糖對EPI的作用 為篩選EPI實驗濃度,取T-47D 細胞分為對照組(加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清的普通培養(yǎng)液)、EPI組(分別加入0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L EPI),每孔加500μL培養(yǎng)液,培養(yǎng)120 h后應用MTT 法檢測細胞活性。以時間為橫坐標,以吸光度(A)為縱坐標,繪制EPI IC50濃度曲線,計算EPI IC50值。為了觀察甘露糖聯(lián)合EPI對細胞作用,取MCF-7 和T-47D 細胞隨機設為對照組(加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清的普通培養(yǎng)液)、甘露糖組(加入25 mmol/L甘露糖)、葡萄糖組(加入25 mmol/L 葡萄糖)、EPI組(加入1μmol/L EPI)、甘露糖聯(lián)合EPI組(加入1μmol/L EPI+25 mmol/L 甘露糖)和葡萄糖聯(lián)合EPI組(加入1μmol/L EPI+25 mmol/L葡萄糖),根據(jù)1.2.2方法檢測490 nm 波長處的吸光度(A)值,并計算細胞增殖率。

1.2.4MTT 法檢測乏氧條件下甘露糖及甘露糖聯(lián)合EPI對乳癌細胞的作用 取MCF-7和T-47D 細胞隨機設為對照組(加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清的普通培養(yǎng)液)、甘露糖組(加入25 mmol/L 甘露糖)、葡萄糖組(加入25 mmol/L 葡萄糖)、EPI組(加入1μmol/L EPI)、甘露糖聯(lián)合EPI組(加入1μmol/L EPI+25 mmol/L甘露糖)和葡萄糖聯(lián)合EPI組(加入1μmol/L EPI+25 mmol/L葡萄糖),每孔加入培養(yǎng)液體積為500μL。于37 ℃、含體積分數(shù)0.01 O2、體積分數(shù)0.05 CO2(剩余體積以N2填充)的乏氧箱中繼續(xù)培養(yǎng)120 h,采用MTT 方法檢測細胞活性并計算細胞增殖率。

1.2.5Western blot方法檢測甘露糖對細胞凋亡蛋白表達的影響 取對數(shù)生長期T-47D 細胞,以2×107/L的密度接種于24孔板,隨機分為對照組(含體積分數(shù)0.10胎牛血清的普通培養(yǎng)液)、甘露糖組(25 mmol/L甘露糖)、葡萄糖組(25 mmol/L 葡萄糖),各組分別加入含相應藥物培養(yǎng)液500μL,培養(yǎng)120 h后收集蛋白,取30μg上樣進行電泳,封閉后分別加入Caspase-8(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)、Tubulin(1∶2 000)和GAPDH(1∶2 000),其余步驟同1.2.1。用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。實驗重復3次,取平均值。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2蛋白的表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學處理,計量資料結(jié)果以表示,多組數(shù)據(jù)比較采用析因設計的方差分析,組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各乳癌細胞株中MPI表達情況

MCF-10A、HCC1937、T-47D、BT-549和MCF-7細胞MPI表達量分別為0.74±0.04、0.63±0.01、0.38±0.02、0.41±0.05、1.44±0.06(n=6),各組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=392.680,P＜0.05)。與正常乳腺細胞MCF-10A 相比,T-47D 細胞MPI表達量相對較低,MCF-7細胞表達相對較高,差異有顯著性(t=25.449、32.857,P＜0.05)。見圖1。后續(xù)實驗選擇MCF-7和T-47D 細胞作為研究細胞。

圖1 Western blot檢測乳癌細胞系中MPI的蛋白表達

2.2 甘露糖對T-47D 和MCF-7細胞增殖的影響

對照組、甘露糖組(10、25、50 mmol/L)、葡萄糖組(10、25、50 mmol/L)T-47D 增殖率比較差異有顯著性(F=20.194,P＜0.05)。見圖2A。在不影響細胞滲透壓的情況下,選用25 mmol/L作為各種單糖實驗濃度。MTT 法檢測各組處理120 h T-47D和MCF-7細胞增殖率見表1。析因設計方差分析顯示,時間與甘露糖對T-47D 和MCF-7 的影響之間存在交互作用(F=25.201、54.618,P＜0.05)。與對照組相比,甘露糖組T-47D 細胞增殖率明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(t=33.192,P＜0.05),甘露糖組MCF-7增殖率差異無統(tǒng)計學意義(t=5.804,P＞0.05)。見圖2B、C、D。

圖2 甘露糖對乳癌細胞增殖的影響

2.3 甘露糖聯(lián)合EPI對T-47D 細胞增殖的影響

對照組、EPI組(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μmol/L)T-47D 細胞的增殖率見圖3A。EPI IC50濃度為1μmol/L,因此選取1μmol/L作為EPI實驗濃度。甘露糖聯(lián)合EPI作用不同時間T-47D 和MCF-7細胞增殖率見圖3B、C。析因設計方差分析顯示,時間與甘露糖聯(lián)合EPI對T-47D 和MCF-7影響之間存在交互作用(F=12.636、232.438,P＜0.05)。與EPI組相比,甘露糖聯(lián)合EPI組T-47D 增殖率相對較低(t=22.901,P＜0.05),兩組MCF-7細胞增殖率比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.4 乏氧條件下甘露糖及甘露糖聯(lián)合EPI對乳癌細胞增殖的影響

析因設計方差分析顯示,時間與甘露糖對T-47D 和MCF-7細胞增殖率影響之間存在交互作用(F=5.970、38.610,P＜0.05)。見圖3。與對照組相比,甘露糖組T-47D 和MCF-7細胞增殖率明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(t=24.538、35.158,P＜0.05);與EPI組相比較,甘露糖+EPI組T-47D 和MCF-7細胞增殖率顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(t=37.986、54.622,P＜0.05)。見表1。

表1 有氧及乏氧條件下處理120 h各組T-47D細胞和MCF-7細胞增殖率比較(n=6,χ/%,)

表1 有氧及乏氧條件下處理120 h各組T-47D細胞和MCF-7細胞增殖率比較(n=6,χ/%,)

注:A 組為對照組;B 組為甘露糖組;C 組為葡萄糖組;D 組為EPI組;E組為甘露糖+EPI組;F組為葡萄糖+EPI組。

圖3 乏氧條件下甘露糖對乳癌T-47D和MCF-7細胞增殖的影響

2.5 甘露糖對T-47D 細胞凋亡蛋白作用

與對照組相比,甘露糖組及葡萄糖組T-47D 細胞凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2 表達差異無顯著性(P＞0.05)。見圖4、表2。

圖4 甘露糖聯(lián)合EPI對乳癌T-47D細胞和MCF-7細胞增殖及蛋白表達影響

表2 甘露糖對T-47D 細胞相關凋亡蛋白表達水平的比較(n=6,)

表2 甘露糖對T-47D 細胞相關凋亡蛋白表達水平的比較(n=6,)

3 討 論

甘露糖是生活中常見己醛醣之一[6],具有廣泛的臨床應用價值。目前,甘露糖補充劑是Ib型糖基化先天性疾病的有效治療方式之一[7],而且甘露糖已被證明可以在體外抑制紅細胞的糖酵解,有望成為血糖檢測血液樣本中有效的葡萄糖防腐劑[8]。此外有研究表明,甘露糖衍生物如2-DG 等具有抑制乳癌細胞的作用[9]。EPI在臨床上多與2種或3種化療藥物聯(lián)合應用[10],可能增加其他藥物的毒副作用。因此,找到一種既可以增加乳癌細胞對EPI的敏感性,同時又能減輕其所帶來的毒副作用的化療增敏劑迫在眉睫。甘露糖安全、無毒副作用,對人體有保護或營養(yǎng)作用,并且具有一定程度的抗腫瘤作用。這些特點為甘露糖成為乳癌治療中理想的化療增敏劑提供了應用基礎。

已有研究表明,甘露糖能抑制黑色素瘤細胞增殖并增加腫瘤細胞對順鉑類和阿霉素類化療藥物的敏感性[3]。最新研究發(fā)現(xiàn),甘露糖在體內(nèi)外對肺癌細胞增殖和遷移具有時間和劑量依賴性的抑制作用[11]。本文研究結(jié)果顯示,有氧條件下,甘露糖組T-47D 細胞增殖率顯著低于對照組,表明甘露糖可以抑制乳癌細胞增殖,甘露糖聯(lián)合EPI組T-47D 細胞增殖率顯著低于EPI單藥組,提示甘露糖與EPI聯(lián)用可以顯著促進乳癌細胞凋亡;而MCF-7細胞則對甘露糖并不敏感。本文Western blot檢測結(jié)果顯示,T-47D 和MCF-7細胞中MPI的表達差異有顯著性。有研究表明,MPI的缺失會通過甘露糖-6-磷酸大量累積而阻礙Warburg效應,進而阻斷糖酵解途徑,同時刺激抑癌基因p53的活化,并進一步維持p53的穩(wěn)定[12]。有研究顯示,腫瘤細胞對甘露糖的易感性與MPI的表達水平呈負相關[3]。本研究結(jié)果表明,低表達MPI的T-47D 細胞對甘露糖更易感,高表達MPI的MCF-7細胞對甘露糖并不敏感。本文研究結(jié)果與上述文獻結(jié)論基本一致。表明MPI表達與乳癌細胞對甘露糖的易感性密切相關。

本文研究結(jié)果表明,乏氧條件下甘露糖組及甘露糖聯(lián)合EPI組T-47D 和MCF-7細胞增殖率均顯著低于對照組和EPI單藥組,說明乏氧條件下甘露糖可明顯抑制MCF-7和T-47D細胞增殖并增加其對EPI的敏感性。相較于正常有氧條件,乏氧因素可以增加甘露糖對乳癌細胞的抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn),低氧誘導因子(HIF)-1通過上調(diào)糖酵解中一系列進行物質(zhì)及能量儲備活動的相關基因表達,間接地促進腫瘤細胞有氧糖酵解的發(fā)生[13]。乳癌細胞中HIF-1α和前梯度蛋白2(AGR2)的表達水平密切相關[14-15]。甘露糖的抑癌作用與HIF 介導的生物學信號通路之間的聯(lián)系有待驗證。

本文研究還探討了甘露糖抑癌作用與常見線粒體凋亡通路[16-17]的關系,結(jié)果表明甘露糖組T-47D細胞線粒體凋亡通路常見蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2表達與對照組和葡萄糖組比較差異無顯著性,提示甘露糖抑制乳癌細胞增殖與線粒體凋亡通路無關。有研究表明,甘露糖與化療藥物聯(lián)用后可使結(jié)腸癌細胞中促凋亡蛋白NOXA 水平升高,而抗細胞凋亡蛋白Bcl-XL和Mcl-1水平降低,從而促進腫瘤細胞的凋亡[3]。而甘露糖增加乳癌細胞對EPI敏感性機制有待進一步研究證實。最近研究表明,甘露糖通過ERK/GSK-3β/β-catenin/SNAIL 通路抑制肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[11]。下一步將驗證此通路與甘露糖抑制乳癌細胞增殖作用的聯(lián)系。

綜上所述,甘露糖具有抑制乳癌細胞增殖和遷移以及增加化療藥物敏感性等作用,但其機制尚不明確。甘露糖和MPI競爭性抑制劑有望成為乳癌治療中理想的化療增敏劑。