候增超，原江鋒,1b,2，賴鈺婷，王大紅,1b,2，龔明貴,2，張 彬,2

(1.河南科技大學(xué) a.食品與生物工程學(xué)院;b.微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 洛陽(yáng) 471023；2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥理科，江蘇 南京 210002)

0 引言

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)的酶促反應(yīng)是加工產(chǎn)品貯存過(guò)程中引起褐變的主因之一[1]。一系列的不利變化不僅使加工產(chǎn)品品質(zhì)劣變，而且酚類化合物的氧化褐變導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度降低，因此，有效抑制PPO活性對(duì)于延緩酶促褐變和提高加工產(chǎn)品品質(zhì)是一種非常有效的途徑[2]。對(duì)于PPO的鈍化和抑制一直是研究的關(guān)注點(diǎn)[3-8]。

多酚是植物體內(nèi)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，已受到國(guó)內(nèi)外不同領(lǐng)域?qū)W者的廣泛關(guān)注[9]。文獻(xiàn)[10]研究表明：多酚類化合物如沒(méi)食子酸在PPO的作用下能夠氧化成醌類化合物，醌再經(jīng)非酶促聚合發(fā)生褐變，影響加工產(chǎn)品的品質(zhì)和多酚的生物利用率。沒(méi)食子酸作為一種廣泛應(yīng)用的多酚類化合物，近年來(lái)一直是研究的重點(diǎn)[11-12]。因此，研究加工產(chǎn)品體系中多酚與PPO之間的相互作用，對(duì)于提高加工產(chǎn)品多酚的生物利用率，以及含多酚食品的加工顯得尤為重要。文獻(xiàn)[13]研究了微波場(chǎng)對(duì)蛋白質(zhì)品質(zhì)、結(jié)構(gòu)以及功能等方面的影響，但微波對(duì)于加工產(chǎn)品中PPO活性的影響以及微波對(duì)酚酸類化合物和PPO混合體系的影響尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

本文以微波輻射作為抑制和鈍化PPO的技術(shù)手段，分析不同沒(méi)食子酸濃度、pH和溫度對(duì)PPO體系中PPO活性的影響，同時(shí)研究沒(méi)食子酸對(duì)PPO酶學(xué)性質(zhì)的影響，并且進(jìn)一步研究不同微波功率對(duì)沒(méi)食子酸和PPO體系特性的影響。本研究可為進(jìn)一步探究微波輻射對(duì)PPO抑制機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

多酚氧化酶(>600 U/mg)購(gòu)于安徽酷爾生物有限責(zé)任公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和鄰苯二酚為分析純，購(gòu)于天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；沒(méi)食子酸購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠。

XH-MC-1型實(shí)驗(yàn)室微波合成儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；Agilent Cary Eclips型熒光分光光度計(jì)，安捷倫科技有限公司；L5S型紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；STARTER 3100型pH計(jì)，上海奧豪斯儀器有限公司；HH-SA型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 儲(chǔ)備液的配制

用濃度為50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH6.8)將PPO溶解，配成濃度為0.007 8 mmol/L的PPO溶液。稱取不同質(zhì)量的沒(méi)食子酸分別溶解于50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH6.8)中，配制成濃度分別為0.078 mmol/L、0.118 mmol/L、0.234 mmol/L、0.312 mmol/L和0.390 mmol/L的沒(méi)食子酸溶液，備用。

1.2.2 PPO活性的測(cè)定

PPO活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]的方法，并略有修改。將0.2 mL、2 mmol/L的鄰苯二酚溶液和2.7 mL、50 mmol/L、pH6.8的磷酸緩沖溶液混合作為反應(yīng)底物，提前將底物溶液置于37 ℃恒溫水浴15 min。將反應(yīng)底物分別與0.1 mL沒(méi)食子酸和PPO溶液快速混合，立即在420 nm測(cè)定吸光度，5 min后再次測(cè)定其吸光度。酶活力的定義：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)，每毫升酶液吸光度變化0.001定義為1個(gè)酶活力單位。

1.2.3 不同濃度沒(méi)食子酸對(duì)PPO活性的影響

室溫下，對(duì)沒(méi)食子酸與PPO的濃度比分別為0、10、15、30、40和50的溶液分別進(jìn)行PPO活性測(cè)定，測(cè)定方法同1.2.2?；旌虾?，PPO終濃度為0.003 9 mmol/L，沒(méi)食子酸終濃度分別為0.039 mmol/L、0.059 mmol/L、0.117 mmol/L、0.156 mmol/L和0.195 mmol/L。

1.2.4 不同pH對(duì)沒(méi)食子酸與PPO體系酶活性的影響

室溫下，選取沒(méi)食子酸與PPO濃度比為50的體系，分別配制pH為5.7、6.0、6.5、6.8、7.2和7.4的磷酸緩沖液(50 mmol/L)，按1.2.2方法測(cè)定活性，空白對(duì)照為對(duì)應(yīng)pH的磷酸緩沖液。

1.2.5 不同溫度對(duì)沒(méi)食子酸與PPO體系酶活性的影響

室溫下，選取沒(méi)食子酸與PPO濃度比為50、pH6.8的體系，分別在溫度20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃，水浴20 min，按1.2.2方法測(cè)定活性。

1.2.6 沒(méi)食子酸與PPO體系中淬滅類型、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)和熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算

取不同濃度沒(méi)食子酸與PPO混合溶液體系的儲(chǔ)備液，分別在25 ℃和35 ℃下靜置反應(yīng)2 h。然后檢測(cè)各混合溶液體系的熒光光譜。熒光光譜的儀器參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)λex為280 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，電壓為600 V，發(fā)射波長(zhǎng)λem為290～450 nm。PPO的熒光淬滅過(guò)程使用Stern-Volmer方程[15]分析。對(duì)于靜態(tài)淬滅，當(dāng)生物小分子與大分子相結(jié)合時(shí)，結(jié)合常數(shù)Ka與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n通過(guò)Lineweaver-Burk雙對(duì)數(shù)方程進(jìn)行計(jì)算[16]。

生物大分子和小分子之間的相互作用力包括4種，分別為疏水作用力、靜電作用、氫鍵和范德華力。如果焓變?cè)跍y(cè)定溫度范圍內(nèi)變化不大，則沒(méi)食子酸與PPO相互作用過(guò)程中的焓變(△H)、熵變(△S)和吉布斯自由能(△G)，可使用Van’t-Hoff方程計(jì)算[17]。

1.2.7 熒光光譜分析

取不同濃度沒(méi)食子酸與PPO混合溶液體系的儲(chǔ)備液，分別在25 ℃和35 ℃下反應(yīng)2 h，分別測(cè)定混合物體系的熒光光譜。微波處理?xiàng)l件：取沒(méi)食子酸與PPO濃度比為50的混合溶液，分別在微波功率100 W、300 W、500 W、700 W和900 W(50 ℃，8 min)下測(cè)定微波處理后混合液的熒光光譜。測(cè)定熒光光譜設(shè)定的儀器參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)λex為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem為290～450 nm；同步熒光激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍為260～310 nm；三維熒光掃描模式為3-D Scan，激發(fā)波長(zhǎng)λex為250～450 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem為250～450 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，掃描速率為120 nm/min。

1.2.8 紫外吸收光譜分析

使用沒(méi)食子酸與PPO的濃度比為0、10、15、30、40和50的混合溶液，室溫下靜置反應(yīng)2 h；取沒(méi)食子酸與PPO濃度比為50的混合溶液體系，分別在微波功率100 W、300 W、500 W、700 W和900 W(50 ℃，8 min)下進(jìn)行處理，在波長(zhǎng)265～315 nm掃描各混合物紫外吸收光譜。

1.2.9 不同微波功率對(duì)沒(méi)食子酸與PPO體系中酶活性的影響

取沒(méi)食子酸與PPO濃度比為50的混合溶液，分別在微波功率100 W、300 W、500 W、700 W和900 W(50 ℃，8 min)下進(jìn)行處理。按1.2.2方法測(cè)定酶活性。

1.2.10 不同微波功率對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除的影響

參照文獻(xiàn)[18]的方法，并略有變動(dòng)。取沒(méi)食子酸與PPO濃度比為50的混合溶液，分別在微波功率100 W、300 W、500 W、700 W和900 W(50 ℃，8 min)下進(jìn)行處理，然后分別取微波處理后的混合溶液1 mL，加入0.004% DPPH溶液3 mL，充分混勻，避光靜置30 min后，以甲醇為空白對(duì)照，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析及處理

每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次，使用SPSS軟件分析。采用Orign 2017軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸與PPO體系酶學(xué)性質(zhì)

2.1.1 不同濃度沒(méi)食子酸對(duì)PPO活性的影響

沒(méi)食子酸對(duì)PPO活性的影響如圖1a所示，隨著沒(méi)食子酸濃度的增加，PPO的活性不斷下降。當(dāng)沒(méi)食子酸與PPO濃度比為10時(shí)，PPO活性降低為原酶活性的84.8%；而當(dāng)沒(méi)食子酸與PPO濃度比為50時(shí)，PPO活性降低為原酶活性的58.5%。沒(méi)食子酸與PPO濃度比為50時(shí)，沒(méi)食子酸的濃度是0.195 mmol/L，溶于pH6.8磷酸緩沖液溶液中，此時(shí)磷酸緩沖液溶液的pH值為6.5，對(duì)溶液體系的pH影響不大，可以忽略不計(jì)。因此，造成PPO活性變化的原因，可能是由于沒(méi)食子酸對(duì)PPO活性中心的螯合作用引起的。文獻(xiàn)[14]也報(bào)道了不同濃度檸檬酸對(duì)PPO活性具有較強(qiáng)的抑制作用。

2.1.2 不同pH對(duì)沒(méi)食子酸和PPO體系酶活性的影響

pH值是影響酶催化的重要因素，過(guò)高和過(guò)低的pH值會(huì)影響酶的構(gòu)象，致使酶變性失活。由圖1b可知：PPO活性對(duì)pH值較為敏感，在pH5.7～7.4時(shí)，PPO的活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且pH值在6.8時(shí)，PPO活性最大。pH值過(guò)高或者過(guò)低，活性反應(yīng)速率下降，說(shuō)明可以通過(guò)調(diào)節(jié)富含PPO的溶液pH來(lái)抑制PPO的活性，從而達(dá)到控制體系中由于PPO的存在而引起的酶促褐變。PPO催化沒(méi)食子酸發(fā)生酶促反應(yīng)，最適宜pH為6.8。文獻(xiàn)[19]報(bào)道蘑菇中PPO最適pH值為7.0，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.1.3 不同溫度對(duì)沒(méi)食子酸和PPO體系酶活性的影響

為了研究沒(méi)食子酸和PPO體系中溫度對(duì)PPO活性的影響，選取溫度為20～70 ℃，測(cè)定沒(méi)食子酸和PPO體系中PPO活性。如圖1c所示，PPO活性隨著溫度的升高，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，溫度較低時(shí)，PPO活性較小，可見(jiàn)低溫有利于抑制PPO活性；當(dāng)溫度升高到50 ℃時(shí)，PPO的活性達(dá)到最大；當(dāng)溫度>50 ℃時(shí)，活性逐漸降低，而70 ℃時(shí)活性幾乎完全喪失，這可能是因?yàn)檫^(guò)高的溫度導(dǎo)致PPO變性，從而嚴(yán)重影響PPO的活性。這與文獻(xiàn)[20]的研究結(jié)果基本一致，即在70 ℃時(shí)酶活性幾乎完全喪失。因此，低溫和較高的溫度可以抑制PPO活性。

(a) 沒(méi)食子酸 (b) pH (c) 溫度

2.1.4 內(nèi)源熒光光譜和淬滅類型確定

PPO分子中含有色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等一系列可以發(fā)射內(nèi)源熒光的氨基酸殘基，因此，可以通過(guò)內(nèi)源熒光的變化來(lái)反映沒(méi)食子酸與PPO之間的相互作用以及沒(méi)食子酸所引起PPO的構(gòu)象變化。圖2為沒(méi)食子酸處理PPO的熒光光譜和Stern-Volmer圖。圖2a中，A→F線表示曲線所對(duì)應(yīng)的沒(méi)食子酸與PPO濃度比分別為0、10、15、30、40、50的變化方向。由圖2a可知：隨著沒(méi)食子酸濃度的增加，熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低，表明沒(méi)食子酸的加入使PPO發(fā)生酶促氧化，并且使PPO發(fā)生熒光淬滅。圖2b為沒(méi)食子酸與PPO相互作用的內(nèi)源熒光光譜與Stern-Volmer方程擬合圖。圖2b中，F(xiàn)0為未加入沒(méi)食子酸時(shí)PPO的熒光強(qiáng)度；F為加入不同濃度沒(méi)食子酸時(shí)PPO的熒光強(qiáng)度；Q為沒(méi)食子酸的濃度，mmol/L。不同處理?xiàng)l件對(duì)PPO活性的影響見(jiàn)表1。從表1可以看出：在沒(méi)食子酸與PPO的相互作用過(guò)程中，擬合后的R2均為0.98，表明F0/F與Q之間呈現(xiàn)良好線性關(guān)系且斜率為正值，故沒(méi)食子酸與PPO是靜態(tài)淬滅機(jī)制；并且隨著處理溫度的升高，淬滅常數(shù)KSV值卻隨之下降，25 ℃和35 ℃時(shí)PPO淬滅速率常數(shù)Kq分別為8.7×1011和4.6×1011，淬滅常數(shù)隨著溫度的升高而下降[21]，且均遠(yuǎn)高于2×1010，進(jìn)一步表明沒(méi)食子酸對(duì)PPO的淬滅機(jī)制為靜態(tài)淬滅。

(a) 內(nèi)源熒光發(fā)射光譜 (b) Stern-Volmer方程擬合圖

表1 沒(méi)食子酸與PPO相互作用的Stern-Volmer常數(shù)

2.1.5 沒(méi)食子酸與PPO相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

沒(méi)食子酸和PPO相互作用的結(jié)合常數(shù)(Ka)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)見(jiàn)表2。沒(méi)食子酸和PPO之間存在較強(qiáng)的結(jié)合力，并且隨著溫度的升高，Ka隨之增大。結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別為1.398和1.714，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近2，說(shuō)明沒(méi)食子酸與PPO大約有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，n伴隨溫度的升高有一定的改變，說(shuō)明溫度的升高對(duì)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)有一定影響。沒(méi)食子酸與PPO作用的結(jié)合常數(shù)Ka均遠(yuǎn)大于104數(shù)量級(jí)，表明沒(méi)食子酸和PPO具有較強(qiáng)的相互作用。

表2 沒(méi)食子酸和PPO相互作用的結(jié)合常數(shù)

2.1.6 沒(méi)食子酸和PPO相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力類型的分析

小分子化合物與蛋白質(zhì)的相互作用模式和作用力類型，可以用熱力學(xué)參數(shù)(如△H、△S和△G)來(lái)指示。當(dāng)△H>0且△S>0時(shí)，主要作用力為疏水作用力；當(dāng)△H<0且△S>0時(shí)，靜電引力起主要作用；當(dāng)△H<0且△S<0時(shí)，氫鍵和范德華力起主要作用；反應(yīng)過(guò)程中，當(dāng)△G<0，則表明反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行[17]。沒(méi)食子酸與PPO相互作用的熱力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。由表3可知：沒(méi)食子酸和PPO相互作用后，△H>0，△S>0且△G<0，說(shuō)明沒(méi)食子酸和PPO反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的，并且主要作用力為疏水作用力。

表3 沒(méi)食子酸與PPO相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.2 微波對(duì)沒(méi)食子酸和PPO相互作用的紫外吸收光譜

沒(méi)食子酸和PPO相互作用的紫外吸收光譜如圖3a所示，A→F線表示沒(méi)食子酸濃度變化的方向，隨著沒(méi)食子酸的加入，PPO的吸收峰強(qiáng)度增高。在不添加沒(méi)食子酸的情況下，285 nm是PPO的特征吸收峰。隨著沒(méi)食子酸溶液濃度的升高，PPO的吸光度逐漸增加，但是特征吸收峰的位置未改變。由此可見(jiàn)，沒(méi)食子酸的加入會(huì)與PPO發(fā)生酶促氧化，并且使PPO內(nèi)部暴露了疏水性的酪氨酸與色氨酸殘基，致使吸光度增強(qiáng)。

圖3b為經(jīng)過(guò)不同微波功率處理后PPO和沒(méi)食子酸的相互作用紫外光譜。在100～700 W時(shí)，沒(méi)食子酸和PPO體系的紫外吸光度逐步增加，這可能是由于微波處理后，部分色氨酸和酪氨酸殘基在親水環(huán)境暴露導(dǎo)致；而在用900 W處理后紫外吸收強(qiáng)度降低，這可能是由于部分去折疊化的PPO分子在較高的微波功率下又發(fā)生了團(tuán)聚，結(jié)果使部分暴露于較為親水環(huán)境的色氨酸和酪氨酸殘基又被包埋入疏水環(huán)境中。文獻(xiàn)[22]研究也發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的紫外光譜和分子折疊結(jié)構(gòu)相關(guān)，去折疊可以引起紫外吸收強(qiáng)度的降低。紫外吸收光譜表明，不同微波功率處理PPO和沒(méi)食子酸體系通過(guò)影響PPO結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響PPO和沒(méi)食子酸體系中酶促氧化。

(a) 不同沒(méi)食子酸濃度處理 (b) 不同微波功率處理

2.3 微波對(duì)沒(méi)食子酸和PPO相互作用的熒光光譜分析

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光是由其內(nèi)部色氨酸和酪氨酸殘基激發(fā)產(chǎn)生的，因此，可以通過(guò)內(nèi)源熒光的變化來(lái)反映PPO與沒(méi)食子酸之間的酶促反應(yīng)以及PPO構(gòu)象的變化。沒(méi)食子酸和PPO相互作用熒光光譜分析見(jiàn)圖4。圖4a中，隨著沒(méi)食子酸濃度的增加，內(nèi)源性熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低，表明隨著沒(méi)食子酸的加入，PPO發(fā)生熒光淬滅。熒光團(tuán)附近的分子微環(huán)境可以用同步熒光光譜來(lái)指示。如果將激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)之間的差值Δλ設(shè)置成15 nm與60 nm，則得到的同步熒光光譜分別表示蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的光譜特征[23]，所以可以用來(lái)辨別蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的情況。如圖4b和圖4c所示，當(dāng)Δλ=15 nm以及Δλ=60 nm時(shí)，隨著沒(méi)食子酸濃度的增加，PPO的特征吸收峰降低，并且最大發(fā)射波長(zhǎng)并沒(méi)有發(fā)生明顯改變，說(shuō)明沒(méi)食子酸并沒(méi)有使酪氨酸殘基與色氨酸殘基周圍極性改變，但是通過(guò)內(nèi)源性熒光和同步熒光的改變，證明沒(méi)食子酸使PPO構(gòu)象和微環(huán)境發(fā)生變化，可能是由于沒(méi)食子酸使PPO的其他氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變?cè)斐傻摹?/p>

不同微波功率處理PPO與沒(méi)食子酸體系的熒光光譜如圖4d所示，在100～700 W時(shí)，熒光強(qiáng)度隨微波處理功率的增加從125降低到90，這種現(xiàn)象可能是由于PPO結(jié)構(gòu)的展開和芳香族氨基酸在微波輻照后，暴露于強(qiáng)極性水溶液中而又被包埋入疏水環(huán)境中所致。經(jīng)微波處理后，內(nèi)源性熒光光譜顯示沒(méi)食子酸與PPO混合溶液的特征吸收峰從348 nm紅移至356 nm，表明微波輻射能夠影響PPO構(gòu)象，進(jìn)而影響到PPO和沒(méi)食子酸體系中酶促氧化。

(a) 不同濃度沒(méi)食子酸處理PPO (b) 同步熒光光譜(Δλ=15 nm)

三維熒光光譜可以準(zhǔn)確有效地檢驗(yàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與微環(huán)境的改變。圖5a與圖5b分別為PPO和沒(méi)食子酸以及PPO體系的濃度比為30時(shí)的三維熒光光譜。這兩個(gè)體系中都含有“山脊”峰(峰A)，也就是存在特征為Δλem=Δλex的瑞利散射[24]。如圖5a所示，峰B在Δλem=348 nm處出現(xiàn)，這是由PPO中氨基酸的π-π*躍遷所造成的。圖5b中峰B的熒光強(qiáng)度顯著降低且λem發(fā)生輕微藍(lán)移，表明PPO的結(jié)構(gòu)和周圍微環(huán)境發(fā)生變化，這與同步熒光光譜的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

(a) PPO的三維熒光 (b) 沒(méi)食子酸與PPO結(jié)合的三維熒光

2.4 微波功率對(duì)沒(méi)食子酸和PPO體系中PPO活性的影響

不同微波功率對(duì)PPO活性的影響如表4所示，隨著微波功率的增加，PPO的活性逐步降低。與未經(jīng)微波處理的PPO活性相比，100～300 W PPO活性升高，這可能是由于低功率微波下體系溫度起主要作用，處于最合適溫度下的PPO高于未經(jīng)處理的PPO活性；隨著微波功率的升高，微波功率起主導(dǎo)作用，過(guò)高的微波功率影響PPO的構(gòu)象，從而使PPO活性逐步降低。文獻(xiàn)[25]也報(bào)道了高功率微波輻射使牛蒡PPO的活性降低的現(xiàn)象。綜上可知，低的微波功率對(duì)沒(méi)食子酸和PPO體系中PPO活性有一定的促進(jìn)作用，而高微波功率能夠鈍化沒(méi)食子酸和PPO體系中PPO的活性。

表4 微波功率對(duì)沒(méi)食子酸與PPO體系PPO活性和DPPH清除的影響

2.5 微波功率對(duì)沒(méi)食子酸和PPO體系中清除DPPH自由基的影響

DPPH自由基是一種化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定的自由基[18]。由表4可知：沒(méi)食子酸和PPO體系對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力，并且隨著微波功率的增加，清除DPPH自由基能力逐步增強(qiáng)?？赡苁怯捎跊](méi)食子酸和PPO體系中沒(méi)食子酸具有清除DPPH自由基能力，并且體系中PPO具有酶促氧化沒(méi)食子酸的能力。經(jīng)微波處理，體系中PPO構(gòu)象發(fā)生改變，活性受到影響，因此使部分沒(méi)食子酸沒(méi)有發(fā)生酶促氧化，進(jìn)而具有一定的清除DPPH自由基的能力；隨著微波功率的增加，PPO的活性受到較大的影響，因此更多的沒(méi)食子酸不發(fā)生酶促氧化，故顯示出逐步增高的DPPH自由基清除能力。

3 結(jié)論

(1)沒(méi)食子酸與PPO濃度比為50時(shí)PPO活性最強(qiáng)，最適pH為6.8，最適溫度為50 ℃。

(2)沒(méi)食子酸與PPO通過(guò)靜態(tài)淬滅機(jī)制使PPO熒光淬滅，并且相互作用的主要方式為疏水作用，沒(méi)食子酸與PPO反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的；沒(méi)食子酸與PPO的結(jié)合導(dǎo)致PPO構(gòu)象、微環(huán)境發(fā)生改變。

(3)不同微波功率輻射對(duì)沒(méi)食子酸和PPO的相互作用有一定的影響，觀察到規(guī)律的構(gòu)象變化，這可能是微波導(dǎo)致PPO活性變化的原因。高功率微波處理可能是一種潛在的鈍化PPO、防止酚類化合物的氧化褐變的條件。

(4)微波輻射技術(shù)是提高加工產(chǎn)品多酚類物質(zhì)的生物利用性的有效途徑，并將這種技術(shù)應(yīng)用于鈍化PPO，從而提高多酚類加工產(chǎn)品的品質(zhì)，具有重要的指導(dǎo)意義。