彭 景，許 杰，程 威,尹重超，陳恒玲

(中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，湖北 武漢 430074)

1 引言

CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種獲得性免疫系統(tǒng)，最初被發(fā)現(xiàn)來(lái)源于細(xì)菌。它能識(shí)別并結(jié)合特定的DNA片段，cas9蛋白可以在其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物crRNA的介導(dǎo)下對(duì)靶基因進(jìn)行剪切，實(shí)現(xiàn)對(duì)外源DNA的防御[1～3]。CRISPR/Cas的功能過(guò)程可以概括如下：得到CRISPR的間隔區(qū)序列、CRISPR基因座的表達(dá)、相關(guān)復(fù)合體對(duì)靶DNA進(jìn)行剪切。精確有效的基因組編輯是基因功能鑒定的關(guān)鍵。到目前為止，CRISPR相關(guān)系統(tǒng)已成功地應(yīng)用于動(dòng)物和植物[4～7]。

在上述理論基礎(chǔ)上，一種新穎高效的基因編輯技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，它是由Wiedenheft等設(shè)計(jì)出的，具體內(nèi)容包括：設(shè)計(jì)出的sgRNA可以識(shí)別并結(jié)合Cas9蛋白，并介導(dǎo)cas9蛋白對(duì)靶基因進(jìn)行剪輯(圖1)，其中sgRNA是根據(jù)crRNA與tracrRNA的復(fù)合體設(shè)計(jì)出來(lái)的[2～4]。由細(xì)菌中復(fù)雜的CRISPR/Cas9系統(tǒng)精簡(jiǎn)為sgRNA與Cas9作用結(jié)構(gòu)模式，使得只需要簡(jiǎn)單地將其導(dǎo)入到細(xì)胞便可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，很大程度上提高了基因編輯效率。因?yàn)樵摷夹g(shù)具備高效性、低成本性和簡(jiǎn)易性等優(yōu)點(diǎn)，所以生物研究界對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)十分關(guān)注，并應(yīng)用到了更廣闊的研究領(lǐng)域[1,3]。

圖1 sgRNA指導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因剪切系統(tǒng)(圖片來(lái)源于《一種新型的構(gòu)建CRISPR/Cas9 KnockOut載體的方法》)

Cas9可以被引導(dǎo)到一個(gè)與sgRNA互補(bǔ)的20 mer基因組位點(diǎn)，介導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。5’-NGG原引物鄰近基序(PAM)必須位于目標(biāo)序列的鄰近位置[8,9]。為了選擇合理的目標(biāo)位置和最小化偏離目標(biāo)的影響，已經(jīng)建立了一些優(yōu)化sgRNA選擇的計(jì)算工具。在獲得sgRNA序列的基礎(chǔ)上，普遍采用的Zhang Lab寡核苷酸序列設(shè)計(jì)的方法(圖2)來(lái)設(shè)計(jì)oligo的生成(概括起來(lái)就是:在設(shè)計(jì)oligo時(shí)，首先要保證模板序列的開(kāi)頭為G，以確保穩(wěn)定性。oligo1是在上述序列基礎(chǔ)上在其5’端加上CACC形成的，而oligo2則是在堿基配對(duì)所得的反轉(zhuǎn)序列的5’端加上AAAC形成的)[4,5]。然而，從sgRNA生成oligo非常需要有效的計(jì)算工具。在當(dāng)前的分析中，創(chuàng)建了一個(gè)基于Python的Crispr/cas9 oligos生成器的本地應(yīng)用程序工具，允許用戶批量地在輸入sgRNA序列中設(shè)計(jì)oligos。Crispr/cas9 oligos生成器可以免費(fèi)下載。該軟件是專門設(shè)計(jì)用于引物序列變換的工具，能有效解決人工自反轉(zhuǎn)問(wèn)題，很大程度地提高設(shè)計(jì)精度，節(jié)省時(shí)間。

圖2 oligo序列設(shè)計(jì)示意圖(圖片來(lái)源于 zhanglabcloningprotocol引用張鋒的文章)

2 軟件開(kāi)發(fā)及功能介紹

2.1 開(kāi)發(fā)工具及開(kāi)發(fā)環(huán)境

由于python語(yǔ)言的簡(jiǎn)潔、易懂、易開(kāi)發(fā)等特點(diǎn)，十分適合用來(lái)編寫(xiě)本課題的生成器[10,11]。Python內(nèi)有常用于科學(xué)研究的科學(xué)數(shù)據(jù)包anaconda和數(shù)據(jù)庫(kù)tkinter，這為本次程序編寫(xiě)提供了研究背景[13]，其中tkinter是tk的python接口，而tk原本是Tcl的graphical user interface(GUI)，就是圖形界面用戶接口，可以類比于許多編程語(yǔ)言涉及到的“控制臺(tái)”的命令行化分的編輯模式[12,13]。因此，該軟件是基于python環(huán)境下，以PyCharm為編輯代碼工具，主要利用anaconda和tkinter開(kāi)發(fā)完成的[15]。設(shè)計(jì)流程主要包括：軟件前期的設(shè)想與準(zhǔn)備、搭建操作平臺(tái)、導(dǎo)入所需要的數(shù)據(jù)庫(kù)和函數(shù)、編寫(xiě)功能函數(shù)、設(shè)計(jì)用戶界面、軟件的測(cè)試與改良。主要功能是檢驗(yàn)靶序列是否正確，完成靶序列的轉(zhuǎn)換和存儲(chǔ)，最終獲得oligo1和oligo2兩個(gè)序列。

2.2 軟件界面與功能介紹

2.2.1 軟件界面

軟件界面如圖3所示。

圖3 軟件界面

圖3中有5個(gè)功能框：引物名稱、靶序列、+G、oligo1、oligo2，包含3個(gè)功能鍵：start、clear、save。其中引物名稱、靶序列是必填項(xiàng)，+G、oligo1、oligo2是按start后自動(dòng)生成的，

這個(gè)軟件可以進(jìn)行批量生產(chǎn)，最后可將所得到的數(shù)據(jù)保存成Excel格式。

2.2.2 軟件功能

軟件正常操作及結(jié)果如圖4所示。

圖4 軟件功能實(shí)例

圖4中所示為對(duì)3個(gè)引物：A18、G14、D3進(jìn)行引物處理。start鍵的功能是檢查序列是否符合規(guī)范，它能檢查到每一位堿基是否符合規(guī)定，并且能精確到每一位，并對(duì)靶序列進(jìn)行操作。只有當(dāng)檢查到序列滿足要求時(shí)，才能進(jìn)行下步操作，編輯出符合規(guī)定的+G、oligo1、oligo2序列，并顯示在功能框中。clear鍵的功能是清除方框中的數(shù)據(jù)，并可以接著進(jìn)行下一序列的設(shè)計(jì)。save鍵的功能是將運(yùn)行后的結(jié)果選擇存儲(chǔ)位置，并將該數(shù)據(jù)以Excel格式進(jìn)行保存。引物名稱框需要用戶輸入靶序列的名稱。靶序列框需要用戶輸入將要處理的靶序列。+G框內(nèi)是可以判斷靶序列的頭端是否包含“G”，若包含“G”則不處理，若不包含，則需要在序列開(kāi)頭+G。oligo1框內(nèi)功能是把+G后的靶序列前端加上“5-CACC”，在最后端加上“-3”。oligo2框內(nèi)功能是在序列前端加上“5-AAAC”，然后連接對(duì)oligo1從3端按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行匹配的序列，最后在最后端加上“-3”。

2.2.3 序列結(jié)果保存

結(jié)果保存如圖5所示。

圖5 序列結(jié)果保存

上述操作的結(jié)果會(huì)按照規(guī)定的格式存儲(chǔ)在表格中，用戶可以自行選擇存儲(chǔ)路徑，這樣的結(jié)果簡(jiǎn)潔規(guī)范，不需要進(jìn)行人工地核對(duì)，節(jié)省了時(shí)間提高了精確度。其結(jié)果文件方便發(fā)給引物公司，進(jìn)行后續(xù)工作，加快了研究工作進(jìn)度。

3 軟件測(cè)試

3.1 序列判斷出錯(cuò)程序介紹

因?yàn)榫庉嫷男蛄兄挥?0堿基，且只能包含“A、T、G、C”四個(gè)字母。當(dāng)使用者在功能框輸入序列信息，并點(diǎn)擊相應(yīng)功能按鈕時(shí)，軟件會(huì)對(duì)輸入的序列進(jìn)行檢測(cè)。程序?qū)⑹紫葯z驗(yàn)輸入序列的長(zhǎng)度，序列長(zhǎng)度若大于20或者小于20，將會(huì)彈出提示框，若長(zhǎng)度剛好為20，程序?qū)z驗(yàn)序列的字母，確保輸入的序列只含有“A、T、G、C”，若輸入正確，程序?qū)?huì)為輸入序列進(jìn)行相關(guān)操作并保存相應(yīng)信息。若輸入的為“A、T、G、C”以外的字母，程序?qū)?huì)出現(xiàn)提示對(duì)話框并要求用戶重新輸入正確的序列。下面提供了檢測(cè)序列的函數(shù)(圖6)。

圖6 檢測(cè)序列函數(shù)代碼

3.2 對(duì)于序列寫(xiě)錯(cuò)的提示和警告框介紹

(1)靶序列出錯(cuò)，堿基沒(méi)有按照要求填寫(xiě)，輸入的序列不是滿足只有“A、T、C、G”這四個(gè)字母含有其他的字母。如圖7所示。

圖7 檢測(cè)序列錯(cuò)誤

(2)靶序列至少有一行長(zhǎng)度不符合長(zhǎng)度不符合要求(即不滿足20個(gè)堿基數(shù))。如圖8所示。

圖8 檢測(cè)長(zhǎng)度錯(cuò)誤

(3)在沒(méi)有輸入靶序列時(shí)，還進(jìn)行操作出錯(cuò)。如圖9所示。

圖9 未輸入靶序列錯(cuò)誤

4 結(jié)論與展望

本課題組所研發(fā)的基于Python的Crispr/Cas9 oligos批量生成器順利完成了測(cè)試，可以自動(dòng)地以特定方式對(duì)靶序列進(jìn)行添加和編輯，以生成符合要求的oligos序列。與手動(dòng)編寫(xiě)相比，該軟件不僅節(jié)約了科研人員的時(shí)間與精力，提高了工作效率，而且大大降低了錯(cuò)誤率。如果可以繼續(xù)推廣這個(gè)軟件，將加快相關(guān)科研工作的展開(kāi)，更有利于Crispr/Cas技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。

盡管Crispr/Cas9 oligos批量生成器尚存在一些不足：比如讀取序列文件功能還未實(shí)現(xiàn)、序列查錯(cuò)可以更加人性化以及可以添加更豐富的引物設(shè)計(jì)方案等。而且相信隨著我們不斷地完善，這款軟件一定會(huì)變得更加人性化，功能也會(huì)更加強(qiáng)大，更快地成為科研工作者的友好工具。

基于Python的Crispr/Cas9 oligos批量生成器源代碼可在GitHub和谷歌云盤上免費(fèi)獲得，上傳網(wǎng)址分別為：https://github.com/scuec-channel/oligo-generator.git和https://drive.google.com/open?id=1nNRzZ9u0rTLbmiv2L-xG4eUHRK9ZLcQ8(The source code for the python-based Crispr/cas9 oligos batch generator is freely available on GitHub and Google cloud disk,Upload url:https://github.com/scuec-channel/oligo-generator.git and https://drive.google.com/open?id=1nNRzZ9u0rTLbmiv2L-xG4eUHRK9ZLcQ8)。