魯雁秋，王 靜，陳耀凱，李俊剛

抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（antiretroviral therapy，ART）是目前治療HIV-1感染的最有效手段，也是控制病毒傳播的主要措施之一。目前，全球已有2 600萬HIV-1感染者正在接受ART[1-2]。然而，隨著ART的廣泛開展，抗病毒藥物耐藥問題日益凸顯[3]。法國接受ART的感染者隨訪6年的總體耐藥率為11.7%[4]。我國山東省接受ART滿1年人群耐藥率達(dá)6.2%[5]，云南、廣西和河南三個省份報道的HIV-1 耐藥率約為7.1%[6]。迄今尚未見重慶地區(qū)HIV-1耐藥情況的大樣本研究。為此，本課題組對2015年5月—2020年6月在重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心接受一線ART且發(fā)生病毒學(xué)失敗的HIV感染者進(jìn)行回顧性分析，以了解本地區(qū)HIV-1耐藥情況。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

2015年5月—2020年6月，本中心共收治HIV-1感染者3 305例，其中接受ART 1年以上且病毒載量大于1 000 拷貝/mL者為348例。所有348例病例均留取EDTA-K2抗凝血漿5mL，進(jìn)行HIV-1病毒載量檢測、基因擴(kuò)增、耐藥分析和基因亞型分析。

1.2 檢測方法

1.2.1 HIV-1病毒載量檢測 采用全自動實(shí)時熒光定量檢測儀（COBAS Taq-Man48，德國羅氏公司產(chǎn)品），定量檢測血漿HIV-1 RNA水平（最低檢測下線值為20拷貝/mL）。

1.2.2 HIV-1基因擴(kuò)增和耐藥分析 血漿標(biāo)本采用ViroSeq HIV-1基因型耐藥檢測試劑盒（美國Abbott公司產(chǎn)品）進(jìn)行HIV-1 RNA提取，經(jīng)實(shí)時熒光定量（RT）-PCR擴(kuò)增出包含全部蛋白酶基因和三分之二反轉(zhuǎn)錄酶基因的片段（長度為1.8 kb），然后以擴(kuò)增片段為模板采用7條引物分別測序；用ViroSeq HIV-1耐藥分析軟件（The ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software）對7個引物測得序列進(jìn)行拼接、編輯以及對拼接序列進(jìn)行突變確認(rèn)，再把拼接序列同HIV-1參考毒株（HXB-2）序列進(jìn)行比對分析，以此來確認(rèn)樣本的突變位點(diǎn)；最后，采用ViroSeq HIV-1耐藥分析軟件選擇合適的數(shù)學(xué)模型對這些突變位點(diǎn)進(jìn)行分析并生成耐藥報告。

1.2.3 HIV-1基因亞型分析 采用美國國立生物技術(shù)信息中心 （NCBI）網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）提 供 的病毒基因分型工具（Viral Genotyping Tool）進(jìn)行HIV-1基因亞型分析，選擇2009年參考序列數(shù)據(jù)庫（2009 RefSet）進(jìn)行在線比對，根據(jù)比對結(jié)果判定序列所屬HIV-1基因亞型。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，所有分析均使用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0進(jìn)行。計量資料用均數(shù)表示，計數(shù)資料用頻率（%）表示，率的比較采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

3 305例接受一線ART方案治療滿1年的HIV-1感染者中，348例（10.5%）一線ART方案治療病毒學(xué)失敗，在失敗的病例中，男270例（77.6%），女78例（22.4%），平均 年 齡40.7歲（4～74歲）；治療滿1年時血漿HIV-1病毒載量均值為4.9 lg拷貝/mL （3.0 ～7.0 lg拷貝/mL）。其中，檢出HIV-1耐藥的319例HIV-1感染者中，男248例（77.7%），女71例（22.3%），平均年齡40.0歲（4～74歲）。本組348例病例接受的一線ART方案包括替諾福韋酯+拉米夫定+依非韋侖（TDF/3TC/EFV）、替諾福韋酯+拉米夫定+奈韋拉平（TDF/3TC/NVP）、齊多夫定+拉米夫定+依非韋侖（AZT/3TC/EFV）和齊多夫定+拉米夫定+奈韋拉平（AZT/3TC/NVP）。

2.2 耐藥率分析

348例發(fā)生病毒學(xué)失敗病例中，319例至少對一種抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物耐藥，在348例一線ART方案治療失敗病例中占91.7% （319/348），未檢出任何耐藥的比例僅為8.3%（29/348）。在檢出耐藥的319例中，核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTI）耐藥發(fā)生率為91.5%（292/319），非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTI）耐藥發(fā)生率為99.1%（316/319），蛋白酶抑制劑（PI）耐藥發(fā)生率為0.9%（3/319）。常見NRTI和NNRTI類藥物耐藥率詳見圖1。

圖1 319例耐藥病例對NRTI和NNRTI類藥物的耐藥率Figure 1 The incidence of resistance to NRTIs and NNRTIs in 319 cases

2.3 耐藥位點(diǎn)分析

發(fā)生耐藥突變的319例病例中，共檢出17個NRTI耐藥位點(diǎn)突變、16個NNRTI耐藥位點(diǎn)突變和9個PI耐藥位點(diǎn)突變。由表1可見，NRTI類藥物中，M184V/I突變發(fā)生率最高（85.9%），其次為K65R/N（41.7%）；NNRTI類藥物中，K103N/R/S突變發(fā)生率最高（43.6%），其次為G190A/S/E/Q、V179D/E和V106M/A，分 別 為38.6%、38.2%和33.9%；PI類藥物各種突變發(fā)生率均很低（＜1%）。

表1 319例耐藥病例的耐藥基因位點(diǎn)分布及頻數(shù)Table 1 The distribution and prevalence of drug resistance mutations in 319 cases

2.4 耐藥病例HIV-1基因亞型分布

319例耐藥病例中，HIV-1基因亞型以CRF01_AE亞型最多，達(dá)170例（53.3%），其次是CRF07_BC亞 型96例（30.1%）、CRF08_BC亞 型17例（5.3%）、B亞 型12例（3.8%）和CRF55_01B亞型13例（4.1%），其 余 占 比 不 足1%亞 型 包括CRF52_01B、CRF57_BC、CRF59_01B、CRF67_01B、CRF15_01B、CRF64_BC和D亞 型等（圖2）。與耐藥病例比較，治療病毒學(xué)失敗但未檢出耐藥者HIV-1基因亞型分布基本相同，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；但非耐藥病例CRF08_BC亞型分布頻數(shù)（24.1%）顯著高于耐藥病例（5.3%）,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。見圖3。

圖2 319例耐藥病例HIV-1基因亞型分布Figure 2 The distribution of HIV-1 subtypes in 319 drugresistant cases

圖3 治療病毒學(xué)失敗病例中耐藥與非耐藥病例HIV-1基因亞型分布頻率的比較Figure 3 The distribution and prevalence of drug-resistant and wild-type HIV-1 subtypes in the patients failing antiretroviral therapy

3 討論

本研究顯示，重慶地區(qū)HIV-1感染者ART治療1年后，一線方案病毒學(xué)失敗率達(dá)10.5%，耐藥率達(dá)9.7%，明顯高于我國山東、云南、河南和廣西等地區(qū)的耐藥率數(shù)據(jù)[5-6]，也明顯高于泰國[7]、印 度[8]等發(fā)展中國家報道的耐藥率監(jiān)測結(jié)果（5.0%左右）。本組319例耐藥病例的耐藥分析結(jié)果顯示：①NNRTI類藥物耐藥率接近100%，其中NVP、DLV和EFV耐藥率都在95%以上，而新一代NNRTI代表藥物ETR耐藥率則明顯較低（39.5%）；②NRTI耐藥發(fā)生率低于NNRTI，但仍達(dá)91.5%，其中3TC和FTC耐藥發(fā)生率最高（接近90%），AZT耐藥發(fā)生率最低（僅11.0%），常用藥物TDF耐藥率亦達(dá)47.0%；③PI耐藥發(fā)生率極低，僅3例（0.9%）檢出PI耐藥位點(diǎn)突變。以上結(jié)果提示：①我院HIV-1耐藥情況較為嚴(yán)重，應(yīng)引起足夠重視；②對一線ART藥物產(chǎn)生耐藥是導(dǎo)致本地區(qū)HIV-1感染者病毒學(xué)失敗的主要原因；③我院HIV-1耐藥最為嚴(yán)重的藥物包括3種NNRTI類藥物（NVP、DLV、EFV）和2種NRTI類藥物（3TC、FTC）；④AZT和PI類藥物由于耐藥屏障高，耐藥情況尚不嚴(yán)重，特別是PI類藥物耐藥發(fā)生率極低；⑤TDF和ETR作為新一 代NRTI與NNRTI類藥物的代表品種，雖然耐藥率顯著低于老一代品種，但40%左右的耐藥率仍具有警示意義。至于本組病例耐藥率較高的原因，可能本中心為重慶地區(qū)最大的艾滋病抗病毒治療定點(diǎn)機(jī)構(gòu)，管理的重癥病例和晚期病例較多有關(guān)，因?yàn)榇祟惒±退幇l(fā)生率較高。

本研究耐藥突變位點(diǎn)分析顯示，M184V/I和K65R/N是最常見的NRTI類藥物基因突變位點(diǎn)，而NNRTI類藥物常見的基因突變位點(diǎn)包括K103N/R/S、G190A/S/E/Q、V179D/E和V106M/A等。M184V/I突變會導(dǎo)致HIV-1對3TC和FTC產(chǎn)生高度耐藥性，且接受3TC和TDF方案者M(jìn)184V/I突變發(fā)生率顯著高于接受FTC和TDF方案者[9-11]。我國免費(fèi)抗病毒藥物目錄中并無FTC供應(yīng)，這可能是我國HIV-1感染者易發(fā)生M184V/I突變的原因之一。K65R/N突變可導(dǎo)致HIV-1對3TC、FTC、DDI和ABC敏感率明顯下降，但對AZT和D4T無影響[12-13]。M184V/I和K65R/N兩突變位點(diǎn)的高頻率分布可解釋本組病例廣泛存在的對3TC、FTC和ABC等藥物的高度耐藥性。NNRTI類藥物常見的耐藥突變位點(diǎn)在本組病例中均有檢出，其中K103N/R/S、G190A/S/E/Q、V179D/E和V106M/A 4種 突變的發(fā)生頻率均在40%左右，多種突變位點(diǎn)單獨(dú)或組合存在都可導(dǎo)致病毒對NVP、DLV和EFV的高度耐藥[14-15]，這可解釋本組病例NNRTI類藥物耐藥性極高的現(xiàn)象。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在一線ART治療失敗的HIV-1感染者中，無論是否存在耐藥，HIV-1亞型均以CRF01_ AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B、CRF55_01B為5種主要的流行亞型，而CRF52_01B、CRF57_BC、CRF59_01B、CRF 67_01B等亞型少見，這與蘇迎盈等[16]、陳孫云等[17]調(diào)查結(jié)果相符，提示HIV-1基因亞型與耐藥發(fā)生無顯著關(guān)聯(lián)。雖然我們發(fā)現(xiàn)病毒學(xué)失敗但未檢出耐藥的感染者CRF08_BC亞型更多見，但由于本組病例樣本量不大，尚不易判斷其臨床意義。

總之，本研究通過對348例一線ART方案治療1年后出現(xiàn)病毒學(xué)失敗的HIV-1感染者以及其中319例檢出病毒耐藥病例的回顧性研究，發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)一線ART治療失敗患者耐藥發(fā)生率高，耐藥是HIV-1感染者病毒學(xué)失敗的主要原因；耐藥最為嚴(yán)重的藥物包括NVP、DLV、EFV、3TC和FTC，AZT耐藥情況尚不嚴(yán)重，PI類藥物耐藥發(fā)生率極低；耐藥與HIV-1基因型無相關(guān)性。然而，本組部分病例存在臨床資料不齊全，雖不至于影響主要結(jié)果的分析，但仍是本研究作為回顧性研究的不足之處。