林 娟，晉 龍，吳晶晶，郭國棟

惡性黑色素瘤的診斷依賴于HE及免疫組化染色結(jié)果。大部分黑色素瘤含有黑色素細(xì)胞，這影響了HE組織細(xì)胞形態(tài)觀察，且免疫組化中DAB染色呈棕黃色或棕褐色，易被黑色素顆粒物掩蓋，影響判讀。孫麗君和黃斌[1]提出的雙重氧化脫黑色素顆粒方法能較好的脫去黑色素顆粒；傳統(tǒng)的高錳酸鉀或過氧化氫也能夠脫去黑色素顆粒，有研究證實(shí)37 ℃溫箱加熱高錳酸鉀及65 ℃水浴加熱過氧化氫可加快祛掉黑色素[2-3]；微波加熱法也能加快脫去黑色素顆粒[4-5]。上述方法均能達(dá)到脫色素的效果，但未見文獻(xiàn)對(duì)脫黑色素后HE及免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)的比較。本實(shí)驗(yàn)比較5種脫色素方法對(duì)HE及免疫組化染色結(jié)果的影響，用于輔助惡性黑色素瘤的鑒別診斷。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集福建省立醫(yī)院病理科2015～2019年診斷的20例惡性黑色素瘤。其中男性11例，女性9例，患者年齡42～87歲，平均65.9歲。主要發(fā)病部位眼球5例、鼻腔8例、四肢7例。

1.2 主要試劑和儀器高錳酸鉀、草酸、30%過氧化氫購自同春藥業(yè)；Ki-67、Melan-A、HMB45、p130Cas單克隆抗體購自福州邁新公司。Leica RM2245切片機(jī)，美的M1-211A微波爐。

1.3 試劑配制0.5%高錳酸鉀：0.5 g高錳酸鉀+100 mL蒸餾水；5%草酸：5 g草酸+100 mL蒸餾水；15%、10%、7.5%、5%過氧化氫：30%過氧化氫100 mL、50 mL、25 mL、15 mL+100 mL蒸餾水。

1.4 方法

1.4.1組織切片制備 20例石蠟組織標(biāo)本3 μm厚連續(xù)切取切片46張。每組病例6張用于HE脫色前后對(duì)比染色，24張用于免疫組化(4種抗體)，16張用于4種濃度過氧化氫脫色素后免疫組化染色。

1.4.2脫色素方法 (1)高錳酸鉀脫色素法：0.5%高錳酸鉀10～20 min，2.5%草酸漂泊1～2 min。(2)高錳酸鉀(微波加熱)脫色素法：將切片放入盛有50 mL 0.5%高錳酸鉀的立式染缸，置微波爐中并調(diào)至最低檔輻射1 min，待冷卻2.5%草酸漂泊1～2 min。(3)過氧化氫(水浴加熱)脫色素法：將切片放入盛有50 mL(15%、10%、7.5%、5%)過氧化氫的立式染缸內(nèi)，置65 ℃水浴箱3～6 h。(4)過氧化氫(微波加熱)脫色素法：將切片放入盛有50 mL 15%過氧化氫的立式染缸內(nèi)，置微波爐最低檔加熱5～15 min。(5)雙重氧化脫色素法：15%過氧化氫30 min，蒸餾水洗后滴加0.5%高錳酸鉀5 min，水洗滴加2.5%草酸5 min。上述5種方法脫色素過程均在鏡下觀察黑色素基本消失后，待冷卻水洗。

1.4.3HE染色 組織切片脫蠟至水，流水沖洗后置蘇木精5 min，分化返藍(lán)，伊紅染色，脫水、透明、封片。

1.4.4免疫組化MaxVision兩步法 石蠟組織切片脫蠟、水化后進(jìn)行酸修復(fù)；過氧化物酶阻斷劑封閉內(nèi)源性過氧化酶活性；加一抗(Ki-67、Melan-A、HMB45、p130Cas)室溫孵育；再加酶標(biāo)二抗孵育；DAB顯色；蘇木精復(fù)染；脫水、透明、封片。

1.4.5脫黑色素前、后免疫表達(dá)符合情況判讀 陽性強(qiáng)度一致，且陽性百分率差異<10%定義為符合；陽性強(qiáng)度基本一致，陽性細(xì)胞百分率差異<20%定義為基本符合；陽性強(qiáng)度差別較大或陽性強(qiáng)度基本一致，但陽性百分率差異≥30%定義為不符合。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果高錳酸鉀脫色素法：細(xì)胞裂隙稍變大，細(xì)胞質(zhì)伊紅上色效果不佳，胞核胞質(zhì)顏色對(duì)比不夠明顯。高錳酸鉀(微波加熱)脫色素法：HE染色結(jié)果掉片率10%左右，細(xì)胞形態(tài)輕度改變，輕度腫脹、模糊，胞核胞質(zhì)染色均很淡，對(duì)比模糊不清。過氧化氫脫色素(水浴加熱)法：組織完整性保持較好，但HE結(jié)果細(xì)胞核染色較淡，核質(zhì)顏色區(qū)分欠佳。過氧化氫(微波加熱)法：出現(xiàn)細(xì)胞裂隙稍變大，細(xì)胞形態(tài)輕度改變。雙重氧化脫色素法：優(yōu)于其他方法，染色結(jié)果組織完整，細(xì)胞形態(tài)完好，細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)顏色對(duì)比明顯，染色清晰(表1，圖1)。

圖1 黑色素瘤組織不同方法脫黑色素后HE染色：A.高錳酸鉀脫黑色素后HE染色；B.高錳酸鉀(微波加熱)脫黑色素后HE染色；C.過氧化氫(水浴加熱)脫黑色素后HE染色；D.過氧化氫(微波加熱)脫黑色素后HE染色；E.雙重氧化脫黑色素后HE染色 圖2 惡性黑色素瘤組織不同方法脫黑色素后Ki-67免疫染色，MaxVision兩步法：A.高錳酸鉀脫色素法；B.高錳酸鉀(微波加熱)脫色素法；C.過氧化氫(水浴加熱)脫色素法；D.過氧化氫(微波加熱)脫色素法；E.雙重氧化脫色素法

表1 5種脫黑色素方法對(duì)HE染色的影響

2.2 免疫組化結(jié)果高錳酸鉀脫色素法：組織掉片率約20%，細(xì)胞形態(tài)改變，組織間隙增大，免疫定位不清。高錳酸鉀(微波加熱)脫色素法：脫黑色素后免疫組化染色不佳，組織掉片率約50%，細(xì)胞零散破碎，組織間隙變大，細(xì)胞、組織形態(tài)均改變較大，且極大影響抗原抗體反應(yīng)的陽性強(qiáng)度及定位。15%過氧化氫(水浴加熱)脫色素法：脫黑色素后免疫組化染色結(jié)果優(yōu)于其他方法，染色特異性較好，背景基本不著色或輕度著色，但出現(xiàn)陽性強(qiáng)度及陽性百分率稍變?nèi)醯那闆r。15%過氧化氫(微波加熱)脫色素法：細(xì)胞形態(tài)尚可，但陽性強(qiáng)度稍變?nèi)?，出現(xiàn)小范圍組織掉片，陽性覆蓋率降低，輕度背景著色。雙重氧化脫色素法：陽性強(qiáng)度變?nèi)踺^過氧化氫法明顯，且免疫組化結(jié)果陽性覆蓋率下降(圖2)。

為進(jìn)一步探究不同低濃度過氧化氫脫黑色素后對(duì)免疫組化染色結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)將過氧化氫配制為5%、7.5%、10%、15%四組不同濃度，對(duì)20例黑色素瘤病例進(jìn)行脫黑色素后行免疫組化Ki-67染色，結(jié)果顯示：5%過氧化氫對(duì)免疫組化染色結(jié)果影響最小，細(xì)胞形態(tài)得以保持，其陽性強(qiáng)度、定位及陽性覆蓋率相較脫黑色素前最為一致，5%、7.5%、10%、15%四組過氧化氫脫黑色素后Ki-67免疫染色符合率與基本符合率相加分別為95%、85%、80%、75%。本實(shí)驗(yàn)將20例惡性黑色素瘤石蠟標(biāo)本繼續(xù)用5%過氧化氫脫黑色素后行Ki-67、Melan-A、HMB45、p130Cas染色，上述4項(xiàng)免疫指標(biāo)的符合率分別為60%、75%、60%、30%，基本符合率分別為30%、20%、25%、55%，不符合率分別為10%、5%、15%、15%(表2)。

表2 5%過氧化氫脫黑色素后黑色素瘤組織中各抗體的表達(dá)符合情況

3 討論

黑色素是一種天然存在的低分子量材料，不溶于水和有機(jī)溶劑，在強(qiáng)堿中可以被溶解，也可以通過強(qiáng)氧化劑進(jìn)行脫色。黑色素顆粒常掩蓋原有的細(xì)胞形態(tài)，且在免疫染色過程中極易與DAB色原混淆。如何有效脫去黑色素顆粒，并最小程度影響染色結(jié)果對(duì)于提高伴有黑色素病變的正確診斷率具有重要價(jià)值。

細(xì)胞質(zhì)等電點(diǎn)pH在4.7～5.0，日常工作中HE染料pH 3.3～4.7，小于其等電點(diǎn)的pH，胞質(zhì)表現(xiàn)為堿式電離，可被酸性染料染色，細(xì)胞核的等電點(diǎn)pH在3.3～3.6，表現(xiàn)酸式電離，可被堿性染料染色，胞質(zhì)與胞核的染色被區(qū)分開。高錳酸鉀溶液的pH在7～7.5，組織經(jīng)高錳酸鉀溶液后使胞質(zhì)的pH向堿側(cè)移動(dòng)，浸入伊紅染液后可能接近其等電點(diǎn)，出現(xiàn)胞質(zhì)部分呈兼性離子，不對(duì)外顯電，因此伊紅較難使胞質(zhì)染色，出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)染色較淡。過氧化氫溶液pH為4.5，經(jīng)過氧化氫脫黑色素后胞質(zhì)染色過于突出，使得核質(zhì)染色對(duì)比不明顯?？赡芙?jīng)過氧化氫溶液后，胞質(zhì)pH向酸側(cè)移動(dòng)，接近3.3或以下，胞質(zhì)表現(xiàn)堿式電離，染色體也表現(xiàn)堿式電離，因此胞質(zhì)、胞核均易被帶負(fù)電荷的酸性染料染色，使得染色不易區(qū)分。經(jīng)高錳酸鉀溶液后，再經(jīng)過氧化氫溶液起到中和作用，胞質(zhì)胞核的pH幾乎不發(fā)生變化，因此雙重氧化脫黑色素后HE染色效果最為理想。

5種脫黑色素方法檢測Ki-67、Melan-A、HMB45、p130Cas分別定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜的免疫指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)15%過氧化氫脫色素后免疫表達(dá)相對(duì)較好，無掉片，組織完整，細(xì)胞形態(tài)較為完好，免疫指標(biāo)表達(dá)相對(duì)比較理想。其機(jī)制推測為高錳酸鉀在脫黑色素過程中一定程度上破壞了抗原的免疫原性和免疫反應(yīng)性。免疫組化抗原有效熱修復(fù)溫度為85 ℃及以上，而在使用微波修復(fù)過程溫度再次達(dá)到85 ℃以上，抗原過度修復(fù)，致使組織掉片率增加，影響細(xì)胞形態(tài)，并出現(xiàn)背景著色。過氧化氫可與組織中內(nèi)源性過氧化物酶反應(yīng)，使內(nèi)源性過氧化物酶不可逆的失活，從而阻斷組織中過氧化物酶的非特異染色，且其為辣根過氧化物酶的底物，催化DAB顯色。但當(dāng)過氧化氫濃度過大時(shí)顯色反應(yīng)過快會(huì)出現(xiàn)背景著色，且過量的過氧化氫可能抑制了酶的活性，出現(xiàn)抗原抗體的特異性及敏感性降低。因此為進(jìn)一步了解不同更低濃度過氧化氫對(duì)免疫組化結(jié)果的影響，本組將過氧化氫濃度降至10%、7.5%及5%同樣檢測上述4種免疫指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)5%過氧化氫脫黑色素后行免疫組化結(jié)果相對(duì)理想，這一結(jié)果也符合上述觀點(diǎn)。

惡性黑色素瘤組織在行HE染色時(shí)，應(yīng)用雙重氧化脫黑色素法染色結(jié)果最為理想，胞質(zhì)胞核染色清晰，對(duì)比明顯。惡性黑色素瘤組織應(yīng)用5%過氧化氫脫黑色素的方法行免疫染色細(xì)胞形態(tài)較好，背景干凈。免疫指標(biāo)Ki-67、Melan-A和HMB45陽性強(qiáng)度、百分率及定位較脫黑色素前較一致，p130Cas表達(dá)相比于脫黑色素前符合率欠佳。