尤炫合，吳迪偉，羅 明，周欣然，黃石書

青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸(adolescent idiopathic scoliosis, AIS)是最常見的一類三維脊柱畸形，椎旁肌病理性改變繼發(fā)的兩側(cè)椎旁肌失平衡是AIS發(fā)生、進(jìn)展的重要原因[1-2]。臨床肌肉標(biāo)本對于此類疾病的診斷和研究具有重要價(jià)值，但對于處理不當(dāng)或長期冷凍保存的肌肉標(biāo)本，由于冰晶的擠壓，肌纖維結(jié)構(gòu)遭到破壞。為解決上述問題，本科室嘗試一種針對冷凍肌肉組織修復(fù)的方法，主要通過增加組織切片修復(fù)環(huán)節(jié)，使組織病理形態(tài)更加接近于組織原本的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，有利于肌肉病理的診斷和研究，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料隨機(jī)選取20例保存于四川大學(xué)華西醫(yī)院生物樣本庫中的AIS凸側(cè)肌肉標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均簽署四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會知情同意書；(2)確診為AIS，并留有手術(shù)后切除凹凸兩側(cè)椎旁肌凍存樣本；(3)肌肉樣本保存較好。所有肌肉標(biāo)本取自手術(shù)中椎旁肌，離體后置于1.8 mL凍存管，并直接凍存于液氮罐，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱長期保存。肌肉標(biāo)本取出時(shí)呈柱狀，經(jīng)解凍、固定液處理后，樣本較散亂，形狀不規(guī)則，可分辨出肌肉紋理走向。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林(成都金山化學(xué)試劑公司)固定48 h，脫水、透明后，選取橫切面進(jìn)行石蠟包埋。采用石蠟組織切片機(jī)(LEICA RM2245)4 μm厚切片，每塊組織連續(xù)切片6張，65 ℃烤片45 min后脫蠟復(fù)水。分成傳統(tǒng)組和改良組，每組3張切片。改良組HE染色前，對切片進(jìn)行微波修復(fù)，配置1×檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(索萊寶C1032)250 mL，將切片浸入修復(fù)液后，放入微波爐中高火8 min修復(fù)2次，待檸檬酸鈉抗原修復(fù)液自然冷卻至室溫后，取出切片。傳統(tǒng)組HE染色無此步驟。兩組后續(xù)操作均在相同條件下進(jìn)行，將兩組切片浸入蘇木精染液中5 min，水洗；1%鹽酸乙醇分化10 s，水洗；1/400氨水返藍(lán)2 min，水洗；伊紅染2 min，水洗；梯度乙醇脫水1 min；TO透明劑透明15 min，中性樹膠封片。采用ZEISS Imager Z2顯微鏡采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)肌肉HE染色后肌纖維間的空白間隙所占百分比。采用Graphpad prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組HE染色結(jié)果比較：傳統(tǒng)組HE染色細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)顆粒間隙分明，肌肉呈現(xiàn)紅色，結(jié)締組織、血管呈現(xiàn)粉紅色，脂肪呈無色空洞。由于肌肉樣品直接液氮冷凍，肌纖維皺縮且內(nèi)部有很多空洞，組織形態(tài)鋪展較差(圖1A、B)。改良組HE染色可見肌纖維間隙變小、肌纖維內(nèi)部空洞變少，更接近標(biāo)準(zhǔn)肌纖維形態(tài)(圖1C、D)。同時(shí)，改良組HE染色的肌纖維內(nèi)空隙面積顯著小于傳統(tǒng)組(圖2)。

圖1 A、B.分別為低倍和高倍傳統(tǒng)組HE染色結(jié)果；C、D.分別為低倍和高倍改良組HE染色結(jié)果

圖2 傳統(tǒng)組和改良組HE染色組織間隙比較

3 討論

國內(nèi)外學(xué)者一直致力于改進(jìn)病理切片染色方法。對于因樣本固定、脫水處理不當(dāng)?shù)膯栴}，有學(xué)者通過EDTA修復(fù)組織，使得原本偏灰偏暗的染色結(jié)果變得更加清晰[3]；也有學(xué)者比較了不同返藍(lán)液的免疫組化染色效果[4]；在不影響染色效果的情況下，有學(xué)者報(bào)道了一種低成本的染料替代傳統(tǒng)的蘇木精[5]。

肌肉病理在神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病的診斷和研究占據(jù)著舉足輕重的地位，而HE染色是肌肉病理最基礎(chǔ)、最常用的研究手段。不良的染色效果不僅會影響到診斷準(zhǔn)確性，甚至有可能影響到未來學(xué)術(shù)研究的發(fā)展方向。影響病理結(jié)果的因素一方面是樣品前處理問題，另一方面是染色時(shí)操作不當(dāng)造成的。臨床肌肉標(biāo)本早期保存時(shí)可能存在不恰當(dāng)?shù)那闆r，為后續(xù)病理學(xué)研究帶來一定困難。

本實(shí)驗(yàn)選取的肌肉標(biāo)本是臨床脊柱側(cè)彎矯正手術(shù)中獲得的，在取樣后未經(jīng)異戊烷處理直接置于液氮，冷凍過程中產(chǎn)生大量冰晶，染色結(jié)果可見肌纖維內(nèi)部大量空洞，肌纖維間隙松散。此外，在肌肉病理的免疫組化或免疫熒光操作中，由于肌纖維收縮和冰晶對肌纖維的破壞，可能導(dǎo)致抗原定位不準(zhǔn)確，影響結(jié)果判讀。臨床和科研中肌肉樣本處理不當(dāng)并不少見，這也嚴(yán)重影響后續(xù)肌肉病理的診斷和研究。因此，本科室嘗試采用一種組織修復(fù)方法，主要通過增加組織切片修復(fù)環(huán)節(jié)，使冷凍后肌肉組織的HE染色呈現(xiàn)的組織病理形態(tài)更佳，有利于肌肉病理的診斷和研究。該方法修復(fù)肌纖維間隙和空洞的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，由于肌肉樣本的特殊性，此修復(fù)方法對于其他組織的修復(fù)效果還有待進(jìn)一步研究。

本文介紹了一種針對冷凍肌肉組織修復(fù)方法，該方法簡單有效，可適用于前期肌肉樣本處理不當(dāng)，但后續(xù)仍需要進(jìn)行肌肉病理的診斷和研究。