向 雙，段 松，袁懷志，沈昌瓊

近年來(lái)，大量研究顯示我國(guó)高達(dá)50%人群感染幽門(mén)螺桿菌(helicobacter pylori, HP)。隨著內(nèi)鏡技術(shù)在各級(jí)醫(yī)院的廣泛開(kāi)展，胃鏡已成為常規(guī)體檢項(xiàng)目。對(duì)于胃鏡初步檢查有問(wèn)題的患者需進(jìn)一步行病理檢查明確診斷，但出具病理報(bào)告需較長(zhǎng)時(shí)間。為滿足患者對(duì)報(bào)告時(shí)限的需求，有的病理科會(huì)根據(jù)組織類型和大小編輯不同處理程序或更換不同的處理試劑[1]，來(lái)加快報(bào)告速度，但耗時(shí)也需10～14 h，而運(yùn)用快速超聲組織處理技術(shù)則不到2 h。目前，快速組織處理儀的應(yīng)用已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道，但對(duì)于在常規(guī)工作中量大且時(shí)限要求短的胃鏡組織中卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選取同一組織來(lái)源的胃鏡標(biāo)本使用超聲組織處理技術(shù)，觀察其處理效果能否達(dá)到與傳統(tǒng)方式一樣效果，并對(duì)HE染色和HP檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織來(lái)源 選取重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院病理科，2019年6月內(nèi)鏡醫(yī)師診斷為胃炎并送檢2塊胃組織的患者，共40例80個(gè)蠟塊，分為實(shí)驗(yàn)組和常規(guī)組，每組40個(gè)蠟塊。其中男性23例，年齡(59±10)歲；女性17例，年齡(56±11)歲。

1.1.2主要儀器和試劑 常規(guī)組：賽默飛Excelsior AS自動(dòng)組織脫水機(jī)、10%中性福爾馬林(無(wú)錫江原實(shí)業(yè)公司)、無(wú)水乙醇(重慶川東化工公司)、環(huán)保透明劑[2](武漢宏茲生物公司)、切片石蠟56～58 ℃(滬試)。實(shí)驗(yàn)組：深圳美雅潔MAGTS-1200超聲快速組織處理儀、美雅潔組織固定、脫水、透明三合一復(fù)合試劑、切片石蠟56～58 ℃(滬試)。熒光定量?jī)x：賽默飛Qubit4.0、羅氏CobasZ480熒光定量PCR分析儀、DAKO CoverStainer全自動(dòng)HE染色機(jī)、石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒(北京厚生博泰公司)、HP核酸檢測(cè)試劑盒(北京新基永康公司)。

1.2 方法

1.2.1取材方法 將同一患者胃竇部位2塊組織，取材時(shí)分別放入2個(gè)包埋盒，每盒一塊，分為常規(guī)組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組在編號(hào)后加字母S便于區(qū)分。

1.2.2組織處理方法 常規(guī)組：采用常規(guī)程序，經(jīng)賽默飛Excelsior AS自動(dòng)組織脫水機(jī)進(jìn)行處理，全部完成需要約14 h。實(shí)驗(yàn)組：采用快速超聲組織處理儀。(1)開(kāi)啟儀器，將標(biāo)本放入脫水缸；(2)選擇內(nèi)鏡組織程序，儀器加熱至20 ℃處理8 min，加熱至50 ℃處理40 min，自動(dòng)降溫到35 ℃處理4 min，即完成固定脫水透明；(3)將標(biāo)本架轉(zhuǎn)入蠟缸，啟動(dòng)浸蠟程序，62 ℃處理5 min，63 ℃處理10 min。全部完成共需約70 min。兩組處理完成后均進(jìn)行包埋切片，所用試劑和處理程序見(jiàn)圖1。

圖1 兩種處理儀流程圖

1.2.3HE染色 每個(gè)蠟塊連續(xù)4 μm厚切片3張攤在一張玻片上。同時(shí)上載到Dako CoverStainer自動(dòng)染色機(jī)[3]，選擇相同程序進(jìn)行染色。

1.2.4DNA提取及濃度檢測(cè) 將每個(gè)蠟塊均連續(xù)5 μm厚切片10張，放入EP管中，此過(guò)程每切1個(gè)標(biāo)本均進(jìn)行清潔消毒，防止交叉污染。石蠟包埋組織基因組DNA提取按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。提取完成后，將每例樣本使用熒光定量?jī)x檢測(cè)DNA濃度，并編號(hào)登記。

1.2.5PCR檢測(cè) 使用羅氏CobasZ480PCR分析儀進(jìn)行檢測(cè)，HP核酸檢測(cè)[4]按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行程序設(shè)定。將兩組共80例樣本全部上機(jī)，按編號(hào)順序依次加樣至96孔位PCR反應(yīng)板。每批次加陰性、陽(yáng)性、臨界陽(yáng)性3個(gè)外標(biāo)對(duì)照品。實(shí)驗(yàn)全程按照同一操作規(guī)程進(jìn)行，嚴(yán)格遵守臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作導(dǎo)則及實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果兩組切片均用HE自動(dòng)染色機(jī)染色，共80張切片，經(jīng)1名技師、1名醫(yī)師根據(jù)《臨床技術(shù)操作規(guī)范(病理學(xué)分冊(cè))》切片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合染色滿意度、切片完整無(wú)刀痕等指標(biāo)進(jìn)行盲評(píng)打分。73張切片評(píng)分達(dá)90分，為甲級(jí)片。7張切片未達(dá)到甲級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。兩組HE染色效果見(jiàn)圖2、3，兩組甲級(jí)片符合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

圖2 常規(guī)組HE染色 圖3 實(shí)驗(yàn)組HE染色

表1 兩組HE、PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 DNA濃度結(jié)果80個(gè)標(biāo)本均成功提取DNA，依次使用賽默飛Qubit4.0熒光定量?jī)x進(jìn)行DNA濃度測(cè)定，所得結(jié)果中有6個(gè)標(biāo)本濃度低于50 ng/μL，兩組結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 兩組DNA濃度

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果兩組標(biāo)本各40例使用羅氏CobasZ480 PCR分析儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)PCR反應(yīng)圖(圖4、5)可以看出兩組中內(nèi)部質(zhì)控曲線在FAM和VIC兩種熒光素下信號(hào)均有明顯增長(zhǎng)，有典型的S曲線，且Ct值<35.00表現(xiàn)出良好一致性。兩組結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判讀，其陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

圖4 兩組PCR反應(yīng)圖FAM通道

圖5 兩組PCR反應(yīng)圖VIC通道

3 討論

組織標(biāo)本前固定在整個(gè)病理流程中至關(guān)重要，是常規(guī)診斷及后續(xù)免疫組化和分子檢測(cè)的前提。這就必須保證取材前固定時(shí)間充足[5]，因此兩組標(biāo)本均是在鉗取組織后立即固定于10%中性福爾馬林。每組標(biāo)本所用處理程序保持不變，對(duì)試劑濃度進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)測(cè)，確保標(biāo)本處理質(zhì)量。本組特選取同一病例、多塊組織的標(biāo)本作為分析對(duì)象，排除組織異質(zhì)性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾[6]。兩組HE染色共有7例未達(dá)甲級(jí)片標(biāo)準(zhǔn)，分析原因是由于取材部位不佳標(biāo)本量少，導(dǎo)致切片染色不佳；兩組各有3例DNA濃度低于50 ng/μL，其原因是標(biāo)本體積過(guò)小，組織處理后效果較差DNA含量較低。兩組方法從取材到PCR檢測(cè)均同一人員按相同標(biāo)準(zhǔn)流程操作，保證了實(shí)驗(yàn)過(guò)程的一致性。綜上，通過(guò)比較分析可以發(fā)現(xiàn)胃鏡標(biāo)本使用兩種不同的組織處理儀，其HE染色表現(xiàn)、PCR反應(yīng)曲線情況以及CT值各指標(biāo)均無(wú)明顯差異，與熊克美等[7]的報(bào)道相符。此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用可以較大程度彌補(bǔ)傳統(tǒng)組織處理儀的缺點(diǎn)，能有效解決病理科常規(guī)工作中門(mén)診報(bào)告及時(shí)性的問(wèn)題。為將來(lái)HP的精準(zhǔn)治療個(gè)體化用藥檢測(cè)提供了相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，有了快速發(fā)出報(bào)告的基礎(chǔ)條件，通常1～2天就能出具常規(guī)和分子檢測(cè)報(bào)告[8]。在病理科實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的大環(huán)境下，該方法能解決工作所需，可滿足患者迫切取報(bào)告的需求，有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，值得推廣應(yīng)用。