葉 偉，徐建平，宋蓉蓉，趙潔婷，李會(huì)方，史先鋒，孟 剛

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，且其發(fā)病率逐年增高，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占85%，其5年生存率僅為16%[1]。對(duì)于沒(méi)有驅(qū)動(dòng)基因改變的晚期NSCLC患者的治療方案有限。近年來(lái)，免疫療法被證明比傳統(tǒng)的治療方法更有效，2016年美國(guó)食品藥物管理局(food and drug administration, FDA)批準(zhǔn)帕博利珠單抗(pembrolizumab)作為晚期PD-L1高表達(dá)(TPS≥50%)NSCLC患者的一線(xiàn)治療方案，并作為于鉑類(lèi)化療治療后出現(xiàn)疾病進(jìn)展的患者和PD-L1(TPS≥1%)NSCLC患者的二線(xiàn)治療推薦[2-4]。由于很多晚期患者已不適合行手術(shù)切除[5]，而病理診斷和免疫組化檢測(cè)通常只能依賴(lài)于CT引導(dǎo)下肺穿刺和經(jīng)支氣管鏡的小活檢組織標(biāo)本以及經(jīng)支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)下(endobronchial ultrasound, EBUS)細(xì)針穿刺(transbronchial needle aspiration, TBNA)和漿膜腔積液穿刺的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本。本文旨在探討PD-L1在NSCLC小活檢與手術(shù)標(biāo)本以及細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)標(biāo)本中表達(dá)的一致性，以期了解小活檢及細(xì)胞學(xué)標(biāo)本在PD-L1檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集安徽省胸科醫(yī)院2019年1月～2020年8月766例病理診斷明確的NSCLC標(biāo)本。其中男性535例，女性231例；年齡29～90歲，中位年齡69歲；標(biāo)本類(lèi)型：手術(shù)標(biāo)本200例，氣管鏡活檢219例，肺穿刺活檢195例，EBUS-TBNA細(xì)胞塊69例，漿膜腔積液包埋細(xì)胞塊83例；標(biāo)本來(lái)源：肺619例，淋巴結(jié)60例，胸腔積液79例，心包積液4例，胸壁3例，胸膜1例。

1.2 標(biāo)本制備活檢組織標(biāo)本取出后立即用10%中性福爾馬林固定，手術(shù)切除組織標(biāo)本離體后0.5 h內(nèi)經(jīng)10%中性福爾馬林固定，完成取材后將樣本轉(zhuǎn)移至Lecia-ASP300S全封閉組織處理器中進(jìn)行脫水，后進(jìn)行石蠟包埋、切片。細(xì)胞學(xué)標(biāo)本：(1)EBUS-TBNA細(xì)胞塊，標(biāo)本取出后置于10 mL生理鹽水中，自然沉淀形成固形物后經(jīng)漏斗狀包埋紙過(guò)濾掉液體成分，放入10%中性福爾馬林中固定，后處理程序與組織學(xué)標(biāo)本一致；(2)胸水包埋細(xì)胞塊，將200～800 mL新鮮胸腔積液1 600 r/min離心5 min，倒去上清液，余下標(biāo)本中加入95%乙醇振蕩至少15 min，再次經(jīng)1 600 r/min離心3 min，靜止3 h以上直至細(xì)胞團(tuán)變硬和收縮，將成型良好的細(xì)胞塊放入10%中性福爾馬林中固定，后處理程序與組織學(xué)標(biāo)本一致。所有組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)標(biāo)本均采用WHO(2015)肺腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理診斷，必要時(shí)行TTF-1、Napsin A、p40、Syn、CgA等免疫組化標(biāo)記以確定NSCLC的診斷，腫瘤細(xì)胞數(shù)≤100個(gè)的病例被排除。

1.3 免疫組化免疫組化染色采用EnVision兩步法。所有標(biāo)本完成脫水后石蠟包埋、切片、染色，在帶正電荷玻片上連續(xù)4 μm厚切片，脫蠟后，打開(kāi)DAKO Autostainer Link48軟件平臺(tái)，打印并粘貼標(biāo)簽，放入PT-Link修復(fù)儀中進(jìn)行抗原修復(fù)(pH 6.0檸檬酸修復(fù)液，97 ℃ 25 min)，上機(jī)滴加PD-L1單克隆抗體(22C3，濃縮液，1 ∶50稀釋)20 ℃孵育40 min，余流程如下：Buffer沖洗，EnV FLEX+Mouse LINKER 30 min，Buffer沖洗，EnV FLEX/HRP 30 min，Buffer沖洗，Buffer 5 min，F(xiàn)LEX DAB+Sub-Chromo 10 min，Buffer沖洗，DAB Enhance 5 min，Buffer沖洗，DI Water沖洗，復(fù)染蘇木精、脫水、透明、中性樹(shù)膠封固；以正常扁桃體為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)原發(fā)性抗原的NSCLC標(biāo)本為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判讀PD-L1表達(dá)評(píng)分由專(zhuān)業(yè)病理學(xué)家采用雙盲法判讀；部分或完全的細(xì)胞膜呈PD-L1染色的腫瘤細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞；細(xì)胞質(zhì)染色不能定義為陽(yáng)性，腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)的所有染色以及腫瘤細(xì)胞相鄰的間質(zhì)細(xì)胞、壞死細(xì)胞以及沉著的炭末著色均定義為陰性；未納入評(píng)價(jià)的免疫細(xì)胞PD-L1表達(dá)可作為陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照。使用腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞比率，即TPS評(píng)分(任何強(qiáng)度的部分或完全胞膜染色的活腫瘤細(xì)胞占標(biāo)本中所有的活腫瘤細(xì)胞的百分比)進(jìn)行PD-L1表達(dá)分類(lèi)：TPS≥50%為高表達(dá)組，1%～49%為低表達(dá)組，<1%為無(wú)表達(dá)組[2-3]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(例)和百分比(%)表示；組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kappa一致性檢驗(yàn)比較多種方法結(jié)果的一致性，一般認(rèn)為當(dāng)Kappa≥0.75時(shí)，表明兩者一致性較好；0.4≤Kappa<0.75時(shí)，表明一致性適中；Kappa<0.4時(shí)，表明兩者一致性較差。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系臨床病理資料顯示，PD-L1 TPS≥50%和TPS<50%兩組間性別、腫瘤類(lèi)型、標(biāo)本類(lèi)型、pTNM分期、標(biāo)本來(lái)源差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 非小細(xì)胞肺癌中PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 配對(duì)的小活檢和手術(shù)標(biāo)本中PD-L1的表達(dá)手術(shù)標(biāo)本陽(yáng)性被認(rèn)為是真陽(yáng)性。當(dāng)以TPS≥50%為閾值評(píng)估腫瘤組織中PD-L1表達(dá)時(shí)，80.8%(59/73)的小活檢和手術(shù)標(biāo)本結(jié)果一致，一致性適中(Kappa=0.483，P<0.001)，檢測(cè)的敏感性為43.5%，特異性為98.0%(圖1)，其中14例不一致病例中有13例為假陰性，1例為假陽(yáng)性(表2)。當(dāng)以TPS≥1%為閾值時(shí)，80.8%(59/73)的小活檢和手術(shù)標(biāo)本結(jié)果一致，一致性適中(Kappa=0.618，P<0.001)，檢測(cè)的敏感性為73.9%，特異性為92.6%，其中14例不一致病例中有12例為假陰性，2例為假陽(yáng)性(表3)。

圖1 PD-L1在配對(duì)小活檢標(biāo)本和手術(shù)標(biāo)本中的表達(dá)，EnVision兩步法：A.右上肺支氣管鏡活檢，TPS：95%；B.患者5天后行右上肺葉手術(shù)切除，TPS：90% 圖2 配對(duì)EBUS-TBNA細(xì)胞塊和組織學(xué)樣本中PD-L1的表達(dá)，EnVision兩步法：A.第7組淋巴結(jié)EBUS-TBNA細(xì)胞塊，TPS：90%；B.患者同時(shí)行左下肺氣管鏡活檢，TPS：80% 圖3 配對(duì)漿膜腔積液細(xì)胞塊和組織學(xué)樣本中PD-L1的表達(dá)，EnVision兩步法：A.右側(cè)胸水包埋細(xì)胞塊，TPS：60%；B.患者3天后行肺穿刺活檢，TPS：80%

表2 使用閾值TPS≥50%分析PD-L1在小活檢和手術(shù)標(biāo)本中表達(dá)的一致性

表3 使用閾值TPS≥1%分析PD-L1在小活檢和手術(shù)標(biāo)本中表達(dá)的一致性

2.3 配對(duì)的EBUS-TBNA細(xì)胞塊和組織學(xué)樣本中PD-L1的表達(dá)組織學(xué)標(biāo)本陽(yáng)性被認(rèn)為是真陽(yáng)性。當(dāng)以TPS≥50%為閾值評(píng)估腫瘤組織中PD-L1的表達(dá)時(shí)，86.9%(20/23)的EBUS-TBNA細(xì)胞學(xué)塊和組織學(xué)標(biāo)本結(jié)果一致，一致性適中(Kappa=0.679，P<0.05)，敏感性為71.4%，特異性為93.8%(圖2)，3例不一致病例中有2例為假陰性，1例為假陽(yáng)性(表4)。當(dāng)以TPS≥1%為閾值時(shí)，91.3%(21/23)的EBUS-TBNA細(xì)胞塊和組織學(xué)標(biāo)本結(jié)果一致，一致性較好(Kappa=0.795，P<0.001)，敏感性為93.8%，特異性為85.7%，2例不一致病例中有1例為假陰性，1例為假陽(yáng)性(表5)。

表4 使用閾值TPS≥50%分析PD-L1在EBUS-TBNA細(xì)胞塊和組織學(xué)標(biāo)本中表達(dá)的一致性

表5 使用閾值TPS≥1%分析PD-L1在EBUS-TBNA細(xì)胞塊和組織學(xué)標(biāo)本中表達(dá)的一致性

2.4 配對(duì)的漿膜腔積液細(xì)胞塊和組織學(xué)樣本PD-L1的表達(dá)組織學(xué)標(biāo)本陽(yáng)性被認(rèn)為是真陽(yáng)性。當(dāng)以TPS≥50%為閾值評(píng)估腫瘤組織中PD-L1表達(dá)時(shí)，85.3%(29/34)的漿膜腔積液細(xì)胞塊和組織學(xué)標(biāo)本結(jié)果一致，一致性適中(Kappa=0.465，P<0.05)，敏感性為42.9%，特異性為96.3%(圖3)，5例不一致病例中有4例為假陰性(表6)；當(dāng)以TPS≥1%為閾值時(shí)，58.8%(29/34)的漿膜腔積液細(xì)胞塊和組織學(xué)標(biāo)本結(jié)果一致，一致性較差(Kappa=0.176，P>0.05)，敏感性為57.1%，特異性為61.5%，14例不一致病例中有9例假陰性，5例假陽(yáng)性(表7)。

表6 使用閾值TPS≥50%分析PD-L1在漿膜腔積液細(xì)胞塊和組織學(xué)標(biāo)本中表達(dá)的一致性

表7 使用閾值TPS≥1%分析PD-L1在漿膜腔積液細(xì)胞塊和組織學(xué)標(biāo)本中表達(dá)的一致性

3 討論

PD-L1作為晚期NSCLC免疫治療療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物之一，其表達(dá)在應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療前選擇優(yōu)勢(shì)人群中有重要意義。但PD-L1表達(dá)狀態(tài)與各臨床病理因素的關(guān)系常常會(huì)出現(xiàn)相互矛盾的結(jié)果[6-9]，其主要原因可能為：所使用的PD-L1抗體以及染色評(píng)估方法不同，并且Ⅱ期藍(lán)印計(jì)劃[10]發(fā)現(xiàn)28-8、22C3、SP263對(duì)腫瘤細(xì)胞染色的一致性較高，而SP142等其他抗體間的一致性低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PD-L1表達(dá)與患者年齡無(wú)相關(guān)性，而PD-L1在男性患者、鱗狀細(xì)胞癌、晚期患者、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中表達(dá)較高，并且在不同類(lèi)型標(biāo)本之間的表達(dá)存在差異，這與Zhang等[7]的研究結(jié)果相似，提示腫瘤進(jìn)展因素傾向于PD-L1表達(dá)增加，也進(jìn)一步驗(yàn)證PD-L1高表達(dá)是NSCLC預(yù)后不良的因素[8]。

小活檢組織是獲取腫瘤生物學(xué)信息的重要手段，這些信息可以定義和確定NSCLC的治療策略，小活檢標(biāo)本的獲取通常先于手術(shù)標(biāo)本，而其PD-L1檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性受諸多因素的影響：腫瘤的異質(zhì)性[11]，病理醫(yī)師判讀時(shí)的主觀性[7]，期間放、化療和靶向治療對(duì)于PD-L1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用[12]等；并且有研究認(rèn)為免疫介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷可能在治療中起作用，而上調(diào)PD-L1表達(dá)可使癌細(xì)胞逃避免疫介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用[13]。本組結(jié)果顯示，在配對(duì)的小活檢和手術(shù)標(biāo)本中，無(wú)論以TPS≥50%還是≥1%為閾值評(píng)估PD-L1表達(dá)時(shí)，兩者的一致性均為80.8%，這與既往的研究結(jié)果相似[14]。另一項(xiàng)研究[15]發(fā)現(xiàn)當(dāng)以TPS≥50%為閾值時(shí)，兩者一致性為92.2%，當(dāng)以≥1%為閾值時(shí)，一致性為76.7%；以上結(jié)果均表明小活檢是可以替代手術(shù)標(biāo)本完成PD-L1檢測(cè)。同時(shí)，進(jìn)一步分析可以發(fā)現(xiàn)在所有不一致病例中假陰性率非常高，而有學(xué)者認(rèn)為盡可能多的取材(至少4個(gè)活檢標(biāo)本)以及病理學(xué)家PD-L1判讀前的專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)會(huì)增加小活檢PD-L1檢測(cè)的準(zhǔn)確性[16-17]。

由于晚期NSCLC患者耐受能力差，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本可能是唯一能夠獲取的標(biāo)本[18]。EBUS-TBNA是一種安全、微創(chuàng)的肺、縱隔以及肺門(mén)淋巴結(jié)明確診斷和分期技術(shù)[19]，其取材方式并非從單個(gè)固定部位提取組織，而是采用來(lái)回運(yùn)動(dòng)反復(fù)吸取，其實(shí)是一種動(dòng)態(tài)過(guò)程，因此更易獲取到更廣泛的區(qū)域，更接近腫瘤組織的真實(shí)狀態(tài)；但腫瘤細(xì)胞數(shù)目則是影響PD-L1檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素[20]。本組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示EBUS-TBNA細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中PD-L1高表達(dá)率為34.8%，這可能與細(xì)胞學(xué)標(biāo)本患者的腫瘤分期較晚有一定關(guān)系，而分期較晚PD-L1更易高表達(dá)[7-8,21]。此外，Sakata等[22]在對(duì)配對(duì)的EBUS-TBNA細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)標(biāo)本PD-L1表達(dá)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，以TPS≥50%為閾值時(shí)，兩者的一致性為82%，當(dāng)以≥1%為閾值時(shí)，一致性為87%；Skov等[23]的研究結(jié)果顯示，以TPS≥50%為閾值時(shí)的一致性為94%，以≥1%為閾值時(shí)的一致性為85%。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相似，以TPS≥50%為閾值時(shí)的一致性為87%，當(dāng)以≥1%為閾值時(shí)的一致性為91%；由此可認(rèn)為EBUS-TBNA細(xì)胞塊可以替代組織學(xué)標(biāo)本完成PD-L1檢測(cè)。

雖然漿膜腔積液細(xì)胞塊在病理診斷及靶向基因檢測(cè)上的可行性已得到證實(shí)[24]，但在PD-L1表達(dá)的問(wèn)題上尚未得到統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，不同的實(shí)驗(yàn)室在制備細(xì)胞塊過(guò)程中固定劑的選擇、固定時(shí)間和制備方法差異明顯[25]。本組數(shù)據(jù)顯示PD-L1高表達(dá)率為9.6%，而既往研究結(jié)果不盡相同[26-27]。相關(guān)研究表明：細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中用乙醇固定可引起PD-L1免疫反應(yīng)性降低，并可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果[28]；而另一項(xiàng)研究則表明不同的固定劑對(duì)PD-L1表達(dá)的評(píng)估無(wú)顯著影響[29]。Grosu等[30]對(duì)應(yīng)用10%中性福爾馬林固定的漿膜腔積液細(xì)胞塊與配對(duì)的組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者的總體一致性為78%，當(dāng)以≥1%為閾值時(shí)的一致性為87.0%。本組結(jié)果與其不完全一致，顯示當(dāng)以≥50%為閾值時(shí)兩者的一致性為85.3%；當(dāng)以≥1%為閾值時(shí)，一致性下降為58.8%，提示采用較低閾值(TPS≥1%)評(píng)估時(shí)，其可能會(huì)錯(cuò)誤的分類(lèi)PD-L1表達(dá)狀況。分析其主要原因可能與95%乙醇固定相關(guān)，而關(guān)于細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的乙醇前固定以及固定時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)PD-L1表達(dá)的具體影響仍有待于深入分析。

綜上所述，PD-L1免疫組化在NSCLC小活檢、EBUS-TBNA細(xì)胞塊以及以高閾值(TPS≥50%)評(píng)估的漿膜腔積液細(xì)胞塊標(biāo)本中的檢測(cè)結(jié)果是可靠的，可作為免疫治療的循證學(xué)依據(jù)；然而在采用較低閾值(TPS≥1%)評(píng)估時(shí)，漿膜腔積液細(xì)胞塊標(biāo)本可能會(huì)錯(cuò)誤的分類(lèi)PD-L1表達(dá)，此時(shí)可能需要謹(jǐn)慎的重復(fù)評(píng)估。