趙子悅，陳玲玉，陶 瑞，王 瓊，趙大海，徐結(jié)茍

肺癌根據(jù)組織學(xué)特征可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)[1]。NSCLC主要由腺癌(adenocarcinoma, AC)和鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)組成[2]。肺癌的組織類型和分期主要依靠手術(shù)或穿刺標(biāo)本、呼吸道細(xì)胞的病理檢查，而病理學(xué)檢查通常具有創(chuàng)傷性。因此，非侵入性的血清蛋白質(zhì)、DNA以及非編碼RNA等生物學(xué)標(biāo)志物檢測(即液體活檢)，已逐漸發(fā)展為病理檢查的替代方法。近年探討微小RNA(microRNA, miRNA)作為肺癌的早期篩查、療效和預(yù)后判斷顯示了良好的應(yīng)用前景[3]，但其在區(qū)分肺癌組織類型的診斷價值方面尚未見報道。本實驗?zāi)康氖呛Y選血漿外泌體miRNAs，結(jié)合傳統(tǒng)的肺癌標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白片段19(CYFRA 21-1)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，以區(qū)分不同的肺癌組織類型，對不能經(jīng)病理檢查確定組織類型的肺癌患者選擇最佳治療方案具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1患者血漿miRNA高通量測序病例收集 收集2017年1～6月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科收治的慢性肺部炎癥、NSCLC和SCLC患者的血漿，各3例。肺癌患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)活檢標(biāo)本病理檢查確診為肺癌；(2)首次就診且未接受過手術(shù)、化療、放療等抗癌治療；(3)除肺癌外無其他癌癥。CT檢查排除慢性肺部炎癥患者的占位性病變。本實驗獲得安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2擴大肺癌患者miRNA篩查病例收集 選擇2017年6月～2018年12月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸重癥醫(yī)學(xué)科住院的肺癌患者80例。所有肺癌患者均經(jīng)病理證實，其中肺AC 38例，SCC 20例，SCLC 22例，均接受常規(guī)化療。入選肺癌標(biāo)準(zhǔn)：(1)無手術(shù)切除腫瘤；(2)除肺癌外，無其他組織腫瘤；(3)住院期間無急性呼吸道炎癥。收集患者信息，包括年齡、性別、肺癌病理分期以及血清肺癌標(biāo)志物CEA、NSE和CYFRA21-1。

1.2 方法

1.2.1患者血漿外泌體miRNA高通量測序 對慢性肺炎、NSCLC和SCLC患者的miRNA用Illumina HiSeq3000(上海晶能生物公司)進(jìn)行高通量測序(合同號GN20180296)。選擇在NSCLC和SCLC組之間表達(dá)差異的miRNA(P<0.005)，并且通過以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步擴大肺癌患者miRNA篩查：(1)平均表達(dá)信號值的比率≥2.5，或≤0.4；(2)組中miRNA的表達(dá)信號不允許與其他組中的任何患者重疊。

1.2.2血漿外泌體miRNA提取 用miRNasy血清/血漿試劑盒(德國Qiagen公司)分離純化血漿外泌體miRNA，取患者血清2 mL。最終可得14 μL總RNA，RNA濃度測定后，樣品保存在-80 ℃，待用。

1.2.3候選miRNA的逆轉(zhuǎn)錄及qPCR 每個RNA樣品2 μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(莖環(huán)法)，根據(jù)試劑盒說明書，使用Hairpin-itTM miRNA和U6 snRNA，采用RT-PCR定量試劑盒(上海吉瑪)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄后，根據(jù)試劑盒說明書，對4個候選miRNAs進(jìn)行定量PCR。所選4個miRNA的引物堿基序列如下：正向引物分別為CGCGTAAGGTGCATCTAGTGC(miR-18a-5p)，ACTCGGCGTGGCGTCG(miR-1307-3p)，CGCGTGAGGCTGGAGG(miR-A堿基序列5′-UGAGGCUGGAGGAUCGCA-3′)和CGCGGGCGGGC GGCGG(miR-B堿基序列5′-GGCGGGCGGCGGAG GGGC-3′)，共同反向引物為AGTGCAGGGTCCGAG GTATT。以候選miRNA的模擬物(上海吉瑪公司)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各候選miRNA的血漿濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析所有分析均采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。使用四分位數(shù)范圍的中位數(shù)計算患者隊列間臨床特征的差異。分類變量以數(shù)字和百分比表示。實驗和臨床實驗室結(jié)果的數(shù)據(jù)采用t檢驗或方差分析(ANOVA)進(jìn)行評估。t檢驗以P<0.05的變量進(jìn)一步納入Logistic回歸分析。對有顯著差異的變量采用二元Logistic分析進(jìn)行檢驗，并以95%CI表示。通過受試者工作特征曲線下面積(AUROC)分析評估候選miRNAs單獨或聯(lián)合血清學(xué)生物學(xué)標(biāo)志物的血漿水平對肺癌病理類型的預(yù)測能力。

2 結(jié)果

2.1 肺癌病理類型的候選血漿外泌體miRNA的篩選為探討血漿外泌體miRNA在NSCLC和SCLC中的表達(dá)差異，選擇NSCLC、SCLC和慢性肺部炎癥三組患者，每組各3例，進(jìn)行血漿外泌體miRNA高通量測序。

首次篩選慢性肺炎組和肺癌組(NSCLC+SCLC)差異表達(dá)的miRNA(P<0.05)，共篩選出43個miRNA。為減少miRNA數(shù)量，進(jìn)一步提高篩查的效率，在NSCLC和SCLC之間進(jìn)行第二輪篩選。初步選擇了4個候選miRNA，包括miR-18a-5p、miR-1307-3p和2個新的miRNA(尚未正式命名，暫命名為miR-A和miR-B)作為進(jìn)一步篩選的生物學(xué)標(biāo)志物(表1)。

表1 肺癌中選中的候選miRNA的表達(dá)

2.2 AC、SCC和SCLC中候選血漿外泌體miRNA水平的測定為了解4種候選miRNA在肺癌組織學(xué)類型鑒別中的診斷價值，對80例肺癌患者血漿中4種候選miRNA進(jìn)行qPCR檢測?；颊咝畔挲g、性別、肺癌病理分期詳見表2。

表2 肺癌患者的臨床特點

對候選miRNAs進(jìn)行qPCR分析顯示，AC組miR-A和miR-B的血漿濃度分別為19.33、212.73 fmol/L，顯著高于SCC組(6.08、28.43 fmol/L)和SCLC組(1.94、37.49 fmol/L)。AC和SCC中血漿中miR-18a-5p濃度分別為0.36、0.30 fmol/L，而SCLC為0.15 fmol/L。三組間miR-1307-3P水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。血清CEA、NSE和CYFRA21-1水平在AC、SCLC和SCC中分別升高(表3)。

表3 候選miRNA和血清學(xué)生物學(xué)標(biāo)志物的濃度

2.3 miR-A、miR-B和CEA與AC生物學(xué)標(biāo)志物的關(guān)系A(chǔ)C中miR-A、miR-B和CEA均升高，依據(jù)AUROC曲線對這些生物學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行單獨或聯(lián)合分析。miR-A、miR-B和CEA單獨預(yù)測AC的敏感性和特異性分別為52.6%和83.3%、68.4%和61.9%、55.3%和85.7%；當(dāng)miR-A與CEA聯(lián)合預(yù)測時效果最佳(P<0.001)，曲線下面積(AUC)為0.823，敏感性為57.9%，特異性為95.2%，說明miR-A提高了CEA對AC的預(yù)測價值(表4，圖1)。

表4 生物學(xué)標(biāo)志物對肺腺癌的診斷價值

圖1 AUROC分析血漿miR-A和miR-B以及血清CEA單獨或聯(lián)合檢測對肺腺癌的敏感性：A.血漿miR-A；B.血漿miR-B；C.血清CEA；D.聯(lián)合檢測

2.4 miR-18a-5p、miR-A和NSE與SCLC生物學(xué)標(biāo)志物的關(guān)系SCLC患者血清中NSE濃度升高，miR-A和miR-18a-5p降低(表3)。因此，AUROC分析了這些參數(shù)對SCLC的診斷價值。NSE、miR-A和miR-18a-5p單獨診斷SCLC的敏感性和特異性分別為63.6%和79.3%、77.3%和56.9%、81.8%和55.2%(P值分別為0.001、0.021和0.010)。miR-A聯(lián)合NSE特異性最佳，特異性提高到89.7%(表5，圖2)，說明該組合是SCLC的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

圖2 AUROC分析血漿miR-A和miR18a-5p以及血清NSE單獨或聯(lián)合對小細(xì)胞肺癌診斷的敏感性：A.血漿miR-A；B.血漿miR18a-5p；C.血清NSE；D.聯(lián)合檢測

表5 生物學(xué)標(biāo)志物對小細(xì)胞肺癌的診斷價值

3 討論

肺癌來源的外泌體miRNA在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起多種作用，并作為調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。如miR-21、miR-23a和miR-103a通過靶向不同的分子促進(jìn)血管生成，從而負(fù)向改變免疫細(xì)胞的功能[4-6]；miR-21/miR-29a和miR-494/miR-542-3p可增強腫瘤轉(zhuǎn)移作用[7-8]。在臨床研究中，血漿或血清中外泌體miRNA視為檢測診斷/預(yù)后的生物標(biāo)志物，或作為治療效果的預(yù)測因子[9]。這些研究大多集中在早期篩查、致癌機制和治療效果上。血漿外泌體miRNA作為區(qū)分不同組織類型肺癌的生物學(xué)標(biāo)志物，對于晚期NSCLC和SCLC不能通過穿刺病理檢查的肺癌患者，判斷其組織學(xué)類型對化療、免疫治療等治療方案的選擇至關(guān)重要。液體活檢與傳統(tǒng)的病理活檢相比，更有優(yōu)勢。外泌體miRNA從癌細(xì)胞或癌組織中釋放，并反映其來源細(xì)胞的miRNA表達(dá)模式[10-11]。因此，理論上可以通過檢測循環(huán)外泌體miRNA來區(qū)分不同的組織類型。本實驗發(fā)現(xiàn)2個新的miRNA(miR-A和miR-B)，特別是miR-A可作為肺AC和SCLC的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。循環(huán)miR-A單獨也可以作為AC的一個指標(biāo)，其特異性為83.3%，臨界值為17.78 fmol/L；而與CEA聯(lián)合使用時，特異性可達(dá)95.2%；與傳統(tǒng)的血清學(xué)蛋白生物學(xué)標(biāo)志物NSE聯(lián)用時，SCLC患者的特異性也提高到89.7%，臨界值≤8.81 fmol/L。因本組樣本量較少，需進(jìn)一步驗證miR-A在肺AC和SCLC中的診斷價值，其在肺AC發(fā)生、發(fā)展中的作用也應(yīng)進(jìn)一步探討。

本組通過高通量測序?qū)嶒灒x擇了4個外泌體miRNA作為區(qū)分肺癌組織學(xué)類型的候選生物學(xué)標(biāo)志物。定量PCR檢測和AUROC分析顯示，miR-A與血清學(xué)生物學(xué)標(biāo)志物CEA和NSE聯(lián)合使用具有較好的診斷價值，對肺AC和SCLC的特異性分別為95.2%和89.7%，臨界值分別為≥17.78和≤8.81 fmol/L。這些結(jié)果表明，miR-A聯(lián)合CEA或NSE是肺AC或SCLC潛在的診斷指標(biāo)。