任鵬飛，王 弦，李晶晶，琚 倩，孟晨旭，龍其河，金像婷，李煩繁

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]，確診時(shí)約50%已為晚期，骨是其主要的轉(zhuǎn)移部位之一，約40%患者可發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，肺癌骨轉(zhuǎn)移后患者的中位生存時(shí)間僅為6～10個(gè)月，經(jīng)過(guò)治療后1年生存率也僅為40%～50%，且嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。目前，影像學(xué)和骨代謝標(biāo)志物對(duì)于骨轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)多數(shù)只能在骨轉(zhuǎn)移發(fā)生和進(jìn)展時(shí)，存在一定的滯后性。因此，發(fā)現(xiàn)NSCLC骨轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵因子，對(duì)于骨轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的早期預(yù)測(cè)，以及患者的治療和預(yù)后具有重要意義。本組前期研究發(fā)現(xiàn)：2例PDGF-BB陽(yáng)性NSCLC患者在后續(xù)隨訪中發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的時(shí)間，較PDGF-BB陰性者早，提示PDGF-BB可能作為NSCLC骨轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)[3]。本組在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析PDGF-BB在NSCLC患者血清及組織中的表達(dá)情況，探究其與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(尤其是骨轉(zhuǎn)移)的關(guān)系，為預(yù)測(cè)NSCLC骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生及預(yù)后提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年1月～2019年12月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理確診為NSCLC，經(jīng)影像學(xué)檢查證實(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、隨訪資料和組織標(biāo)本完整的86例NSCLC作為轉(zhuǎn)移組，其中61例發(fā)生骨轉(zhuǎn)移納入骨轉(zhuǎn)移組，25例發(fā)生除骨轉(zhuǎn)移外的其他部位遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移納入除外骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組。另選取56例同期診斷為NSCLC、未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的標(biāo)本作為無(wú)轉(zhuǎn)移組。兩組患者年齡、性別、腫瘤大小及病理類型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。87例血液樣本取自2019年10月～2021年1月經(jīng)病理確診、未經(jīng)治療的NSCLC患者。根據(jù)患者的入院分期檢查將血液標(biāo)本分為三組，(1)骨轉(zhuǎn)移組：發(fā)生骨轉(zhuǎn)移；(2)除外骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組：除骨轉(zhuǎn)移外的其他部位遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(3)無(wú)轉(zhuǎn)移組：未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.2 主要試劑PDGF-BB酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購(gòu)于武漢伊萊瑞特公司，兔抗人PDGF-BB(bs-1316R)多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森公司，羊抗鼠/兔二抗、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。其余主要試劑如乙醇、二甲苯等均為市購(gòu)分析醇。

1.3 方法

1.3.1ELISA測(cè)定 所有患者在接受治療前于清晨空腹抽取，取靜脈血5 mL至普通離心管或采血管(采血管中不含抗凝劑、防腐劑或分離劑)，4 ℃放置30～45 min，3 000～5 000 r/min離心10 min，取上清檢測(cè)或保存在-80 ℃低溫冰箱。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行操作。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔、空白孔，向相應(yīng)的孔中加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品或血清樣品，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品均設(shè)置復(fù)孔，每孔100 μL。37 ℃溫育90 min，棄去液體，甩干。每孔加生物素化抗體工作液100 μL，37 ℃溫育1 h，洗板3次。每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，37 ℃溫育30 min，洗板5次。每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色。每孔加50 μL終止溶液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的OD值，根據(jù)酶標(biāo)儀所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品OD值及對(duì)應(yīng)濃度，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程式，將樣本的OD值代入方程，計(jì)算出樣本濃度，乘以稀釋倍數(shù)，得出血清中PDGF-BB的實(shí)際濃度。

1.3.2免疫組化 免疫組化染色采用SP法。將石蠟包埋組織4 μm厚切片、烘干、烤片，脫蠟水化，檸檬酸緩沖液(pH 6.0)高壓抗原修復(fù)，自然冷卻，加入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，滴加一抗PDGF-BB(1 ∶400)，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗5 min×3次，加入二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，分化，沖洗反藍(lán)，脫水，透明，封固。鏡下觀察蛋白表達(dá)情況并拍照。

1.4 結(jié)果判斷PDGF-BB定位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)。(1)按著色腫瘤細(xì)胞所占比例評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。(2)根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為陰性，1～4分為弱陽(yáng)性，5～8分為陽(yáng)性，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性；結(jié)果由兩位資深病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法。生存分析采用Log-rank檢驗(yàn)并行Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行單因素生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者血清中PDGF-BB的表達(dá)情況NSCLC骨轉(zhuǎn)移組、除外骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組、無(wú)轉(zhuǎn)移組患者的血清標(biāo)本分別為23例、26例、38例。血清中PDGF-BB的濃度均數(shù)在骨轉(zhuǎn)移組、除外骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組、無(wú)轉(zhuǎn)移組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)。骨轉(zhuǎn)移組和除外骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組患者血清中PDGF-BB的濃度均高于無(wú)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，而骨轉(zhuǎn)移組PDGF-BB濃度高于除外骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.077，圖1)。

表1 三組患者血清中PDGF-BB濃度

圖1 三組NSCLC患者血清中PDGF-BB濃度

2.2 NSCLC中PDGF-BB表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系PDGF-BB在NSCLC組織中同時(shí)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖2)。142例NSCLC中PDGF-BB的陽(yáng)性率為52.11%(74/142)，其中轉(zhuǎn)移組患者的PDGF-BB陽(yáng)性率為65.12%(56/86)，高于無(wú)轉(zhuǎn)移組(32.14%，18/56)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TNM分期Ⅲ期患者的PDGF-BB陽(yáng)性率為70.00%(21/30)，明顯高于Ⅰ期(33.33%，11/33)和Ⅱ期(53.16%，42/79)患者(P<0.05)；有區(qū)域淋巴轉(zhuǎn)移患者的PDGF-BB陽(yáng)性率為65.15%(43/66)，高于無(wú)區(qū)域淋巴轉(zhuǎn)移患者(40.79%，31/76，P<0.05)。PDGF-BB表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、病理類型均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，而與病理分期、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。

圖2 NSCLC中PDGF-BB的表達(dá)：A．PDGF-BB在鱗狀細(xì)胞癌組織中呈陰性，SP法；B．PDGF-BB在鱗狀細(xì)胞癌組織中呈陽(yáng)性，SP法；C．PDGF-BB在腺癌組織中呈陰性，SP法；D．PDGF-BB在腺癌組織中呈陽(yáng)性，SP法

2.3 NSCLC骨轉(zhuǎn)移組和除外骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組中PDGF-BB的表達(dá)86例轉(zhuǎn)移組患者中，骨轉(zhuǎn)移61例(70.93%)，除外骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移25例(29.07%)。骨轉(zhuǎn)移組PDGF-BB陽(yáng)性率為75.41%(46/61)，高于除外骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(40.00%，10/25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002，表3)。

表2 非小細(xì)胞肺癌中PDGF-BB表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表3 骨轉(zhuǎn)移組和除外骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組PDGF-BB表達(dá)情況[n(%)]

2.4 骨轉(zhuǎn)移組PDGF-BB表達(dá)與無(wú)骨轉(zhuǎn)移生存時(shí)間(bone metastasis-free survival, BMFS)的關(guān)系BMFS是指腫瘤患者確診后未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的生存時(shí)間。本組骨轉(zhuǎn)移患者的中位BMFS為13個(gè)月(10.70～15.30個(gè)月)。骨轉(zhuǎn)移患者中，PDGF-BB陽(yáng)性患者的中位BMFS為11個(gè)月(8.78～13.22個(gè)月)，PDGF-BB陰性患者的中位BMFS為22個(gè)月(16.32～27.68個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003，圖3)。

圖3 非小細(xì)胞肺癌骨轉(zhuǎn)移組中PDGF-BB表達(dá)與患者無(wú)骨轉(zhuǎn)移生存的關(guān)系

3 討論

肺癌骨轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的生存和生活質(zhì)量，但目前肺癌骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未明確。惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中有多種細(xì)胞(如成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨基質(zhì)細(xì)胞等)及細(xì)胞因子參與，如白介素-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factors, PDGFs)、甲狀旁腺激素相關(guān)肽等[4-6]。為探究NSCLC骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵因子，本課題組前期應(yīng)用蛋白芯片篩選出PDGF-BB，發(fā)現(xiàn)其在骨轉(zhuǎn)移灶組織中有更高的陽(yáng)性率。為進(jìn)一步探究PDGF-BB與NSCLC骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了初診NSCLC患者血清以及NSCLC手術(shù)標(biāo)本中PDGF-BB的表達(dá)，探究其在NSCLC骨轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用。

PDGF家族成員作為淋巴血管生成因子包括5個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的成員PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD[7-8]。PDGF通過(guò)與血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(platelet derived growth factor receptor, PDGFR)-α和PDGFR-β結(jié)合，激活PDGFR通路來(lái)發(fā)揮生物學(xué)作用。PDGF-BB是唯一能同時(shí)激活PDGFR-α和PDGFR-β的配體，表明PDGF-BB有著更強(qiáng)的激活PDGFR通路的生物學(xué)效應(yīng)[9-11]。有研究表明，PDGF-BB與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和遷移密切相關(guān)，PDGF-BB表達(dá)會(huì)使癌細(xì)胞將基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞招募到腫瘤中，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12-13]。腫瘤的進(jìn)行性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移還取決于脈管系統(tǒng)發(fā)育(即血管生成)，而PDGF-BB表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤血管的生成[14]。本組發(fā)現(xiàn)，在NSCLC患者血清中，骨轉(zhuǎn)移組和除外骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組PDGF-BB濃度均高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，提示PDGF-BB表達(dá)與NSCLC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示PDGF-BB可能參與了NSCLC包括骨轉(zhuǎn)移在內(nèi)的血行轉(zhuǎn)移過(guò)程。

有研究表明在骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中，TGF-β從骨基質(zhì)中釋放，通過(guò)Smad2/3/4信號(hào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌PDGF-BB[15]。同時(shí)，PDGFR-β通路還可通過(guò)自分泌和旁分泌機(jī)制激活[16-17]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞定植到骨。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中PDGF-BB陽(yáng)性率高于無(wú)轉(zhuǎn)移組；在轉(zhuǎn)移組中，骨轉(zhuǎn)移組PDGF-BB的陽(yáng)性率高于除外骨轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組。且在骨轉(zhuǎn)移組中，PDGF-BB陽(yáng)性患者的BMFS短于PDGF-BB陰性患者。上述結(jié)果提示：肺癌原發(fā)灶中PDFG-BB陽(yáng)性患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移尤其是骨轉(zhuǎn)移的可能性更高，且更早發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。PDFG-BB表達(dá)對(duì)于NSCLC骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生及發(fā)生時(shí)間具有一定的預(yù)測(cè)意義，但仍需進(jìn)一步的探索PDGFR-β信號(hào)途徑在NSCLC骨轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵分子及相應(yīng)作用機(jī)制。

此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)PDGF-BB在NSCLC組織中的表達(dá)與患者年齡、組織學(xué)分級(jí)和腫瘤大小無(wú)關(guān)，而與臨床病理分期和區(qū)域淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，與Zhang等[18]研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)槟[瘤的淋巴轉(zhuǎn)移依賴于淋巴管生成[19]，淋巴管生成因子包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和PDGF家族，PDGF-BB可以通過(guò)激活PDGFR-β信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)新的淋巴管形成，從而為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了直接通道[20-21]。

本實(shí)驗(yàn)為單中心回顧性研究，存在一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)主要探索PDGF-BB在NSCLC骨轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，研究對(duì)象包括鱗狀細(xì)胞癌和腺癌，有文獻(xiàn)報(bào)道鱗狀細(xì)胞癌和腺癌具有不同的轉(zhuǎn)移潛能，而本組并未發(fā)現(xiàn)PDGF-BB在腺癌和鱗狀細(xì)胞癌間的表達(dá)差異，可能是由于納入的鱗狀細(xì)胞癌病例數(shù)較少，后續(xù)可再納入更多鱗狀細(xì)胞癌病例，分別分析鱗狀細(xì)胞癌和腺癌中PDGF-BB表達(dá)與骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以便確定其在哪種類型NSCLC中更有價(jià)值。

綜上所述，PDGF-BB表達(dá)與NSCLC骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，對(duì)于NSCLC骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生及BMFS具有重要的預(yù)測(cè)價(jià)值，可能是NSCLC骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵因子。本組將進(jìn)一步研究其分子機(jī)制，為PDGF-BB成為NSCLC骨轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)及治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。