丁桂齡，劉艷芳，鄭建明

胰腺癌是一種侵襲性強、惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、預后差，且5年生存率僅為8%的惡性腫瘤[1]，胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)是胰腺癌中最常見的且在我國發(fā)病率排前十的惡性腫瘤，近年發(fā)病率呈上升趨勢[2]。因此，研究PDAC的發(fā)病機制、尋找PDAC早期診斷標志物和治療新靶點，進而提高患者生存率是亟待解決的問題。CD8分子是一種白細胞分化抗原，為部分T細胞表面具有的一種糖蛋白，活化的CD8+T細胞主要發(fā)揮免疫殺傷作用。Newell等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在預后差的腫瘤組織中，本該發(fā)揮殺滅腫瘤細胞作用的活化CD8+T細胞中存在大量不對腫瘤細胞起殺傷作用的“旁觀者”，以至于起殺傷作用的T細胞被腫瘤組織耗竭，且免疫檢查點抑制劑無效。目前，有關(guān)PDAC大切片中CD8表達與患者預后關(guān)系的報道罕見。本文采用免疫組化EnVision法檢測CD8在PDAC中的表達，探討其與臨床病理特征和預后的關(guān)系，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料選取2018年海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的57例胰腺癌標本，所有病例術(shù)前均未行任何新輔助治療，均由高年資病理醫(yī)師確診為原發(fā)PDAC。其中男性29例，女性28例，患者年齡28～74歲，中位年齡63歲。收集患者的臨床病理資料，包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、pTNM分期、胰周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、神經(jīng)侵犯、脈管癌栓等，隨訪資料通過定期門診復診或電話短信方式獲得，隨訪截止時間2020年4月20日。本實驗獲得海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 免疫組化兔抗人CD8單克隆抗體即用型(ZA-0508)及配套免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋公司。標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，行常規(guī)流程和胰腺腫瘤大切片流程分別制成3 μm厚石蠟小切片和4 μm厚石蠟大切片，所有切片均充分烤片后進行免疫組化EnVision法染色，以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。

1.3 結(jié)果判讀CD8蛋白主要定位于PDAC腫瘤間質(zhì)淋巴細胞胞膜。陽性細胞計數(shù)采用雙盲法，先在低倍鏡下進行全片閱覽并選取3～5個熱點區(qū)域，在高倍鏡下進行拍圖(40×)，再用Image-J軟件打開所拍圖片進行鼠標點擊法的細胞計數(shù)，當差異較大時再次計數(shù)，取其平均數(shù)。按照中位數(shù)劃分高、低表達組：大切片組CD8陽性細胞數(shù)>265個定義為高表達，小切片組CD8陽性細胞數(shù)>210個定義為高表達。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料如滿足正態(tài)分布和方差齊性，采用t檢驗，否則采用非參數(shù)檢驗；分類變量則采用χ2檢驗或Fisher檢驗；生存曲線采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗；單因素、多因素生存分析則采用Cox風險比例模型；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PDAC大、小切片組中CD8的表達CD8在PDAC大、小切片組均有表達(圖1、2)，大切片組CD8的表達顯著高于小切片組(Wilcoxon符號秩和檢驗Z=-2.912，P=0.004，圖3)。

圖1 胰腺導管腺癌大切片組中CD8的表達，EnVision法 圖2 胰腺導管腺癌小切片組中CD8的表達，EnVision法

圖3 胰腺導管腺癌大切片、小切片組中CD8的表達差異

2.2 PDAC大、小切片組中CD8表達與臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗對57例PDAC大、小切片中CD8表達與臨床病理特征的關(guān)系進行分析，發(fā)現(xiàn)大切片組中CD8表達與臨床病理特征均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。小切片組中CD8表達與腫瘤分化程度顯著相關(guān)(χ2=4.386，P=0.036，表1)。

表1 胰腺導管腺癌大、小切片組中CD8表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PDAC大、小切片組CD8表達及臨床病理特征與患者預后的關(guān)系57例PDAC中有4例失訪，余53例隨訪時間2.1～17.0個月(1個月按照30天計算)，期間31例死亡。研究共納入10個臨床病理參數(shù)(性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤分化程度、pTNM分期、有無胰周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、總淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、有無神經(jīng)侵犯、有無脈管癌栓)和2免疫組化參數(shù)(大、小切片中CD8表達)，通過Kaplan-Meier生存分析和Log-rank檢驗比較顯示6個參數(shù)與患者預后相關(guān)(圖4)。其中，大切片CD8高表達組的平均生存時間15.248個月(95%CI：14.169～16.327)，較CD8低表達組的平均生存時間9.960個月(95%CI：8.083～11.837)長，整體中位生存時間13.900個月(95%CI：11.964～15.836)，兩者間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=16.476，P<0.001，圖4)。小切片CD8高表達組的平均生存時間13.100個月(95%CI：11.415～14.785)，較CD8低表達組的平均生存時間12.243個月(95%CI：10.341～14.145)長，整體中位生存時間13.900個月(95%CI：11.964～15.836)，但兩者間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.508，P=0.219)。以上結(jié)果表明，PDAC大切片中高表達的CD8提示PDAC患者預后良好。采用Enter法進行單因素Cox回歸分析顯示：患者年齡(P=0.044)、腫瘤分化程度(P=0.010)、是否有胰周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.037)、總淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)(P=0.029)、是否有脈管癌栓(P=0.039)、胰腺癌大切片中CD8表達(P<0.001)與PDAC患者預后相關(guān)。采用Forward LR法進行多因素Cox回歸分析顯示：年齡(P=0.002)、腫瘤分化程度(P=0.012)、總淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目(P=0.003)、胰腺癌大切片中CD8表達(P<0.001，表2)是影響患者預后的獨立因素。以上結(jié)果表明，PDAC病理組織大切片中CD8的表達更能提示患者預后。

圖4 采用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank檢驗繪制與PDAC患者預后顯著相關(guān)變量的生存曲線：A.年齡；B.腫瘤分化程度；C.胰周淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；D.總淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)；E.脈管癌栓情況；F.大切片中CD8表達

表2 胰腺導管腺癌大、小切片組中CD8表達及臨床病理特征與患者預后的關(guān)系

3 討論

腫瘤微環(huán)境在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，微環(huán)境內(nèi)浸潤免疫細胞被視為機體對腫瘤的一種局部免疫反應。研究表明：腎癌、前列腺癌、膀胱癌中腫瘤浸潤CD8+T細胞的水平低于2.2%，患者在術(shù)后出現(xiàn)疾病進展的風險要高出4倍[4]；肝癌中腫瘤浸潤CD8+T細胞數(shù)量與患者預后、免疫治療及血管形成密切相關(guān)[5]。Galon等[6]報道基于浸潤性T淋巴細胞亞群及其標志物的免疫評分在指導結(jié)直腸癌治療和預后的重要性已被廣泛認可。然而，因胰腺癌獨特的免疫微環(huán)境和腫瘤異質(zhì)性，浸潤性T淋巴細胞在胰腺癌中的作用及預后價值尚不明確。既往研究[7-8]多采用常規(guī)石蠟小切片、流式細胞術(shù)、組織芯片技術(shù)等探討浸潤免疫細胞比例與患者臨床病理參數(shù)和預后間的關(guān)系，難免會遺漏組織重要生物學信息。丁桂齡等[9]報道病理組織大切片技術(shù)能夠?qū)⒄＝M織、病變組織、毗鄰組織、多個切緣等完整地呈現(xiàn)在一張切片上，有利于病理醫(yī)師對病變進行全面客觀的綜合性評估并與影像圖像進行比對，進而為決策手術(shù)方案和評估患者預后提供更加直觀的病理學基礎(chǔ)。本文采用胰腺腫瘤大切片技術(shù)[10]，探究PDAC微環(huán)境中浸潤CD8+T細胞與預后間的關(guān)系。

本實驗在57對PDAC大、小切片組中進行CD8免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)：(1)CD8+T細胞在腫瘤間質(zhì)中均有不同程度的表達，大切片組CD8的表達顯著高于小切片組且差異有統(tǒng)計學意義。提示同一患者術(shù)后樣本因組織取樣方式的差異，會導致研究結(jié)果的不同，大切片或許包含更多的組織信息。(2)大切片組CD8表達與PDAC臨床病理特征并無相關(guān)性，小切片組CD8表達與腫瘤分化程度有關(guān)。這可能與常規(guī)小切片取材的人為主觀性以及所包含組織信息不全等有關(guān)，這也間接表明大切片更能客觀真實地評估病理組織原有信息。(3)生存分析納入10個臨床病理參數(shù)和2免疫組化參數(shù)(大、小切片中CD8表達)共計12個參數(shù)，Cox單因素分析發(fā)現(xiàn)，小切片組中CD8表達與PDAC患者預后無關(guān)，Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)，年齡、腫瘤分化程度、總淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、大切片組中CD8表達是影響PDAC患者預后的獨立因素。由此，進一步表明，大切片中CD8表達更能提示PDAC患者的預后。這進一步驗證了大切片相比于小切片，更有利于病理學家對組織病變進行全面直觀的觀察和客觀真實地綜合性評估，進而更好地預測患者預后。

綜上所述，CD8是影響PDAC預后的獨立因素，且在大切片中表達上調(diào)，其高表達與患者預后良好密切相關(guān)。CD8有望成為胰腺癌患者治療的潛在靶標和預后評估的新指標，但相關(guān)機制有待深入分析。