牛云峰，楊 陽，王欣晨，沈素朋，郭 煒，董稚明

食管癌位居全球惡性腫瘤病死率的第6位。食管癌主要分兩類：食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)[1]。我國是ESCC的高發(fā)國，且地域分布上有明顯差異，河北省太行山地區(qū)是食管癌的高發(fā)區(qū)。ESCC的早期癥狀不明顯，起病較隱匿，多數(shù)患者出現(xiàn)癥狀時已是中晚期，且術后5年生存率較低，因此尋找早期診斷和預后評估的分子指標及發(fā)病機制是提高患者生存率的重要手段。非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶12(protein tyrosine phosphatase non-receptor type12, PTPN12)基因定位于染色體7q11.23，其N末端含有PTPs家族的保守磷酸酶結構，C端則為PEST序列(脯氨酸P、谷氨酸/門冬氨酸E、絲氨酸S及蘇氨酸T殘基)，所以也稱PTP-PEST[2]。PTPN12是一種重要的腫瘤抑制因子，在細胞中普遍表達，通過多個靶標的去磷酸化調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號傳導，是細胞遷移和黏附的重要調(diào)節(jié)劑，但有關PTPN12在ESCC中的表達及生物學特性的研究較少。因此，本實驗首先檢測PTPN12在ESCC組織中的表達情況，分析其與臨床病理特征的關系；其次檢測PTPN12在ESCC細胞系中表達情況，為進一步探討PTPN12在ESCC中的生物學作用。本實驗通過構建pcDNA3.1-PTPN12過表達質(zhì)粒，轉染ESCC細胞，檢測其對ESCC細胞體外增殖、遷移、侵襲能力的影響，從而為PTPN12抑制ESCC的發(fā)生、發(fā)展提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自德國PAN-Biotech公司；TRIzol購自北京索萊寶公司；反轉錄試劑盒、綠色體系均購自美國Promega公司；所用引物均由北京賽百盛基因公司合成；兔抗人PTPN12多克隆抗體(E-AB13541)購自中國Elabscience公司；SP法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 標本來源收集2017年6月1日～2019年6月1日河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院生物標本庫ESCC合計60例，其中男性47例(78.3%)，女性13例(21.7%)；中位年齡62歲(37～78歲)。所有患者術前均未行放、化療。每對標本均取ESCC原發(fā)灶及距原發(fā)灶5 cm以上的癌旁正常組織。手術切除標本分為兩部分，一部分在新鮮狀態(tài)下放入RNA later中，置于4 ℃冰箱中孵育過夜，再轉到-80 ℃低溫冰箱中保存，以備提取RNA；另一部分標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)制作蠟塊后，4 μm厚切片，并進行HE染色及病理分析：癌組織標本由3位病理醫(yī)師確診為ESCC，癌旁正常組織中未見癌細胞浸潤。所有標本均具有完整的臨床病理資料，本組所有研究對象均簽署知情同意書，并經(jīng)河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理委員會批準通過。

1.3 ESCC細胞系及其培養(yǎng)ESCC細胞(TE1、TE13、Eca109、Kyse150、Kyse170、Yes-2)由河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室保存并傳代。6株細胞均用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1RT-qPCR 依據(jù)TRIzol試劑說明書步驟，提取ESCC細胞系、ESCC及其相應癌旁正常組織標本中的總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書步驟將總RNA反轉錄成cDNA，然后以cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參，進行RT-qPCR擴增。RT-qPCR引物如下，PTPN12上游引物5′-GTCCTGACCACAAT GGGGAG-3′，下游引物5′-CGGCTGTGATCAAATGG CAG-3′；β-actin上游引物5′-ACCGAGCGCGGCTA CAG-3′，下游引物5′-CTTAATGTCACESCCCGAT TTCC-3′。RT-qPCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，合計35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，每個樣本設3個復孔。根據(jù)每孔熒光信號達到閾值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)記為該組織中PTPN12和β-actin基因轉錄水平的Ct值。采用相對定量法：△Ct=CtPTPN12-Ctβ-actin，△△Ct=△Ct癌組織-△Ct配對癌旁組織，以N=2-△△Ct表示目的基因的相對表達量，其數(shù)值表示癌組織相對于癌旁正常組織的相對倍數(shù)。實驗重復3次，取平均值。

1.4.2免疫組化 應用免疫組化SP法檢測ESCC組織中PTPN12蛋白的表達。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，采用EDTA(pH 9.0)緩沖液進行抗原熱修復，高壓修復3 min，3%甲醇過氧化氫對內(nèi)源性過氧化物酶進行封閉，后加入一抗(1 ∶200)4 ℃過夜，第2天依次加入生物素化二抗和辣根過氧化物酶標記的三抗，DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固。采用半定量雙評分標準進行評分，每張切片隨機選取5個不重疊的高倍視野(400×)，以排除邊緣效應。PTPN12在食管鱗狀上皮的實質(zhì)細胞和間質(zhì)細胞的胞質(zhì)中均有表達，但主要表達于實質(zhì)細胞胞質(zhì)。根據(jù)染色深淺和著色細胞所占的百分比進行評分[3]。染色強度：對切片組織的著色強度進行分類，棕褐色、棕色、淡黃色、未著色分別記為3、2、1、0分；染色范圍>75%、51%～75%、26%～50%、6%～25%、<5%依次記為4、3、2、1、0分。染色結果為染色強度和染色范圍的乘積：強陽性(9～12分)，陽性(5～8分)，弱陽性(1～4分)，陰性(0分)；最終定義0～4分為低表達，5～12分高表達。所有切片均由3位有經(jīng)驗的臨床病理醫(yī)師采用雙盲法評估閱片，然后根據(jù)其評分的平均值來確定判定結果。

1.4.3過表達載體pcDNA3.1-PTPN12轉染Yes-2細胞 選擇生長狀態(tài)良好的Yes-2細胞用胰酶消化并計數(shù)，將Yes-2細胞均勻鋪于6孔板，細胞長至80%左右時轉染，分別在2個EP管中加入無血清培養(yǎng)基與過表達載體質(zhì)粒pcDNA3.1-PTPN12、無血清培養(yǎng)基與轉染試劑Lipofectamine 2000[轉染試劑Lipofectamine 2000(體積) ∶質(zhì)粒(質(zhì)量)=2 ∶1]，室溫孵育5 min；將2個EP管中的液體混合，室溫孵育20 min；其中1孔加200 μL轉染試劑質(zhì)粒混合液作為實驗組(pcDNA3.1-PTPN12)，1孔加等量空質(zhì)粒作為空質(zhì)粒對照組(pcDNA3.1-NC)，1孔為常規(guī)細胞培養(yǎng)組(Yes-2空白組)。培養(yǎng)24～48 h后，收集Yes-2細胞提取總RNA，用于觀察細胞轉染PTPN12后mRNA的表達情況[4]。

1.4.4MTS實驗檢測過表達PTPN12對Yes-2細胞增殖的影響 將上述Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組、pcDNA3.1-PTPN12組的Yes-2細胞培養(yǎng)24 h后，常規(guī)消化并懸浮于培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度分別接種于96孔板(1 000個/孔)，每組設置3個復孔。分別于細胞貼壁后0、24、48、72和96 h在每孔加入MTS試劑20 μL(1 500 μg/mL)，孵育2 h后用酶標儀測定492 mm處的光密度(OD)值，代表細胞增殖水平。

1.4.5克隆形成實驗檢測過表達PTPN12對Yes-2細胞增殖的影響 將上述3組細胞分別接種于6孔板(3 000個/孔)，常規(guī)培養(yǎng)1周。4%多聚甲醛固定后結晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)克隆形成數(shù)，大于50個細胞為1個克隆，分別計算3組細胞的克隆形成率。

1.4.6遷移實驗檢測過表達PTPN12對Yes-2細胞遷移能力的影響 將上述3組細胞接種于小室(1×105個/孔)，小室上層不加Matrigel膠，下層加600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定后結晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)5個隨機視野內(nèi)的細胞數(shù)，比較pcDNA3.1-PTPN12組和對照組的差異。

1.4.7Transwell侵襲實驗檢測過表達PTPN12對Yes-2細胞侵襲能力的影響 小室上層加20 μL Matrigel膠，其余同遷移實驗相同。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。首先對計量資料進行正態(tài)性檢驗，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)及四分位數(shù)表示，采用2個隨機樣本的非參數(shù)檢驗(秩和檢驗)進行組間分析；正態(tài)分布數(shù)據(jù)的多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩多重比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料的組間比較采用四格表χ2檢驗；以上結果均采用雙側檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ESCC組織及其癌旁正常組織中PTPN12 mRNA的表達首先對原始數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，結果P<0.1為非正態(tài)，則使用非參數(shù)檢驗(秩和檢驗)進行統(tǒng)計，統(tǒng)計量以中位數(shù)及四分位數(shù)(M25q 75q)表示。ESCC組織中PTPN12 mRNA的相對表達量(0.833)顯著低于癌旁正常組織(Z=-3.179，P=0.001，圖1)。ESCC組織中PTPN12 mRNA表達與有無淋巴結轉移(Z=-2.074，P=0.038)相關；與腫瘤TNM分期、年齡、性別以及分化程度均無關(P>0.05，表1)。

圖1 食管鱗狀細胞癌組織及其相應癌旁正常組織中PTPN12 mRNA的表達：*P<0.01

2.2 ESCC組織中PTPN12蛋白的表達PTPN12蛋白在ESCC組織及癌旁正常組織中的陽性率分別為31.7%(19/60)和70.0%(42/60)(圖2)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=17.638，P<0.01)。ESCC組織中PTPN12蛋白表達與腫瘤TNM分期(χ2=4.627，P=0.031)和有無淋巴結轉移(χ2=5.287，P=0.021)相關；與患者年齡、性別及分化程度均無關(P>0.05，表1)。

表1 ESCC組織中PTPN12表達與臨床病理特征的關系

圖2 A.PTPN12蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中低表達，SP法；B.PTPN12蛋白在癌旁正常組織中高表達，SP法

2.3 ESCC細胞系中PTPN12 mRNA的表達對照組、TE1、TE13、Eca109、Kyse150、Kyse170、Yes-2的PTPN12 mRNA相對表達量分別為0.977±0.023、0.769±0.111、0.625±0.030、0.443±0.008、0.443±0.016、0.091±0.002和0.047±0.002，均低于對照組(F=170.492，P<0.01，圖3)；綜上所述，PTPN12在6株ESCC細胞系中的表達均低于對照組。其中Yes-2細胞表達最低，故選用Yes-2細胞進行后續(xù)實驗。

圖3 食管癌細胞系中PTPN12 mRNA的表達：*P<0.01

2.4 PTPN12過表達載體轉染Yes-2細胞的轉染效率Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-PTPN12組PTPN12 mRNA的相對表達量分別為0.957±0.043、0.992±0.070和2.838±0.197，pcDNA3.1-PTPN12組的表達量顯著升高(F=228.830，P<0.01，圖4)，Yes-2空白組和pcDNA3.1-NC組差異無統(tǒng)計學意義(t=0.450，P=0.539)。

圖4 Yes-2細胞中過表達PTPN12基因的驗證：*P<0.01

2.5 PTPN12過表達對Yes-2細胞增殖能力的影響MTS實驗結果顯示，在Yes-2細胞中過表達PTPN12(pcDNA3.1-PTPN12組)，與對照組相比，72 h其增殖能力顯著減弱(F72 h=17.924，P<0.01，表2，圖5)，pcDNA3.1-NC組、Yes-2空白組細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(t=0.785，P=0.410)；96 h其增殖能力顯著減弱(F96 h=18.082，P<0.01)，pcDNA3.1-NC組、Yes-2空白組細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(t=3.624，P=0.106)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-PTPN12組的克隆形成數(shù)分別為604.667±11.015、610.667±13.650和469.333±17.616，差異有統(tǒng)計學意義(F=93.025，P<0.01，圖6)，Yes-2空白組和pcDNA3.1-NC組差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.093，P=0.776)。

表2 PTPN12過表達后不同時間點Yes-2細胞增殖能力

圖5 Yes-2細胞中過表達PTPN12基因MTS實驗：*P<0.01

圖6 Yes-2細胞中過表達PTPN12基因克隆形成實驗

2.6 PTPN12過表達對Yes-2細胞遷移能力的影響遷移實驗結果顯示，Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-PTPN12組的遷移細胞數(shù)分別為831.333±16.289、815.667±27.683和436.000±37.162差異有統(tǒng)計學意義(F=186.939，P<0.01，圖7)，Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.672，P=0.458)。

圖7 Yes-2細胞中過表達PTPN12基因遷移實驗

2.7 PTPN12過表達對Yes-2細胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實驗結果顯示，Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-PTPN12組通過人工基膜的細胞數(shù)量分別為345.667±23.159、331.333±15.373和205.333±13.796(F=55.724，P<0.01，圖8)，pcDNA3.1-NC組和Yes-2空白組差異無統(tǒng)計學意義(t=0.680，P=0.456)。

圖8 Yes-2細胞中過表達PTPN12基因侵襲實驗

3 討論

PTPN12于1992年首次被發(fā)現(xiàn)，為88 kDa胞質(zhì)PTP，定位于染色體7q11.23。PTPN12含有50～60個氨基酸的N-末端區(qū)域，可連接240個氨基酸的PTP催化結構域(催化殘基Cys231和Arg237)，從而介導磷酸酶活性。PTPN12還有1個約500個氨基酸的C末端尾部，包括PEST序列和4個富含脯氨酸的結構域(P1、P2、P3、P4)以及含有信號轉導基序的NPLH序列。已有研究表明PTPN12在多種腫瘤中低表達，包括乳腺癌、血管肉瘤、肝細胞癌、結直腸癌以及黑色素瘤等[5-10]。PTPN12可抑制多種致癌酪氨酸激酶的活性[11]，以及調(diào)節(jié)腫瘤細胞的侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程。Piao等[12]研究發(fā)現(xiàn)膀胱移行細胞癌組織中PTPN12表達顯著降低，PTPN12表達與腫瘤大小、TNM分級、分化程度和腫瘤復發(fā)呈負相關；敲低PTPN12可以促進膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Zhang等[13]研究顯示肝細胞癌中PTPN12表達顯著降低，PTPN12表達與EMT、遷移、侵襲和不良預后相關。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)在預測卡培他濱對乳腺癌治療新輔助化療療效中發(fā)現(xiàn)PTPN12表達與細胞周期相關。有研究發(fā)現(xiàn)PTPN12在結直腸癌中與EGFR通路失調(diào)、增殖、遷移以及不良預后有關[15-16]。Thummuri等[17]研究指出在三陰型乳腺癌中DNA啟動子甲基化可能是導致PTPN12表達下調(diào)的表觀遺傳學機制之一。

PTPN12在食管癌中的表達已得到初步研究，但研究尚淺，因此本實驗首先檢測PTPN12在ESCC及癌旁正常組織中的表達情況，結果表明，與癌旁正常組織相比，ESCC組織中PTPN12 mRNA的表達量顯著低于其癌旁正常組織并與淋巴結轉移相關，PTPN12蛋白的表達量顯著低于其癌旁正常組織并與淋巴結轉移、TNM分期相關。這與上述研究報道一致，PTPN12 mRNA與TNM分期無相關性，而PTPN12蛋白與TNM分期相關，其可能原因為樣本量較少，后續(xù)實驗應進一步增加樣本量。上述結果提示PTPN12在ESCC中可能發(fā)揮抑癌基因作用。為進一步研究PTPN12對ESCC體外增殖、遷移、侵襲等生物學特性的影響，本組檢測了6種ESCC細胞系中PTPN12 mRNA的表達情況，PTPN12在6種ESCC細胞系中的表達均低于對照組，其中Yes-2細胞中的表達最低，故選用Yes-2細胞進行后續(xù)實驗。

本實驗基于PTPN12轉錄本1的序列構建出克隆載體，成功構建pcDNA3.1-PTPN12過表達載體，轉染Yes-2細胞，本實驗通過RT-qPCR法檢測Yes-2細胞中PTPN12 mRNA的表達情況，結果顯示轉染PTPN12過表達載體質(zhì)粒后，細胞中PTPN12 mRNA表達明顯上調(diào)。通過MTS實驗、克隆形成實驗、劃痕實驗、遷移實驗和Transwell侵襲實驗，觀察PTPN12在體外對ESCC生物學行為的影響。應用MTS和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)轉染后的Yes-2細胞增殖能力降低，Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)轉染后的Yes-2細胞侵襲能力降低，應用遷移實驗發(fā)現(xiàn)轉染后的Yes-2細胞遷移能力降低，劃痕實驗發(fā)現(xiàn)轉染后的Yes-2細胞遷移能力有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義。分析其原因可能是Yes-2細胞本身分化程度所致，具體原因還有待進一步的實驗證實。

有研究表明，PTPN12主要表達于細胞質(zhì)，可作為調(diào)節(jié)細胞侵襲和轉移受體信號傳導的關鍵開關。PTPN12通過4個脯氨酸基序(P1-P4)使多種底物去磷酸化來發(fā)揮相應的生物學作用。Chen等[18]研究指出PTPN12通過黏著斑蛋白p130Cas去磷酸化來調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖和侵襲。Xu等[19]研究指出乳頭狀腎細胞癌中，活性氧(ROS)誘導PTPN12氧化失活，降低致癌激酶(ABL1)的去磷酸化并導致腫瘤細胞增殖和侵襲。有趣的是，Liang等[20]研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中PTPN12與miR-194表達呈負相關，miR-194可直接結合PTPN12的3′UTR區(qū)，miR-194通過靶向PTPN12從而促進卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲。同樣Cheng等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-503通過直接靶向PTPN12，抑制PTPN12的表達，從而促進視網(wǎng)膜母細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，以上研究可為PTPN12在ESCC中進一步研究下游機制提供思路。

綜上所述，本實驗結果表明，PTPN12在ESCC中低表達，并與ESCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關，過表達PTPN12可以抑制Yes-2細胞的體外增殖、侵襲和遷移能力，從而改變ESCC的生物學行為，為ESCC的分子靶向治療提供一些新思路，但具體機制有待進一步探究。