牛云峰，楊 陽(yáng)，王欣晨，沈素朋，郭 煒，董稚明

食管癌位居全球惡性腫瘤病死率的第6位。食管癌主要分兩類：食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)[1]。我國(guó)是ESCC的高發(fā)國(guó)，且地域分布上有明顯差異，河北省太行山地區(qū)是食管癌的高發(fā)區(qū)。ESCC的早期癥狀不明顯，起病較隱匿，多數(shù)患者出現(xiàn)癥狀時(shí)已是中晚期，且術(shù)后5年生存率較低，因此尋找早期診斷和預(yù)后評(píng)估的分子指標(biāo)及發(fā)病機(jī)制是提高患者生存率的重要手段。非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶12(protein tyrosine phosphatase non-receptor type12, PTPN12)基因定位于染色體7q11.23，其N末端含有PTPs家族的保守磷酸酶結(jié)構(gòu)，C端則為PEST序列(脯氨酸P、谷氨酸/門(mén)冬氨酸E、絲氨酸S及蘇氨酸T殘基)，所以也稱PTP-PEST[2]。PTPN12是一種重要的腫瘤抑制因子，在細(xì)胞中普遍表達(dá)，通過(guò)多個(gè)靶標(biāo)的去磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，是細(xì)胞遷移和黏附的重要調(diào)節(jié)劑，但有關(guān)PTPN12在ESCC中的表達(dá)及生物學(xué)特性的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)PTPN12在ESCC組織中的表達(dá)情況，分析其與臨床病理特征的關(guān)系；其次檢測(cè)PTPN12在ESCC細(xì)胞系中表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討PTPN12在ESCC中的生物學(xué)作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建pcDNA3.1-PTPN12過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)ESCC細(xì)胞體外增殖、遷移、侵襲能力的影響，從而為PTPN12抑制ESCC的發(fā)生、發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAN-Biotech公司；TRIzol購(gòu)自北京索萊寶公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、綠色體系均購(gòu)自美國(guó)Promega公司；所用引物均由北京賽百盛基因公司合成；兔抗人PTPN12多克隆抗體(E-AB13541)購(gòu)自中國(guó)Elabscience公司；SP法免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 標(biāo)本來(lái)源收集2017年6月1日～2019年6月1日河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生物標(biāo)本庫(kù)ESCC合計(jì)60例，其中男性47例(78.3%)，女性13例(21.7%)；中位年齡62歲(37～78歲)。所有患者術(shù)前均未行放、化療。每對(duì)標(biāo)本均取ESCC原發(fā)灶及距原發(fā)灶5 cm以上的癌旁正常組織。手術(shù)切除標(biāo)本分為兩部分，一部分在新鮮狀態(tài)下放入RNA later中，置于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，再轉(zhuǎn)到-80 ℃低溫冰箱中保存，以備提取RNA；另一部分標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)制作蠟塊后，4 μm厚切片，并進(jìn)行HE染色及病理分析：癌組織標(biāo)本由3位病理醫(yī)師確診為ESCC，癌旁正常組織中未見(jiàn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)。所有標(biāo)本均具有完整的臨床病理資料，本組所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.3 ESCC細(xì)胞系及其培養(yǎng)ESCC細(xì)胞(TE1、TE13、Eca109、Kyse150、Kyse170、Yes-2)由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室保存并傳代。6株細(xì)胞均用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1RT-qPCR 依據(jù)TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)步驟，提取ESCC細(xì)胞系、ESCC及其相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本中的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。RT-qPCR引物如下，PTPN12上游引物5′-GTCCTGACCACAAT GGGGAG-3′，下游引物5′-CGGCTGTGATCAAATGG CAG-3′；β-actin上游引物5′-ACCGAGCGCGGCTA CAG-3′，下游引物5′-CTTAATGTCACESCCCGAT TTCC-3′。RT-qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，合計(jì)35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)每孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)記為該組織中PTPN12和β-actin基因轉(zhuǎn)錄水平的Ct值。采用相對(duì)定量法：△Ct=CtPTPN12-Ctβ-actin，△△Ct=△Ct癌組織-△Ct配對(duì)癌旁組織，以N=2-△△Ct表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其數(shù)值表示癌組織相對(duì)于癌旁正常組織的相對(duì)倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2免疫組化 應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)ESCC組織中PTPN12蛋白的表達(dá)。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，采用EDTA(pH 9.0)緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù)，高壓修復(fù)3 min，3%甲醇過(guò)氧化氫對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行封閉，后加入一抗(1 ∶200)4 ℃過(guò)夜，第2天依次加入生物素化二抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的三抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，中性樹(shù)膠封固。采用半定量雙評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的高倍視野(400×)，以排除邊緣效應(yīng)。PTPN12在食管鱗狀上皮的實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中均有表達(dá)，但主要表達(dá)于實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)。根據(jù)染色深淺和著色細(xì)胞所占的百分比進(jìn)行評(píng)分[3]。染色強(qiáng)度：對(duì)切片組織的著色強(qiáng)度進(jìn)行分類，棕褐色、棕色、淡黃色、未著色分別記為3、2、1、0分；染色范圍>75%、51%～75%、26%～50%、6%～25%、<5%依次記為4、3、2、1、0分。染色結(jié)果為染色強(qiáng)度和染色范圍的乘積：強(qiáng)陽(yáng)性(9～12分)，陽(yáng)性(5～8分)，弱陽(yáng)性(1～4分)，陰性(0分)；最終定義0～4分為低表達(dá)，5～12分高表達(dá)。所有切片均由3位有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理醫(yī)師采用雙盲法評(píng)估閱片，然后根據(jù)其評(píng)分的平均值來(lái)確定判定結(jié)果。

1.4.3過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1-PTPN12轉(zhuǎn)染Yes-2細(xì)胞 選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Yes-2細(xì)胞用胰酶消化并計(jì)數(shù)，將Yes-2細(xì)胞均勻鋪于6孔板，細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)轉(zhuǎn)染，分別在2個(gè)EP管中加入無(wú)血清培養(yǎng)基與過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3.1-PTPN12、無(wú)血清培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000[轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(體積) ∶質(zhì)粒(質(zhì)量)=2 ∶1]，室溫孵育5 min；將2個(gè)EP管中的液體混合，室溫孵育20 min；其中1孔加200 μL轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)粒混合液作為實(shí)驗(yàn)組(pcDNA3.1-PTPN12)，1孔加等量空質(zhì)粒作為空質(zhì)粒對(duì)照組(pcDNA3.1-NC)，1孔為常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)組(Yes-2空白組)。培養(yǎng)24～48 h后，收集Yes-2細(xì)胞提取總RNA，用于觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染PTPN12后mRNA的表達(dá)情況[4]。

1.4.4MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PTPN12對(duì)Yes-2細(xì)胞增殖的影響 將上述Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組、pcDNA3.1-PTPN12組的Yes-2細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，常規(guī)消化并懸浮于培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度分別接種于96孔板(1 000個(gè)/孔)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別于細(xì)胞貼壁后0、24、48、72和96 h在每孔加入MTS試劑20 μL(1 500 μg/mL)，孵育2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定492 mm處的光密度(OD)值，代表細(xì)胞增殖水平。

1.4.5克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PTPN12對(duì)Yes-2細(xì)胞增殖的影響 將上述3組細(xì)胞分別接種于6孔板(3 000個(gè)/孔)，常規(guī)培養(yǎng)1周。4%多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)，大于50個(gè)細(xì)胞為1個(gè)克隆，分別計(jì)算3組細(xì)胞的克隆形成率。

1.4.6遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PTPN12對(duì)Yes-2細(xì)胞遷移能力的影響 將上述3組細(xì)胞接種于小室(1×105個(gè)/孔)，小室上層不加Matrigel膠，下層加600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，比較pcDNA3.1-PTPN12組和對(duì)照組的差異。

1.4.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PTPN12對(duì)Yes-2細(xì)胞侵襲能力的影響 小室上層加20 μL Matrigel膠，其余同遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。首先對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)及四分位數(shù)表示，采用2個(gè)隨機(jī)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(秩和檢驗(yàn))進(jìn)行組間分析；正態(tài)分布數(shù)據(jù)的多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料的組間比較采用四格表χ2檢驗(yàn)；以上結(jié)果均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織及其癌旁正常組織中PTPN12 mRNA的表達(dá)首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果P<0.1為非正態(tài)，則使用非參數(shù)檢驗(yàn)(秩和檢驗(yàn))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)量以中位數(shù)及四分位數(shù)(M25q 75q)表示。ESCC組織中PTPN12 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.833)顯著低于癌旁正常組織(Z=-3.179，P=0.001，圖1)。ESCC組織中PTPN12 mRNA表達(dá)與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(Z=-2.074，P=0.038)相關(guān)；與腫瘤TNM分期、年齡、性別以及分化程度均無(wú)關(guān)(P>0.05，表1)。

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織中PTPN12 mRNA的表達(dá)：*P<0.01

2.2 ESCC組織中PTPN12蛋白的表達(dá)PTPN12蛋白在ESCC組織及癌旁正常組織中的陽(yáng)性率分別為31.7%(19/60)和70.0%(42/60)(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.638，P<0.01)。ESCC組織中PTPN12蛋白表達(dá)與腫瘤TNM分期(χ2=4.627，P=0.031)和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=5.287，P=0.021)相關(guān)；與患者年齡、性別及分化程度均無(wú)關(guān)(P>0.05，表1)。

表1 ESCC組織中PTPN12表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 A.PTPN12蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，SP法；B.PTPN12蛋白在癌旁正常組織中高表達(dá)，SP法

2.3 ESCC細(xì)胞系中PTPN12 mRNA的表達(dá)對(duì)照組、TE1、TE13、Eca109、Kyse150、Kyse170、Yes-2的PTPN12 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.977±0.023、0.769±0.111、0.625±0.030、0.443±0.008、0.443±0.016、0.091±0.002和0.047±0.002，均低于對(duì)照組(F=170.492，P<0.01，圖3)；綜上所述，PTPN12在6株ESCC細(xì)胞系中的表達(dá)均低于對(duì)照組。其中Yes-2細(xì)胞表達(dá)最低，故選用Yes-2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 食管癌細(xì)胞系中PTPN12 mRNA的表達(dá)：*P<0.01

2.4 PTPN12過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Yes-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-PTPN12組PTPN12 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.957±0.043、0.992±0.070和2.838±0.197，pcDNA3.1-PTPN12組的表達(dá)量顯著升高(F=228.830，P<0.01，圖4)，Yes-2空白組和pcDNA3.1-NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.450，P=0.539)。

圖4 Yes-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PTPN12基因的驗(yàn)證：*P<0.01

2.5 PTPN12過(guò)表達(dá)對(duì)Yes-2細(xì)胞增殖能力的影響MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Yes-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PTPN12(pcDNA3.1-PTPN12組)，與對(duì)照組相比，72 h其增殖能力顯著減弱(F72 h=17.924，P<0.01，表2，圖5)，pcDNA3.1-NC組、Yes-2空白組細(xì)胞增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.785，P=0.410)；96 h其增殖能力顯著減弱(F96 h=18.082，P<0.01)，pcDNA3.1-NC組、Yes-2空白組細(xì)胞增殖能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.624，P=0.106)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-PTPN12組的克隆形成數(shù)分別為604.667±11.015、610.667±13.650和469.333±17.616，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=93.025，P<0.01，圖6)，Yes-2空白組和pcDNA3.1-NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.093，P=0.776)。

表2 PTPN12過(guò)表達(dá)后不同時(shí)間點(diǎn)Yes-2細(xì)胞增殖能力

圖5 Yes-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PTPN12基因MTS實(shí)驗(yàn)：*P<0.01

圖6 Yes-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PTPN12基因克隆形成實(shí)驗(yàn)

2.6 PTPN12過(guò)表達(dá)對(duì)Yes-2細(xì)胞遷移能力的影響遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-PTPN12組的遷移細(xì)胞數(shù)分別為831.333±16.289、815.667±27.683和436.000±37.162差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=186.939，P<0.01，圖7)，Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.672，P=0.458)。

圖7 Yes-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PTPN12基因遷移實(shí)驗(yàn)

2.7 PTPN12過(guò)表達(dá)對(duì)Yes-2細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Yes-2空白組、pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-PTPN12組通過(guò)人工基膜的細(xì)胞數(shù)量分別為345.667±23.159、331.333±15.373和205.333±13.796(F=55.724，P<0.01，圖8)，pcDNA3.1-NC組和Yes-2空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.680，P=0.456)。

圖8 Yes-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PTPN12基因侵襲實(shí)驗(yàn)

3 討論

PTPN12于1992年首次被發(fā)現(xiàn)，為88 kDa胞質(zhì)PTP，定位于染色體7q11.23。PTPN12含有50～60個(gè)氨基酸的N-末端區(qū)域，可連接240個(gè)氨基酸的PTP催化結(jié)構(gòu)域(催化殘基Cys231和Arg237)，從而介導(dǎo)磷酸酶活性。PTPN12還有1個(gè)約500個(gè)氨基酸的C末端尾部，包括PEST序列和4個(gè)富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域(P1、P2、P3、P4)以及含有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基序的NPLH序列。已有研究表明PTPN12在多種腫瘤中低表達(dá)，包括乳腺癌、血管肉瘤、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌以及黑色素瘤等[5-10]。PTPN12可抑制多種致癌酪氨酸激酶的活性[11]，以及調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過(guò)程。Piao等[12]研究發(fā)現(xiàn)膀胱移行細(xì)胞癌組織中PTPN12表達(dá)顯著降低，PTPN12表達(dá)與腫瘤大小、TNM分級(jí)、分化程度和腫瘤復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)；敲低PTPN12可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Zhang等[13]研究顯示肝細(xì)胞癌中PTPN12表達(dá)顯著降低，PTPN12表達(dá)與EMT、遷移、侵襲和不良預(yù)后相關(guān)。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)在預(yù)測(cè)卡培他濱對(duì)乳腺癌治療新輔助化療療效中發(fā)現(xiàn)PTPN12表達(dá)與細(xì)胞周期相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)PTPN12在結(jié)直腸癌中與EGFR通路失調(diào)、增殖、遷移以及不良預(yù)后有關(guān)[15-16]。Thummuri等[17]研究指出在三陰型乳腺癌中DNA啟動(dòng)子甲基化可能是導(dǎo)致PTPN12表達(dá)下調(diào)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制之一。

PTPN12在食管癌中的表達(dá)已得到初步研究，但研究尚淺，因此本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)PTPN12在ESCC及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，與癌旁正常組織相比，ESCC組織中PTPN12 mRNA的表達(dá)量顯著低于其癌旁正常組織并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，PTPN12蛋白的表達(dá)量顯著低于其癌旁正常組織并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)。這與上述研究報(bào)道一致，PTPN12 mRNA與TNM分期無(wú)相關(guān)性，而PTPN12蛋白與TNM分期相關(guān)，其可能原因?yàn)闃颖玖枯^少，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)進(jìn)一步增加樣本量。上述結(jié)果提示PTPN12在ESCC中可能發(fā)揮抑癌基因作用。為進(jìn)一步研究PTPN12對(duì)ESCC體外增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)特性的影響，本組檢測(cè)了6種ESCC細(xì)胞系中PTPN12 mRNA的表達(dá)情況，PTPN12在6種ESCC細(xì)胞系中的表達(dá)均低于對(duì)照組，其中Yes-2細(xì)胞中的表達(dá)最低，故選用Yes-2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)基于PTPN12轉(zhuǎn)錄本1的序列構(gòu)建出克隆載體，成功構(gòu)建pcDNA3.1-PTPN12過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Yes-2細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-qPCR法檢測(cè)Yes-2細(xì)胞中PTPN12 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染PTPN12過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒后，細(xì)胞中PTPN12 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察PTPN12在體外對(duì)ESCC生物學(xué)行為的影響。應(yīng)用MTS和克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的Yes-2細(xì)胞增殖能力降低，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的Yes-2細(xì)胞侵襲能力降低，應(yīng)用遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的Yes-2細(xì)胞遷移能力降低，劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的Yes-2細(xì)胞遷移能力有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析其原因可能是Yes-2細(xì)胞本身分化程度所致，具體原因還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

有研究表明，PTPN12主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，可作為調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移受體信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵開(kāi)關(guān)。PTPN12通過(guò)4個(gè)脯氨酸基序(P1-P4)使多種底物去磷酸化來(lái)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。Chen等[18]研究指出PTPN12通過(guò)黏著斑蛋白p130Cas去磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。Xu等[19]研究指出乳頭狀腎細(xì)胞癌中，活性氧(ROS)誘導(dǎo)PTPN12氧化失活，降低致癌激酶(ABL1)的去磷酸化并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。有趣的是，Liang等[20]研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中PTPN12與miR-194表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miR-194可直接結(jié)合PTPN12的3′UTR區(qū)，miR-194通過(guò)靶向PTPN12從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。同樣Cheng等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-503通過(guò)直接靶向PTPN12，抑制PTPN12的表達(dá)，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，以上研究可為PTPN12在ESCC中進(jìn)一步研究下游機(jī)制提供思路。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTPN12在ESCC中低表達(dá)，并與ESCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，過(guò)表達(dá)PTPN12可以抑制Yes-2細(xì)胞的體外增殖、侵襲和遷移能力，從而改變ESCC的生物學(xué)行為，為ESCC的分子靶向治療提供一些新思路，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。