林華妹，鄒長棪，胡 丹，蘇 穎，廖錦容，林可焴，相智聲，鄭雄偉，林賢東,4

胃癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，病死率居世界第2位[1]。EB病毒(epstein-barr virus, EBV)相關性胃癌(EBV-associated gastric cancer, EBVaGC)在全球胃癌病例中占近10%[2]。EBVaGC為胃癌的特殊亞型，與普通胃癌不同，男性好發(fā)，賁門為好發(fā)部位，具有獨特的生物學行為，但其機制尚不明確[3]。PIWI基因是Argonaute(Ago)基因家族的一個亞家族，PIWI亞家族成員包括PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3和PIWIL4，主要表達在睪丸或胚胎組織中[4-6]。近年來研究表明，PIWI亞家族異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。在乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌及結直腸癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)PIWIL基因異常表達，且與預后密切相關[7-10]。本組前期預實驗發(fā)現(xiàn)，PIWIL1和PIWIL4在胃癌及EBVaGC組織中高表達，而PIWIL2和PIWIL3未檢測到[11]。本實驗旨在通過qPCR技術檢測并探討PIWIL1和PIWIL4基因表達與EBVaGC發(fā)生、發(fā)展及預后等臨床指標的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床標本收集2012～2018年福建省腫瘤醫(yī)院存檔的111例胃癌手術切除標本，并取相應癌旁組織(距癌組織5 cm以上)作為對照組，患者術前均未接受過任何抗腫瘤治療，術后經(jīng)病理學證實為胃腺癌，其中58例為EBVaGC。其中男性88例，女性23例，中位年齡57歲(22.0～80.0歲)。腫瘤直徑中位數(shù)5.8 cm(四分位距1.5～14.5 cm)。按第8版AJCC分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期23例，Ⅲ期66例，Ⅳ期10例；根據(jù)Lauren組織學分型：腸型72例，彌漫型39例。58例EBVaGC中，男性48例，女性10例，中位年齡58歲(22.0～78.0歲)。新鮮組織獲取后立即放入液氮保存，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。隨訪時間從明確診斷開始，至末次隨訪或患者死亡，以月為單位。本實驗經(jīng)福建省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準，所有納入患者均在術前簽署知情同意書。

1.2 細胞株正常胃黏膜上皮細胞株GES-1、EBV陰性胃癌細胞株MKN-28購于中科院上海細胞庫，EBVaGC細胞株AGS-BX1由香港大學陳洪霖教授饋贈[11]。

1.3 試劑和儀器Trizol購自德國QIAGEN公司。Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒購自Thermo公司，SYBR Green 1 Master購自羅氏公司。EBER1檢測試劑盒(NO.S30172)購自福建泰普生物公司。超微量紫外分光光度計為NanDrop1000；PCR擴增儀為Thermo公司產(chǎn)品。熒光定量PCR儀器為羅氏公司產(chǎn)品。原位雜交儀為福建泰普生物公司產(chǎn)品。

1.4 EBV原位雜交檢測EBVaGC組織主要通過EBV原位雜交檢測來鑒定。EBV原位雜交檢測采用EBER1檢測試劑盒(EBV編碼的小核糖核酸1，丹麥Dako公司)。按照EBER1檢測試劑盒操作說明書進行操作：將蠟塊切片、烤片、脫蠟、脫水及蛋白酶K消化約5 min，滴加EBV核酸探針(Epstein-Barr encoded RNA)雜交液，55 ℃孵育90 min，后調(diào)至37 ℃孵育過夜。加一抗孵育30 min，加二抗孵育20 min。洗滌擦干，滴加辣根過氧化物酶反應30 min；滴加DAB復合物顯色后蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封固。

1.5 qRT-PCR取100 mg凍存新鮮組織液氮環(huán)境下研磨成粉末狀，加入1 mL Trizol(德國QIAGEN公司)，靜置10 min后抽提RNA。收集常規(guī)培養(yǎng)的GES-1、MKN-28和AGS-BX1對數(shù)生長期細胞，同上述方法抽提RNA。使用分光光度計測定RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN公司)操作說明書將提取的RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR按照SyberGreen(羅氏公司lightCycler480)說明書配制反應體系，反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)；進行熔解曲線檢測。每個樣本設3個復孔，實驗重復3次。以GAPDH為內(nèi)參基因?qū)Ω骰虮磉_進行標準化，同時PIWIL1和PIWIL4分別以T-150246癌組織表達為基準標本(calibrator)對其他標本進行量化，即它的表達量設為1，量化其他樣本的表達量；采用2-ΔΔCt法計算相對表達量的RQ值，為便于統(tǒng)計，把RQ值取log10進行分析[12-13]。PIWIL1-F-primer：5′-AAGCCAGAAGACTCCGTTCA-3′，PIWIL1-R-primer：5′-TCACATCCTCTCCATTCCGG-3′；PIWIL4-F-primer：5′-CATGAACTACTGGCATCAC-3′，PIWIL4-R-primer：5′-GGGAATTAGACTCTGTTTATC-3′；GAPDH-F-primer：5′-CCAGAACATCATCCCTGCCT-3′，GAPDH-R-primer：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，配對資料的比較采用配對t檢驗；兩組間的比較先進行正態(tài)性檢驗及方差齊性分析，后進行兩獨立樣本t檢驗；PIWIL基因表達和各臨床病理指標與EBVaGC胃癌預后間的相關性分析先采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗行單因素分析，有統(tǒng)計學意義的變量納入Cox比例風險模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EBVaGC鑒定EBV原位雜交檢測結果顯示，111例胃腺癌中，58例EBER陽性，細胞核呈棕褐色，確認為EBVaGC(圖1)。EBVaGC多表現(xiàn)為潰瘍型或凹陷型腫物，具有淋巴上皮瘤樣組織學、中低分化腺癌伴大量淋巴細胞浸潤等形態(tài)學特點。

圖1 胃癌EBER原位雜交：A.EBV相關性胃癌EBER呈陽性；B.非EBV相關性胃癌EBER呈陰性

2.2 胃癌中PIWIL1和PIWIL4的表達利用qRT-PCR檢測111例胃癌及對應癌旁組織中PIWIL1和PIWIL4的表達，胃癌組織中PIWIL1和PIWIL4的表達量分別為0.515±0.231和0.766±0.510(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，相應癌旁組織的表達量為0.522±0.153和0.717±0.325，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

為進一步分析PIWIL1和PIWIL4表達與EBV感染的相關性，依據(jù)EBV感染情況分為EBVaGC組(58例)及非EBV相關性胃癌(non-EBV-associated gastric cancer, EBVnGC)組(53例)。58例EBVaGC組織中PIWIL1和PIWIL4的平均表達量為0.556±0.096和0.778±0.440(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，而53例EBVnGC組織中分別為0.245±0.146及0.481±0.342，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

圖2 PIWIL1和PIWIL4在EBV相關性胃癌及非EBV相關性胃癌中的表達水平：A.PIWIL1；B.PIWIL4；紅線表示每組的平均值

2.3 qRT-PCR法檢測PIWIL1和PIWIL4在EBVaGC及EBVaGC細胞株中的表達58例EBVaGC組織中PIWIL1的平均表達量為0.556±0.096(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，相應癌旁組織的平均表達量為0.240±0.121，上調(diào)2.31倍，兩者間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.033，圖3A)。EBVaGC組織中PIWIL4的平均表達量為0.778±0.440(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，相應癌旁組織的平均表達量為0.501±0.431，上調(diào)1.55倍，兩者間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.029，圖3B)。上述結果表明PIWIL1與PIWIL4在EBVaGC組織中的表達水平高于癌旁組織。53例EBVnGC組織中PIWIL1和PIWIL4的平均表達量為0.245±0.146和0.481±0.342(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，而相應的癌旁組織分別為0.220±0.127及0.453±0.06，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖3 PIWIL1和PIWIL4在EBV相關性胃癌及癌旁組織中的表達水平：A.PIWIL1；B.PIWIL4；紅線表示每組的平均值

同時通過qRT-PCR法分析正常人胃黏膜細胞株GES-1、EBV陰性胃癌細胞株MKN-28及EBVaGC細胞株AGS-BX1中PIWIL1與PIWIL4的表達，結果顯示AGS-BX1中PIWIL1與PIWIL4 mRNA相對表達量明顯高于GES-1和MKN-28，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖4)

圖4 PIWIL1和PIWIL4在GES-1、MKN-28及AGS-BX1中的表達水平：***P<0.001

2.4 EBVaGC中PIWIL1和PIWIL4表達與臨床病理特征的關系將58例EBVaGC按照TNM分期分組，Ⅰ+Ⅱ期胃癌組13例，PIWIL1的表達量為-0.308±0.329；Ⅲ+Ⅳ期胃癌組45例，表達量為0.383±0.119，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016)。PIWIL4在Ⅰ+Ⅱ期胃癌組中的表達量為0.437±0.100，Ⅲ+Ⅳ期胃癌組的表達量為0.736±0.061，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.024)。按照淋巴結轉(zhuǎn)移分組，無淋巴結轉(zhuǎn)移胃癌組12例，PIWIL1的表達量為-0.338±0.372；有淋巴結轉(zhuǎn)移胃癌組46例，表達量為0.377±0.118，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.017)。PIWIL4在無淋巴結轉(zhuǎn)移組的表達量為0.413±0.115，有淋巴結轉(zhuǎn)移組的表達量為0.736±0.060，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.020)。PIWIL1和PIWIL4表達與EBVaGC患者性別、年齡，組織分化、腫瘤部位、大小、Lauren分型、神經(jīng)侵犯及脈管癌栓均無相關性(P>0.05，表1)。

表1 EBV相關性胃癌中PIWIL1和PIWIL4表達與臨床病理特征的關系

2.5 PIWIL4表達與EBVaGC患者預后的關系經(jīng)正態(tài)性檢驗，58例EBVaGC中PIWIL4的相對表達量lgRQ符合正態(tài)分布，中位數(shù)兩側(cè)數(shù)據(jù)分布均勻，以中位數(shù)為截點的兩組數(shù)據(jù)更具有代表性，故取中位數(shù)0.653為截點，將其分為高表達量組和低表達量組。PIWIL4高表達組29例，死亡20例(69.0%)，平均生存時間(34.9±6.1)個月；PIWIL4低表達組29例，死亡10例(34.5%)，平均生存時間(56.0±5.9)個月。采用Kaplan-Meier分析法繪制生存曲線圖，結果顯示PIWIL4高表達組患者的總生存期(overall survival, OS)比低表達組短(P=0.007，圖5)。而PIWIL1表達與EBVaGC預后未見相關性。

圖5 PIWIL4表達與EBV相關性胃癌患者總生存期的關系

2.6 Cox比例風險模型58例EBVaGC中，單因素分析結果顯示PIWIL4表達、脈管癌栓及TNM分期有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)；將有統(tǒng)計學意義的變量同時納入Cox比例風險模型進行多因素預后Logistic回歸分析，結果顯示PIWIL4表達為EBVaGC預后的獨立影響因素(P=0.026，表2)。

表2 單因素和多因素的Cox回歸預后分析結果

3 討論

EBV是第一個被發(fā)現(xiàn)的人類致癌病毒，其感染與多種腫瘤相關，包括淋巴瘤的數(shù)個亞型以及鼻咽癌等[14-15]。研究表明，EBV也是重要的胃癌致病因子。EBV在胃癌細胞中表現(xiàn)為潛伏型Ⅰ感染，感染的胃癌細胞均可檢測到EBER的轉(zhuǎn)錄表達，感染細胞呈單克隆增生，提示EBV感染發(fā)生在胃癌發(fā)展的起始階段[16]。近年來EBVaGC作為一種獨特的分子亞型疾病逐漸被人們所認知，全球胃癌患者中約10%為EBVaGC。目前有很多學者對EBV的致癌機制進行了大量研究，證明基因甲基化、突變、擴增、失活等可能是其致癌的重要機制[17]。但對其研究尚不明確，且尚無臨床診療規(guī)范與共識，給我們帶來新的挑戰(zhàn)和機遇。

Argonaute蛋白家族是小分子RNA復合物的主要成分，它分為Ago亞家族和PIWI亞家族。人類PIWI亞家族主要有4個成員：PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4[18]。PIWI亞家族主要通過與piRNAs特異性結合以調(diào)控基因表達，參與各種生物學過程，具體調(diào)控機制包括基因沉默、轉(zhuǎn)座子沉默、翻譯抑制、表觀遺傳學改變等[19]。近年來多項研究表明PIWI亞家族與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后相關。Litwin等[20]通過免疫組化及qPCR研究PIWIL1、PIWIL2在乳腺浸潤性導管癌(invasive ductal carcinoma, IDC)及乳腺良性病變組織中的表達，結果顯示，PIWIL1和PIWIL2在IDC中表達水平高于乳腺良性病變組織，差異有統(tǒng)計學意義；且PIWIL1 mRNA僅在癌組織和乳腺良性病變組織中檢出，而在大多數(shù)正常乳腺組織中均未發(fā)現(xiàn)。Wang等[21]在結腸腺癌中的研究表明，PIWIL1在癌旁組織(距癌組織5 cm以上)、結腸腺瘤和結腸癌附近組織中的陽性率分別為11.1%(5/45)、53.7%(22/41)和80.4%(74/92)，表達率遞增，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。劉婷等[22]通過免疫組化分析胃癌及癌旁組織中PIWIL1蛋白表達，結果顯示：PIWIL1在胃癌組織中的陽性率(80.00%)高于癌旁組織(21.33%)(P<0.05)。本實驗結果顯示，胃癌組織中PIWIL1和PIWIL4 mRNA的表達水平在癌與癌旁組織中差別無統(tǒng)計學意義；而PIWIL1與PIWIL4在EBVaGC中的表達高于EBVnGC(P<0.05)；進一步分析顯示，EBVaGC中PIWIL1和PIWIL4的表達量相比相應癌旁組織分別上調(diào)2.31倍和1.55倍(P=0.033，P=0.029)。在胃癌研究中，本組結果與劉婷等的研究結果不一致，可能的原因是組織異質(zhì)性、基因表達與蛋白水平的差異及檢測方法的敏感性不同等。本組通過分層分析進一步發(fā)現(xiàn)，在胃癌EBVaGC亞型中，PIWIL1和PIWIL4在癌組織中呈高表達。綜上所述，PIWIL基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，包括EBVaGC。

為進一步明確PIWIL表達與EBVaGC發(fā)生、發(fā)展和預后的關系，本組分析了PIWIL1和PIWIL4表達與臨床病理特征及預后的相關性。結果顯示，PIWIL1與PIWIL4表達與EBVaGC組織TNM分期和淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關(P<0.05)。采用Kaplan-Meier分析，PIWIL4高表達組患者的OS比低表達組短(P=0.007)。多因素及Cox比例風險模型分析也表明，PIWIL4表達可作為EBVaGC OS的獨立預后因素，據(jù)此推測PIWI蛋白過表達可能促進EBVaGC的侵襲和臨床進展。與既往惡性腫瘤相關的研究結果一致，例如在胰腺癌中研究表明，PIWIL2表達與無進展生存期和OS密切相關，同時還發(fā)現(xiàn)PIWIL1和PIWIL2表達與胰腺癌祖細胞分子亞型相關的因子呈正相關，提示PIWIL1和PIWIL2可能是胰腺癌潛在的預后分子指標[23]。在腎透明細胞癌研究顯示，癌組織中PIWIL1、PIWIL2和PIWIL4表達高于癌旁組織，且PIWIL1和PIWIL4異常表達與臨床分期及生存率顯著相關[24-25]。以上結果提示，PIWIL表達與多種腫瘤的臨床進展及預后密切相關，可能是潛在的預后分子指標。

綜上所述，EBVaGC是具有獨特分子表型的胃癌，其發(fā)病機制尚不清楚。本實驗結果顯示EBVaGC癌組織PIWIL1和PIWIL4過表達與TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移顯著相關，且PIWIL4與OS相關，是預后的獨立影響因素。本實驗結果在一定程度上表明PIWIL4參與了EBVaGC的發(fā)生、發(fā)展過程，PIWIL4有望作為EBVaGC預后的重要分子標志物，并可能成為EBVaGC治療新的靶點。