林華妹,鄒長棪,胡 丹,蘇 穎,廖錦容,林可焴,相智聲,鄭雄偉,林賢東,4
胃癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一,病死率居世界第2位[1]。EB病毒(epstein-barr virus, EBV)相關性胃癌(EBV-associated gastric cancer, EBVaGC)在全球胃癌病例中占近10%[2]。EBVaGC為胃癌的特殊亞型,與普通胃癌不同,男性好發(fā),賁門為好發(fā)部位,具有獨特的生物學行為,但其機制尚不明確[3]。PIWI基因是Argonaute(Ago)基因家族的一個亞家族,PIWI亞家族成員包括PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3和PIWIL4,主要表達在睪丸或胚胎組織中[4-6]。近年來研究表明,PIWI亞家族異常表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。在乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌及結直腸癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)PIWIL基因異常表達,且與預后密切相關[7-10]。本組前期預實驗發(fā)現(xiàn),PIWIL1和PIWIL4在胃癌及EBVaGC組織中高表達,而PIWIL2和PIWIL3未檢測到[11]。本實驗旨在通過qPCR技術檢測并探討PIWIL1和PIWIL4基因表達與EBVaGC發(fā)生、發(fā)展及預后等臨床指標的相關性。
1.1 臨床標本收集2012~2018年福建省腫瘤醫(yī)院存檔的111例胃癌手術切除標本,并取相應癌旁組織(距癌組織5 cm以上)作為對照組,患者術前均未接受過任何抗腫瘤治療,術后經(jīng)病理學證實為胃腺癌,其中58例為EBVaGC。其中男性88例,女性23例,中位年齡57歲(22.0~80.0歲)。腫瘤直徑中位數(shù)5.8 cm(四分位距1.5~14.5 cm)。按第8版AJCC分期:Ⅰ期12例,Ⅱ期23例,Ⅲ期66例,Ⅳ期10例;根據(jù)Lauren組織學分型:腸型72例,彌漫型39例。58例EBVaGC中,男性48例,女性10例,中位年齡58歲(22.0~78.0歲)。新鮮組織獲取后立即放入液氮保存,隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。隨訪時間從明確診斷開始,至末次隨訪或患者死亡,以月為單位。本實驗經(jīng)福建省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準,所有納入患者均在術前簽署知情同意書。
1.2 細胞株正常胃黏膜上皮細胞株GES-1、EBV陰性胃癌細胞株MKN-28購于中科院上海細胞庫,EBVaGC細胞株AGS-BX1由香港大學陳洪霖教授饋贈[11]。
1.3 試劑和儀器Trizol購自德國QIAGEN公司。Revert Aid First Strand cDNA Synthesis試劑盒購自Thermo公司,SYBR Green 1 Master購自羅氏公司。EBER1檢測試劑盒(NO.S30172)購自福建泰普生物公司。超微量紫外分光光度計為NanDrop1000;PCR擴增儀為Thermo公司產(chǎn)品。熒光定量PCR儀器為羅氏公司產(chǎn)品。原位雜交儀為福建泰普生物公司產(chǎn)品。
1.4 EBV原位雜交檢測EBVaGC組織主要通過EBV原位雜交檢測來鑒定。EBV原位雜交檢測采用EBER1檢測試劑盒(EBV編碼的小核糖核酸1,丹麥Dako公司)。按照EBER1檢測試劑盒操作說明書進行操作:將蠟塊切片、烤片、脫蠟、脫水及蛋白酶K消化約5 min,滴加EBV核酸探針(Epstein-Barr encoded RNA)雜交液,55 ℃孵育90 min,后調(diào)至37 ℃孵育過夜。加一抗孵育30 min,加二抗孵育20 min。洗滌擦干,滴加辣根過氧化物酶反應30 min;滴加DAB復合物顯色后蘇木精復染,梯度乙醇脫水,中性樹膠封固。
1.5 qRT-PCR取100 mg凍存新鮮組織液氮環(huán)境下研磨成粉末狀,加入1 mL Trizol(德國QIAGEN公司),靜置10 min后抽提RNA。收集常規(guī)培養(yǎng)的GES-1、MKN-28和AGS-BX1對數(shù)生長期細胞,同上述方法抽提RNA。使用分光光度計測定RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN公司)操作說明書將提取的RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA,-80 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR按照SyberGreen(羅氏公司lightCycler480)說明書配制反應體系,反應條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,40個循環(huán);進行熔解曲線檢測。每個樣本設3個復孔,實驗重復3次。以GAPDH為內(nèi)參基因?qū)Ω骰虮磉_進行標準化,同時PIWIL1和PIWIL4分別以T-150246癌組織表達為基準標本(calibrator)對其他標本進行量化,即它的表達量設為1,量化其他樣本的表達量;采用2-ΔΔCt法計算相對表達量的RQ值,為便于統(tǒng)計,把RQ值取log10進行分析[12-13]。PIWIL1-F-primer:5′-AAGCCAGAAGACTCCGTTCA-3′,PIWIL1-R-primer:5′-TCACATCCTCTCCATTCCGG-3′;PIWIL4-F-primer:5′-CATGAACTACTGGCATCAC-3′,PIWIL4-R-primer:5′-GGGAATTAGACTCTGTTTATC-3′;GAPDH-F-primer:5′-CCAGAACATCATCCCTGCCT-3′,GAPDH-R-primer:5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。
1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析,配對資料的比較采用配對t檢驗;兩組間的比較先進行正態(tài)性檢驗及方差齊性分析,后進行兩獨立樣本t檢驗;PIWIL基因表達和各臨床病理指標與EBVaGC胃癌預后間的相關性分析先采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗行單因素分析,有統(tǒng)計學意義的變量納入Cox比例風險模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 EBVaGC鑒定EBV原位雜交檢測結果顯示,111例胃腺癌中,58例EBER陽性,細胞核呈棕褐色,確認為EBVaGC(圖1)。EBVaGC多表現(xiàn)為潰瘍型或凹陷型腫物,具有淋巴上皮瘤樣組織學、中低分化腺癌伴大量淋巴細胞浸潤等形態(tài)學特點。
圖1 胃癌EBER原位雜交:A.EBV相關性胃癌EBER呈陽性;B.非EBV相關性胃癌EBER呈陰性
2.2 胃癌中PIWIL1和PIWIL4的表達利用qRT-PCR檢測111例胃癌及對應癌旁組織中PIWIL1和PIWIL4的表達,胃癌組織中PIWIL1和PIWIL4的表達量分別為0.515±0.231和0.766±0.510(lgRQ,RQ=2-ΔΔCt),相應癌旁組織的表達量為0.522±0.153和0.717±0.325,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
為進一步分析PIWIL1和PIWIL4表達與EBV感染的相關性,依據(jù)EBV感染情況分為EBVaGC組(58例)及非EBV相關性胃癌(non-EBV-associated gastric cancer, EBVnGC)組(53例)。58例EBVaGC組織中PIWIL1和PIWIL4的平均表達量為0.556±0.096和0.778±0.440(lgRQ,RQ=2-ΔΔCt),而53例EBVnGC組織中分別為0.245±0.146及0.481±0.342,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2)。
圖2 PIWIL1和PIWIL4在EBV相關性胃癌及非EBV相關性胃癌中的表達水平:A.PIWIL1;B.PIWIL4;紅線表示每組的平均值
2.3 qRT-PCR法檢測PIWIL1和PIWIL4在EBVaGC及EBVaGC細胞株中的表達58例EBVaGC組織中PIWIL1的平均表達量為0.556±0.096(lgRQ,RQ=2-ΔΔCt),相應癌旁組織的平均表達量為0.240±0.121,上調(diào)2.31倍,兩者間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.033,圖3A)。EBVaGC組織中PIWIL4的平均表達量為0.778±0.440(lgRQ,RQ=2-ΔΔCt),相應癌旁組織的平均表達量為0.501±0.431,上調(diào)1.55倍,兩者間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.029,圖3B)。上述結果表明PIWIL1與PIWIL4在EBVaGC組織中的表達水平高于癌旁組織。53例EBVnGC組織中PIWIL1和PIWIL4的平均表達量為0.245±0.146和0.481±0.342(lgRQ,RQ=2-ΔΔCt),而相應的癌旁組織分別為0.220±0.127及0.453±0.06,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
圖3 PIWIL1和PIWIL4在EBV相關性胃癌及癌旁組織中的表達水平:A.PIWIL1;B.PIWIL4;紅線表示每組的平均值
同時通過qRT-PCR法分析正常人胃黏膜細胞株GES-1、EBV陰性胃癌細胞株MKN-28及EBVaGC細胞株AGS-BX1中PIWIL1與PIWIL4的表達,結果顯示AGS-BX1中PIWIL1與PIWIL4 mRNA相對表達量明顯高于GES-1和MKN-28,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖4)
圖4 PIWIL1和PIWIL4在GES-1、MKN-28及AGS-BX1中的表達水平:***P<0.001
2.4 EBVaGC中PIWIL1和PIWIL4表達與臨床病理特征的關系將58例EBVaGC按照TNM分期分組,Ⅰ+Ⅱ期胃癌組13例,PIWIL1的表達量為-0.308±0.329;Ⅲ+Ⅳ期胃癌組45例,表達量為0.383±0.119,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016)。PIWIL4在Ⅰ+Ⅱ期胃癌組中的表達量為0.437±0.100,Ⅲ+Ⅳ期胃癌組的表達量為0.736±0.061,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.024)。按照淋巴結轉(zhuǎn)移分組,無淋巴結轉(zhuǎn)移胃癌組12例,PIWIL1的表達量為-0.338±0.372;有淋巴結轉(zhuǎn)移胃癌組46例,表達量為0.377±0.118,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.017)。PIWIL4在無淋巴結轉(zhuǎn)移組的表達量為0.413±0.115,有淋巴結轉(zhuǎn)移組的表達量為0.736±0.060,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.020)。PIWIL1和PIWIL4表達與EBVaGC患者性別、年齡,組織分化、腫瘤部位、大小、Lauren分型、神經(jīng)侵犯及脈管癌栓均無相關性(P>0.05,表1)。
表1 EBV相關性胃癌中PIWIL1和PIWIL4表達與臨床病理特征的關系
2.5 PIWIL4表達與EBVaGC患者預后的關系經(jīng)正態(tài)性檢驗,58例EBVaGC中PIWIL4的相對表達量lgRQ符合正態(tài)分布,中位數(shù)兩側(cè)數(shù)據(jù)分布均勻,以中位數(shù)為截點的兩組數(shù)據(jù)更具有代表性,故取中位數(shù)0.653為截點,將其分為高表達量組和低表達量組。PIWIL4高表達組29例,死亡20例(69.0%),平均生存時間(34.9±6.1)個月;PIWIL4低表達組29例,死亡10例(34.5%),平均生存時間(56.0±5.9)個月。采用Kaplan-Meier分析法繪制生存曲線圖,結果顯示PIWIL4高表達組患者的總生存期(overall survival, OS)比低表達組短(P=0.007,圖5)。而PIWIL1表達與EBVaGC預后未見相關性。
圖5 PIWIL4表達與EBV相關性胃癌患者總生存期的關系
2.6 Cox比例風險模型58例EBVaGC中,單因素分析結果顯示PIWIL4表達、脈管癌栓及TNM分期有統(tǒng)計學意義(P<0.05,表2);將有統(tǒng)計學意義的變量同時納入Cox比例風險模型進行多因素預后Logistic回歸分析,結果顯示PIWIL4表達為EBVaGC預后的獨立影響因素(P=0.026,表2)。
表2 單因素和多因素的Cox回歸預后分析結果
EBV是第一個被發(fā)現(xiàn)的人類致癌病毒,其感染與多種腫瘤相關,包括淋巴瘤的數(shù)個亞型以及鼻咽癌等[14-15]。研究表明,EBV也是重要的胃癌致病因子。EBV在胃癌細胞中表現(xiàn)為潛伏型Ⅰ感染,感染的胃癌細胞均可檢測到EBER的轉(zhuǎn)錄表達,感染細胞呈單克隆增生,提示EBV感染發(fā)生在胃癌發(fā)展的起始階段[16]。近年來EBVaGC作為一種獨特的分子亞型疾病逐漸被人們所認知,全球胃癌患者中約10%為EBVaGC。目前有很多學者對EBV的致癌機制進行了大量研究,證明基因甲基化、突變、擴增、失活等可能是其致癌的重要機制[17]。但對其研究尚不明確,且尚無臨床診療規(guī)范與共識,給我們帶來新的挑戰(zhàn)和機遇。
Argonaute蛋白家族是小分子RNA復合物的主要成分,它分為Ago亞家族和PIWI亞家族。人類PIWI亞家族主要有4個成員:PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4[18]。PIWI亞家族主要通過與piRNAs特異性結合以調(diào)控基因表達,參與各種生物學過程,具體調(diào)控機制包括基因沉默、轉(zhuǎn)座子沉默、翻譯抑制、表觀遺傳學改變等[19]。近年來多項研究表明PIWI亞家族與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后相關。Litwin等[20]通過免疫組化及qPCR研究PIWIL1、PIWIL2在乳腺浸潤性導管癌(invasive ductal carcinoma, IDC)及乳腺良性病變組織中的表達,結果顯示,PIWIL1和PIWIL2在IDC中表達水平高于乳腺良性病變組織,差異有統(tǒng)計學意義;且PIWIL1 mRNA僅在癌組織和乳腺良性病變組織中檢出,而在大多數(shù)正常乳腺組織中均未發(fā)現(xiàn)。Wang等[21]在結腸腺癌中的研究表明,PIWIL1在癌旁組織(距癌組織5 cm以上)、結腸腺瘤和結腸癌附近組織中的陽性率分別為11.1%(5/45)、53.7%(22/41)和80.4%(74/92),表達率遞增,組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。劉婷等[22]通過免疫組化分析胃癌及癌旁組織中PIWIL1蛋白表達,結果顯示:PIWIL1在胃癌組織中的陽性率(80.00%)高于癌旁組織(21.33%)(P<0.05)。本實驗結果顯示,胃癌組織中PIWIL1和PIWIL4 mRNA的表達水平在癌與癌旁組織中差別無統(tǒng)計學意義;而PIWIL1與PIWIL4在EBVaGC中的表達高于EBVnGC(P<0.05);進一步分析顯示,EBVaGC中PIWIL1和PIWIL4的表達量相比相應癌旁組織分別上調(diào)2.31倍和1.55倍(P=0.033,P=0.029)。在胃癌研究中,本組結果與劉婷等的研究結果不一致,可能的原因是組織異質(zhì)性、基因表達與蛋白水平的差異及檢測方法的敏感性不同等。本組通過分層分析進一步發(fā)現(xiàn),在胃癌EBVaGC亞型中,PIWIL1和PIWIL4在癌組織中呈高表達。綜上所述,PIWIL基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程,包括EBVaGC。
為進一步明確PIWIL表達與EBVaGC發(fā)生、發(fā)展和預后的關系,本組分析了PIWIL1和PIWIL4表達與臨床病理特征及預后的相關性。結果顯示,PIWIL1與PIWIL4表達與EBVaGC組織TNM分期和淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關(P<0.05)。采用Kaplan-Meier分析,PIWIL4高表達組患者的OS比低表達組短(P=0.007)。多因素及Cox比例風險模型分析也表明,PIWIL4表達可作為EBVaGC OS的獨立預后因素,據(jù)此推測PIWI蛋白過表達可能促進EBVaGC的侵襲和臨床進展。與既往惡性腫瘤相關的研究結果一致,例如在胰腺癌中研究表明,PIWIL2表達與無進展生存期和OS密切相關,同時還發(fā)現(xiàn)PIWIL1和PIWIL2表達與胰腺癌祖細胞分子亞型相關的因子呈正相關,提示PIWIL1和PIWIL2可能是胰腺癌潛在的預后分子指標[23]。在腎透明細胞癌研究顯示,癌組織中PIWIL1、PIWIL2和PIWIL4表達高于癌旁組織,且PIWIL1和PIWIL4異常表達與臨床分期及生存率顯著相關[24-25]。以上結果提示,PIWIL表達與多種腫瘤的臨床進展及預后密切相關,可能是潛在的預后分子指標。
綜上所述,EBVaGC是具有獨特分子表型的胃癌,其發(fā)病機制尚不清楚。本實驗結果顯示EBVaGC癌組織PIWIL1和PIWIL4過表達與TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移顯著相關,且PIWIL4與OS相關,是預后的獨立影響因素。本實驗結果在一定程度上表明PIWIL4參與了EBVaGC的發(fā)生、發(fā)展過程,PIWIL4有望作為EBVaGC預后的重要分子標志物,并可能成為EBVaGC治療新的靶點。