曾本和，楊成年，邱玉林，王金林，王萬良，王 建，朱成科

( 1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850002； 2.西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460 )

拉薩裸裂尻魚(Schizopygopsisyounghusbandi)主要分布于雅魯藏布江大拐彎以上的干支流及羊八井溫泉出水小河中，為一種底棲刮食性魚類，是西藏地區(qū)主要的經(jīng)濟(jì)魚類之一[1]。其肉質(zhì)細(xì)嫩，肉味鮮美，且富含脂肪，特別是體內(nèi)富含n-3型多不飽和脂肪酸，在抗心血管疾病和調(diào)節(jié)血脂方面發(fā)揮重要作用[2]。近年來，由于受水利工程建設(shè)和人類活動(dòng)加劇等因素影響，使得該魚的野生資源量急劇減少[3-4]，因此增強(qiáng)種質(zhì)資源顯得尤為重要。

目前，拉薩裸裂尻魚的研究主要集中在生長規(guī)律[3]、食性[5]、胚胎發(fā)育[6]等方面，對(duì)拉薩裸裂尻魚病害方面的報(bào)道甚少，目前僅有拉薩裸裂尻魚體表出血病病原分離的研究報(bào)道[7]。2019年2月，在西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所養(yǎng)殖基地出現(xiàn)拉薩裸裂尻魚患病死亡現(xiàn)象，臨床癥狀主要表現(xiàn)為鰓蓋、下頜、腹部及側(cè)線有明顯的出血點(diǎn)，腹鰭和臀鰭充血發(fā)紅且肛門紅腫，解剖發(fā)現(xiàn)體內(nèi)有少許腹水。該病發(fā)病率高達(dá)20%～40%，死亡率達(dá)10%～20%，給該養(yǎng)殖基地帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。

筆者首次從拉薩裸裂尻魚肝臟內(nèi)分離到1株病原菌，經(jīng)人工回歸感染試驗(yàn)確定為致病菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特性研究，基于16S rRNA、gyrB基因確定分類地位，綜合鑒定該菌為中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)，同時(shí)進(jìn)行病原菌的耐藥性試驗(yàn)，以期為該病的治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病魚取自西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所養(yǎng)殖基地，體質(zhì)量9.99～14.45 g，用于人工感染試驗(yàn)的150尾健康拉薩裸裂尻魚取自拉薩市曲水縣西藏土著魚類增殖育種場，體質(zhì)量12.25～15.65 g。

主要試劑和儀器：普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(Oxoid公司)、藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)、革蘭氏染色試劑盒(青島海博生物)、API 20E試劑盒(法國Biomerieux公司)、瓊脂糖(Takara公司)；恒溫?fù)u床(美國Bio-Rad公司)、PCR 擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)、電泳儀(美國Bio-Rad公司)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離及形態(tài)學(xué)觀察

在無菌條件下進(jìn)行病原菌的分離。用75%酒精擦拭魚體，再用無菌接種針蘸取肝臟、脾臟及腹水進(jìn)行平板劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；選取優(yōu)勢單菌落在相同條件下進(jìn)行二次純化培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)學(xué)特性，同時(shí)挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察細(xì)菌的顯微結(jié)構(gòu)。最后將純化分離菌株于4 ℃保存待用。

1.2.2 人工感染試驗(yàn)

挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7～8 h，3500 r/min離心10 min收集菌體，然后用無菌生理鹽水依次調(diào)整至1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105cfu/mL不同密度的菌懸液。試驗(yàn)魚胸鰭基部注射0.2 mL對(duì)應(yīng)密度的菌懸液，對(duì)照組注射等量生理鹽水，30尾/組。每日觀察拉薩裸裂尻魚發(fā)病癥狀，連續(xù)觀察7 d。對(duì)感染死亡的拉薩裸裂尻魚進(jìn)行致病菌的分離鑒定試驗(yàn)。

1.2.3 生理生化鑒定

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，挑取純化的單菌落于普通營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基表面，在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，根據(jù)API 20E試劑盒相關(guān)操作進(jìn)行細(xì)菌的生理生化鑒定試驗(yàn)，結(jié)果參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[8]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

參照文獻(xiàn)[9]方法提取分離株細(xì)菌的總DNA，于-20 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。本試?yàn)中PCR反應(yīng)體系設(shè)為50 μL，以細(xì)菌DNA為PCR反應(yīng)模板，在0.2 mL Eppendorff管中依次加入以下試劑：10×PCR緩沖液(含MgCl2)5 μL，10 mmoL/L dNTPs 1 μL，16S rRNA正向引物(F：5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′[10])、反向引物(R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′[10])，gyrB正向引物(F: 5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′[11])、反向引物(R: 5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′[11])各1 μL，模板DNA 2 μL，rTaq酶0.4 μL，ddH2O 39.6 μL。反應(yīng)條件為：反應(yīng)前94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送華大基因進(jìn)行序列測定。

1.2.5 藥物敏感試驗(yàn)

運(yùn)用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將菌液制成1.0×108cfu/mL密度的懸液，用無菌棉球?qū)⒕壕鶆蛲坎荚诠腆w營養(yǎng)瓊脂表面，然后貼上不同的藥敏紙片，28 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的大小，結(jié)果參考British Society for Antimicrobial Chemotherapy(BSAC)標(biāo)準(zhǔn)[12]進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚癥狀和病原菌的分離

患病拉薩裸裂尻魚主要臨床癥狀表現(xiàn)為鰓蓋、下頜、腹部及側(cè)線有明顯的出血點(diǎn)，腹鰭和臀鰭充血發(fā)紅且肛門紅腫(圖1)，解剖魚體發(fā)現(xiàn)體內(nèi)有少許腹水。從病魚肝臟分離到1株細(xì)菌LS-01。該菌在普通營養(yǎng)瓊脂平板表面生長良好，在28 ℃培養(yǎng)24 h后形成光滑、隆起、有光澤，直徑在1.0～1.6 mm的圓形菌落，在油鏡下觀察到兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌(圖2)。

圖1 患病魚Fig.1 Sick S. younghusbandi

圖2 菌落革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Morphological characteristics of strain LS-01 stained by Gram

2.2 人工感染試驗(yàn)

試驗(yàn)組拉薩裸裂尻魚在注射0.2 mL密度為1.0×108cfu/mL的菌懸液后，3 d內(nèi)的死亡率達(dá)100%，對(duì)照組拉薩裸裂尻魚未出現(xiàn)死亡(表1)。感染死亡的拉薩裸裂尻魚臨床癥狀表現(xiàn)為腹部有出血點(diǎn)，肛門紅腫，解剖后腹腔內(nèi)有少許紅色腹水，這與自然環(huán)境下拉薩裸裂尻魚的患病癥狀極為相似，同時(shí)在病魚肝臟內(nèi)再次分離到優(yōu)勢菌，綜合細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化特性及分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果與菌株LS-01特性一致，表明菌株LS-01是引起此次拉薩裸裂尻魚患病的病原菌。根據(jù)改良寇氏法[13]，計(jì)算分離株細(xì)菌LS-01的半數(shù)致死密度為3.98×106cfu/mL。

表1 人工感染試驗(yàn)

2.3 生理生化鑒定

菌株LS-01能利用阿拉伯糖、D-甘露糖、麥芽糖、半乳糖、海藻糖等，苯丙氨酸脫氨酶、精氨酸雙水解酶、氧化酶陽性；鳥氨酸脫羧酶陰性(表2)。試驗(yàn)結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[8]比對(duì)分析，鑒定分離菌株LS-01為中間氣單胞菌。

表2 生理生化鑒定結(jié)果

2.4 16S rRNA、gyrB基因擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

以菌株LS-01的DNA為模板，使用16S rRNA、gyrB通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測到2條大小約為1500 bp、1200 bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果大小相符(圖3)。經(jīng)測序獲得16S rRNA、gyrB基因片段大小依次為1497 bp和1210 bp。

菌株LS-01的16S rRNA序列與中間氣單胞菌(GenBank登錄號(hào)：KC210759.1)的相似性高于99%；菌株LS-01的gyrB序列與中間氣單胞菌(GenBank登錄號(hào)：AY987513.1)的相似性高于99%。根據(jù)比對(duì)結(jié)果選取GenBank中已登錄的部分同屬異種的其他序列，運(yùn)用Clustal X軟件及MEGA 3.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，菌株LS-01與中間氣單胞菌聚為一支，進(jìn)一步確定菌株LS-01為中間氣單胞菌(圖4,圖5)。

圖3 菌株LS-01 16S rRNA、gyrB基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳Fig.3 The electropherogram of PCR amplified product based on 16S rRNA and gyrB gene in strain LS-01M.DL2000 DNA marker； 1.16S rRNA； 2.gyrB.

圖4 16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Unrooted neighbour-joining phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene

圖5 gyrB基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Unrooted neighbour-joining phylogenetic tree based on the gyrB gene

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

中間氣單胞菌LS-01對(duì)33種抗生素的敏感性見表3。結(jié)果顯示，中間氣單胞菌LS-01對(duì)頭孢他啶、頭孢哌酮等12種藥物高度敏感，對(duì)新霉素、卡那霉素等2種藥物敏感，對(duì)紅霉素、麥迪霉素等19種藥物耐藥。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

3.1 致病菌致病性及種類鑒定

自患病拉薩裸裂尻魚肝臟內(nèi)分離出的病原菌能夠在培養(yǎng)基表面生長出淺黃色、半透明的圓形菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢觀察為短桿狀的革蘭氏陰性菌。人工感染發(fā)病死亡的病魚臨床癥狀表現(xiàn)出與自然狀況下相似的病癥，同時(shí)從魚體內(nèi)再次分離出具有相同形態(tài)特征的病原菌，以上內(nèi)容符合科赫法則判定細(xì)菌性疾病的條件，說明此次拉薩裸裂尻魚死亡是由細(xì)菌性疾病引起。人工感染試驗(yàn)得到菌株LS-01的半致死密度為3.98×106cfu/mL，當(dāng)給魚體注射0.2 mL密度為1.0×108cfu/mL菌懸液時(shí)，3 d內(nèi)試驗(yàn)魚的死亡率達(dá)100%，表明該菌具有較強(qiáng)的致病性。

為確定病原菌的分類地位，運(yùn)用常規(guī)的分子生物學(xué)鑒定方法。本試驗(yàn)選用進(jìn)化速率慢，功能保守的16S rRNA基因進(jìn)行鑒定[14]，但該基因由于分子較小，包含的信息量少，對(duì)于同源關(guān)系接近的種間分辨率不夠[15]。由于gyrB基因在細(xì)菌的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中均起到重要作用，常用于分辨親緣關(guān)系較近的種間關(guān)系，故選用特異性更高的gyrB基因進(jìn)行鑒定[15]。本試驗(yàn)通過提取分離株細(xì)菌的DNA，然后分別以16S rRNA、gyrB基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析，結(jié)果與中間氣單胞菌相似度高達(dá)99%，最終鑒定菌株LS-01為中間氣單胞菌。

中間氣單胞菌屬氣單胞菌目、氣單胞菌科、氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性菌，廣泛分布于土壤、水體中，是淡水養(yǎng)殖中一類常見的病原菌?，F(xiàn)有研究報(bào)道，中間氣單胞菌能夠引起仿刺參(Apostichopusjaponicus)表皮潰爛病[16]、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)體表出血病[17]及斑點(diǎn)叉尾(Ictalunespunctatus)體表出血病[18]等。筆者首次從拉薩裸裂尻魚肝臟內(nèi)分離到中間氣單胞菌，對(duì)該菌的形態(tài)學(xué)、生理生化特性及致病性方面進(jìn)行了研究，但對(duì)于該細(xì)菌的致病機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

3.2 致病菌對(duì)常見抗生素的敏感性

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，從拉薩裸裂尻魚體內(nèi)分離出的中間氣單胞菌對(duì)頭孢他啶、頭孢哌酮、氨曲南等12種藥物高度敏感，該結(jié)果與王高學(xué)等[16-18]的研究結(jié)果存在一定的差異，這可能是由于抗生素的使用量不同、菌株來源差異和地理環(huán)境不同等所致[19]。在對(duì)該疾病的治療過程中，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第193號(hào)《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》和NY 5071—2002《無公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則》相關(guān)內(nèi)容并結(jié)合本試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，建議選擇氟苯尼考等高度敏感的抗菌藥物針對(duì)性地開展治療。同時(shí)，在實(shí)際生產(chǎn)中要科學(xué)地使用敏感性抗菌藥物進(jìn)行治療，同時(shí)積極改善養(yǎng)殖水體環(huán)境，增強(qiáng)魚體抵抗力。

4 結(jié) 論

致病菌株LS-01為革蘭氏陰性菌，經(jīng)鑒定為中間氣單胞菌，對(duì)拉薩裸裂尻魚幼魚半數(shù)致死劑量為3.98×106cfu/mL，對(duì)頭孢他啶、頭孢哌酮、左氧氟沙星、氟苯尼考等12種藥物高度敏感。