熊大林，段亞飛，陳成勛，孫永旭，董宏標(biāo)，詹愛軍，張家松

( 1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州 510300; 2.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384; 3.深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院，廣東 深圳 518010 )

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類。隨著對蝦集約化養(yǎng)殖程度的提高、環(huán)境脅迫頻發(fā)，導(dǎo)致對蝦死亡率居高不下，造成養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。氨氮是對蝦養(yǎng)殖中重要的環(huán)境脅迫因子[1-3]。尤其在廣東高溫季節(jié)，水環(huán)境中氨氮含量驟升現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，高含量的氨氮脅迫造成對蝦抗病力降低、免疫力下降和病原易感性增加等，危害對蝦的存活和生長[4-7]。凡納濱對蝦生長適宜溫度為25～32 ℃[8]，當(dāng)溫度超過33 ℃，生長速率和存活率降低[9]。水溫27 ℃、pH 8.15、鹽度20條件下，氨氮對體長5 cm的凡納濱對蝦的72 h半致死質(zhì)量濃度為31.44 mg/L[10]，隨著凡納濱對蝦的生長，其對氨氮的敏感度會有所降低。氨氮質(zhì)量濃度受溫度的影響，非離子氨含量與溫度呈正相關(guān)[11-12]。隨著溫度的升高，氨氮對短溝對蝦(Penaeussemisulcatus)[13]、河蜆(Corbiculafluminea)[14]的半致死質(zhì)量濃度不斷降低，毒性不斷增強。

甲殼動物對環(huán)境脅迫的生理適應(yīng)性與其滲透壓調(diào)節(jié)活動密切相關(guān)。Lignot等[15]認(rèn)為，機體滲透壓變化可作為監(jiān)測甲殼動物生理狀況和受環(huán)境脅迫影響的指標(biāo)之一。甲殼動物的滲透壓調(diào)節(jié)方式分為非等滲細(xì)胞外調(diào)節(jié)和等滲細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)兩類，前者主要依靠Na+/K+-ATP酶等離子轉(zhuǎn)運酶調(diào)節(jié)機體無機離子的含量，而后者則是彌補非等滲細(xì)胞外調(diào)節(jié)的缺陷，利用游離氨基酸平衡組織和血淋巴之間的滲透壓[16-17]。此外，Na+/K+-ATP酶及游離氨基酸還具有調(diào)節(jié)能量輸出及氨解毒作用[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境脅迫下，Na+/K+-ATP酶α、Na+/K+-ATP酶β等離子通道相關(guān)基因、水通道蛋白基因表達(dá)量和酶活性增加[20-22]；酶在細(xì)胞膜上的定位顯示，部分酶作用于細(xì)胞質(zhì)上，促進(jìn)滲透壓的調(diào)節(jié)[23]。甲殼動物在受到鹽度、氨氮、多氯聯(lián)苯等脅迫時，其游離氨基酸含量均發(fā)生顯著變化[24-26]。由此可知，游離氨基酸和ATP酶在甲殼動物逆境的滲透壓調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。

然而，目前關(guān)于高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦游離氨基酸含量以及Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的影響研究尚未見報道，其對解析環(huán)境脅迫對凡納濱對蝦滲透壓調(diào)節(jié)的影響機理具有重要意義。因此，筆者測定由正常水溫30 ℃急升至33 ℃，不同氨氮質(zhì)量濃度脅迫對凡納濱對蝦鰓中Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性以及肌肉和鰓中游離氨基酸含量的影響，旨在探討高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦滲透調(diào)節(jié)的影響作用，以期為凡納濱對蝦的健康養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2018年7月在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗基地進(jìn)行。健康凡納濱對蝦平均體質(zhì)量(6.77±0.51) g，于200 L玻璃纖維桶中，每桶50尾，暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)期間水溫30 ℃、鹽度30、pH 8.4，持續(xù)充氧，每日更換2/3體積海水，按其體質(zhì)量5%定時投喂對蝦配合飼料。

1.2 急性升溫下氨氮脅迫試驗

將暫養(yǎng)7 d的健康凡納濱對蝦隨機分為24組，每組50尾。試驗設(shè)置2個溫度梯度，每溫度下設(shè)置4個氨氮質(zhì)量濃度組，共8個試驗組，每組3個平行。溫度設(shè)常溫對照(30 ℃)、高溫脅迫(33 ℃)；氨氮脅迫設(shè)對照(0 mg/L)、低質(zhì)量濃度(5 mg/L)、中質(zhì)量濃度(15 mg/L)和高質(zhì)量濃度(25 mg/L)。33 ℃組水溫用加熱棒在1 h內(nèi)由30 ℃急升至33 ℃，并進(jìn)行恒溫控制。各組水體氨氮質(zhì)量濃度分別以氯化銨溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，每4 h使用靛酚藍(lán)分光光度法(GB 17378.4—2007)檢測水中氨氮質(zhì)量濃度，維持質(zhì)量濃度穩(wěn)定。試驗期間，每日換水1/3，日常管理與暫養(yǎng)期間相同。于脅迫72 h后，每組分別取10尾凡納濱對蝦的鰓組織和40 g肌肉組織，冷凍保存在液氮中，用于測定酶活性和游離氨基酸含量。

1.3 ATP酶活性測定

鰓組織樣品冰上解凍后，于預(yù)冷的0.9%生理鹽水中漂洗去除組織液，濾紙拭干；稱量質(zhì)量后置于離心管中，按照m(組織)∶V(生理鹽水)=1∶9的比例混合，低溫研磨制成組織勻漿后，4 ℃、1000 r/min離心5 min，取上清液用于測定酶活性。

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性以及總蛋白含量。總蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.4 游離氨基酸含量測定

參考《實用食物營養(yǎng)成分分析手冊》[27]中游離氨基酸的提取方法，將各組鰓和肌肉樣品分別制成勻漿，稱取15 mg置于水解管中，加入6 mol/L鹽酸10 mL以及新蒸餾的苯酚3滴，再將水解管冷凍3 min后抽真空，充入高純氮氣；再抽真空充氮氣，重復(fù)3次后，將充足氮氣的水解管密封后于110 ℃干燥水解22 h。水解完成后取出冷卻，將水解液過濾，用去離子水反復(fù)沖洗水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶內(nèi)，用去離子水定容。吸取濾液1 mL于5 mL容量瓶內(nèi)，用真空干燥器在40 ℃干燥，殘留物用1 mL水溶解，再干燥，反復(fù)進(jìn)行2次，最后蒸干，用1 mL pH 2.2的緩沖液溶解。

準(zhǔn)確吸取0.20 mL混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，用pH 2.2的緩沖液稀釋至5 mL，此標(biāo)準(zhǔn)稀釋液濃度為 0.5 nmol/μL，作為上機測定用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，以外標(biāo)法用氨基酸自動分析儀測定樣品測定液的氨基酸含量(w)。

式中，n為上機樣品液中氨基酸量，f為樣品的稀釋倍數(shù)，Mr為氨基酸的相對分子質(zhì)量，m為樣品質(zhì)量(g)，V為上機時的進(jìn)樣量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較(LSD法和Duncan法)，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦鰓中ATP酶活性的影響

高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦鰓中Na+/K+-ATP酶活性的影響見圖1。同一溫度下，30 ℃時僅25 mg/L氨氮組Na+/K+-ATP酶活性顯著升高(P<0.05)；33 ℃時Na+/K+-ATP酶活性隨氨氮質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)顯著先升后降又升的趨勢(P<0.05)。同一氨氮質(zhì)量濃度下，氨氮質(zhì)量濃度為5 mg/L時，33 ℃組Na+/K+-ATP酶活性顯著高于30 ℃組(P<0.05)；而氨氮質(zhì)量濃度為0、15、25 mg/L時，33 ℃組Na+/K+-ATP酶活性顯高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦鰓中Ca2+-ATP酶活性的影響見圖2。同一溫度下，30 ℃時僅5 mg/L氨氮組Ca2+-ATP酶活性顯著升高(P<0.05)，而33 ℃組Ca2+-ATP酶活性隨氨氮質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)先升后降的趨勢(P<0.05)，氨氮質(zhì)量濃度為15 mg/L時酶活性最高。同一氨氮質(zhì)量濃度下，氨氮質(zhì)量濃度為15 mg/L時，33 ℃組Ca2+-ATP酶活性顯著高于30 ℃組(P<0.05)；而氨氮質(zhì)量濃度為0、5、25 mg/L時，33 ℃組Ca2+-ATP酶活性顯著低于30 ℃組(P<0.05)。

著低于30 ℃組(P<0.05)。

圖1 高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦鰓中Na+/K+-ATP酶活性的影響Fig.1 Combined effects of high temperature and ammonia stress on Na+/K+-ATPase activity in the gills of Pacific white shrimp L. vannamei不同字母表示同一溫度下不同氨氮質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)； *表示同一氨氮質(zhì)量濃度下不同溫度組間差異顯著(P<0.05)；下同.Means with different letters are significant diferences between different ammonia concentrations in each temperature treatment (P<0.05)； * indicates significant differences between two temperatures within the same ammonia treatment (P<0.05); et sequentia.

圖2 高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦鰓中Ca2+-ATP酶活性的影響Fig.2 Combined effects of high temperature and ammonia stress on Ca2+-ATPase activity in the gills of Pacific white shrimp L. vannamei

2.2 高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦鰓中游離氨基酸含量的影響

高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦鰓中游離氨基酸含量的影響見表1。同一溫度下，30 ℃時僅5 mg/L氨氮組游離氨基酸總含量顯著降低(P<0.05)，其他氨氮組間差異不顯著。而33 ℃時游離氨基酸總含量隨氨氮質(zhì)量濃度的升高呈先升后降的趨勢(P<0.05)，氨氮質(zhì)量濃度為5 mg/L時游離氨基酸總含量最高。同一氨氮質(zhì)量濃度下，氨氮質(zhì)量濃度為5 mg/L時，33 ℃組游離氨基酸總含量顯著高于30 ℃組(P<0.05)，而在氨氮質(zhì)量濃度為15 mg/L和25 mg/L時均顯著低于30 ℃組(P<0.05)。脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸是鰓中游離氨基酸的主要成分，其中脯氨酸和甘氨酸含量在30 ℃和33 ℃氨氮脅迫下的變化趨勢與游離氨基酸總含量一致。

表1 高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦鰓中游離氨基酸含量的影響 mg/g

2.3 高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦肌肉中游離氨基酸含量的影響

高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦肌肉中游離氨基酸含量的影響見表2。同一溫度下，30 ℃時游離氨基酸總含量隨氨氮質(zhì)量濃度的升高而顯著升高(P<0.05)，而33 ℃時游離氨基酸總含量隨氨氮質(zhì)量濃度的升高呈先降后升的趨勢(P<0.05)。同一氨氮質(zhì)量濃度下，33 ℃組游離氨基酸總含量在氨氮質(zhì)量濃度15 mg/L和25 mg/L時均顯著低于30 ℃組(P<0.05)。甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸和絲氨酸是肌肉中游離氨基酸的主要成分，其中30 ℃和33 ℃氨氮脅迫下，丙氨酸均隨氨氮質(zhì)量濃度的升高顯著升高，且同一氨氮質(zhì)量濃度下33 ℃組均顯著高于30 ℃組(P<0.05)；精氨酸和脯氨酸含量的變化與游離氨基酸總含量的變化趨勢一致。

表2 高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦肌肉中游離氨基酸含量的影響 mg/g

3 討 論

3.1 高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦鰓中ATP酶活性的影響

離子轉(zhuǎn)運酶在甲殼動物滲透壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。機體依靠離子轉(zhuǎn)運酶將離子跨膜運輸，抑制環(huán)境變化造成的離子被動擴散，維持血淋巴滲透壓和離子平衡[28]。當(dāng)環(huán)境因子的改變使甲殼動物排氨受阻時，幾種膜轉(zhuǎn)運蛋白(H+-ATP酶、Na+/H+交換劑、Na+通道)會與Rhesus(Rh)糖蛋白共同實現(xiàn)Na+/NH4+交換，促進(jìn)氨排泄和Na+吸收[29]。Pinto等[23]的研究表明，氨氮脅迫72 h，亞馬遜沼蝦(Macrobrachiumamazonicum)Na+/K+-ATP酶和V型H+-ATP酶活性比對照組升高了1.5～2.0倍；氨氮質(zhì)量濃度變化導(dǎo)致V型H+-ATP酶在鰓支柱細(xì)胞的頂端凸緣和支柱細(xì)胞內(nèi)均存在，由此推斷蝦通過提高離子轉(zhuǎn)運途徑調(diào)節(jié)滲透壓平衡，促使部分新合成的酶定位到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，提高NH3向NH4+的囊泡轉(zhuǎn)化。離子轉(zhuǎn)運酶的調(diào)節(jié)能力也會受到氨氮脅迫量的影響。Lee等[30]研究表明，氨氮脅迫8 h后，高氨氮脅迫組(10.106 mg/L和20.093 mg/L)中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)的Na+/K+-ATP酶活性顯著低于低氨氮脅迫組(5.043 mg/L和0.037 mg/L)。Shrivastava等[20]將鯉魚(Cyprinuscarpio)在氨氮濃度為0.27 mmol/L(10% 96 h半致死濃度)的環(huán)境下預(yù)適應(yīng)3～7 d后，再轉(zhuǎn)至1.35 mmol/L氨氮濃度(50% 96 h半致死濃度)下脅迫12 h和48 h，鯉魚存活時間更長，與Na+/NH4+交換有關(guān)的Rhesus (Rh)糖蛋白、Rhcg-α和Rhcg-β mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，且Na+/H+交換劑(NHE-3)、Na+/K+-ATP酶活性和mRNA表達(dá)同樣顯著升高。在致死和亞致死氨氮脅迫下機體的滲透壓調(diào)節(jié)效果明顯，但氨氮脅迫時間過長或含量較高時，調(diào)節(jié)效應(yīng)會減弱。

本試驗中，無氨氮脅迫時，33 ℃組凡納濱對蝦Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性比30 ℃組顯著降低，表明急性升溫會抑制凡納濱對蝦滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)酶活性。在33 ℃時氨氮脅迫下，Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性在低、中質(zhì)量濃度組呈現(xiàn)出不同的變化。低氨氮質(zhì)量濃度時Na+/K+-ATP酶活性升高，中氨氮質(zhì)量濃度時活性最低，與Na+/K+-ATP酶不同，Ca2+-ATP酶活性在低氨氮質(zhì)量濃度時增加不顯著，而在中氨氮質(zhì)量濃度時達(dá)到最高。這表明高溫與氨氮復(fù)合脅迫下低濃度氨氮對凡納濱對蝦滲透壓調(diào)節(jié)能力有一定的誘導(dǎo)作用，凡納濱對蝦通過Na+/K+-ATP酶調(diào)節(jié)滲透壓以及排氨的能力最強。已有研究表明，水中鹽度、K+、Mg2+和Ca2+之間具有交互作用，對凡納濱對蝦的生長存活和Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性均有顯著影響[31]。因此，推測在低、中質(zhì)量濃度氨氮脅迫下，Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶協(xié)同發(fā)揮滲透壓調(diào)節(jié)作用，但氨氮影響了水體中的離子變化，引起機體對離子的吸收存在差異，造成兩種酶之間出現(xiàn)相反情況，并且在此影響下中質(zhì)量濃度組Na+/K+-ATP酶活性比高質(zhì)量濃度組還要低。在高氨氮質(zhì)量濃度時，33 ℃下Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均顯著低于30 ℃時的酶活性，可能是脅迫造成鰓組織損傷，導(dǎo)致機體細(xì)胞膜通透性增加，離子轉(zhuǎn)運能力降低，影響了機體的滲透壓調(diào)節(jié)功能。

3.2 高溫與氨氮復(fù)合脅迫對凡納濱對蝦組織中游離氨基酸含量的影響

游離氨基酸為重要平衡組織和血淋巴間滲透壓的細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物[32]。張丹等[24]研究表明，凡納濱對蝦在周期性鹽度波動下，隨著鹽度的升高，肌肉和鰓游離氨基酸總量均有增加趨勢；其中甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸和谷氨酸是肌肉游離氨基酸的主要成分，而鰓中甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸和脯氨酸比例較高。當(dāng)機體遭遇環(huán)境脅迫時，游離氨基酸還具有排氨和能量輸出的功能。甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸是對蝦滲透壓主要效應(yīng)物[33]，其中丙氨酸還是氨解毒途徑中的重要效應(yīng)物[25]。三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)受鹽度脅迫時，隨鹽度的升高，甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸的含量顯著增加，鹽度50時氨基酸上升幅度分別為鹽度10時的1.84倍、1.59倍和5.60倍[34]。精氨酸是一氧化氮合成的前體，一氧化氮能夠刺激哺乳動物的肝臟和肌肉中的葡萄糖攝取和氧化以及脂肪酸氧化[35]，在機體抵御病原感染中發(fā)揮重要作用[36-38]。Costas等[39]研究發(fā)現(xiàn)，塞內(nèi)加爾舌鰨(Cynoglossussenegalensis)離水在空氣中暴露3 min，血清中精氨酸含量降低。凡納濱對蝦受急性低溫脅迫時，血清中精氨酸含量隨溫度降低而顯著升高[40]。

本試驗中，凡納濱對蝦肌肉中甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸和絲氨酸為游離氨基酸的主要成分，而鰓中游離氨基酸主要為脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸，這與張丹等[24]的研究結(jié)果相似。33 ℃時氨氮脅迫下，鰓組織中游離氨基酸含量在低氨氮質(zhì)量濃度5 mg/L時顯著升高，而在高氨氮質(zhì)量濃度15 mg/L和25 mg/L時均顯著降低；肌肉中游離氨基酸含量在氨氮質(zhì)量濃度5、15 mg/L和25 mg/L時均顯著降低。在30 ℃氨氮脅迫下，凡納濱對蝦鰓中甘氨酸與脯氨酸含量顯著升高，而在33 ℃和氨氮復(fù)合脅迫下，凡納濱對蝦鰓中甘氨酸與脯氨酸含量以及肌肉中精氨酸和脯氨酸顯著降低。與游離氨基酸含量變化趨勢一致；無論是30 ℃氨氮脅迫還是33 ℃氨氮脅迫下，凡納濱對蝦肌肉中丙氨酸均隨氨氮質(zhì)量濃度的升高顯著增加，且33 ℃組顯著高于30 ℃組。由此推測，單一因素的氨氮脅迫對對蝦滲透壓調(diào)節(jié)有誘導(dǎo)作用，機體為實現(xiàn)氨解毒代謝，不斷以氨基酸的形式將氨代謝；而高溫與氨氮復(fù)合脅迫下，機體的解毒代謝達(dá)到負(fù)荷，排氨能力受到影響，不利于對蝦滲透壓的調(diào)節(jié)。

4 結(jié) 論

高溫與氨氮復(fù)合脅迫72 h，凡納濱對蝦鰓中Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性以及肌肉和鰓中游離氨基酸含量均發(fā)生顯著變化，表明高溫與氨氮復(fù)合脅迫造成對蝦滲透壓生理調(diào)節(jié)功能紊亂。本試驗中的幾種生理指標(biāo)對高溫和氨氮復(fù)合脅迫的反應(yīng)均較為敏感，可以作為對蝦滲透壓生理調(diào)節(jié)研究的評價指標(biāo)。