趙巧君，焦 雄

(太原理工大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，山西 晉中 030600)

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，蛋白質(zhì)相互作用的研究逐漸成為一個(gè)熱門領(lǐng)域。雖然許多學(xué)者致力于研究PPIs網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)功能模塊等，但這些研究結(jié)果均缺少信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方向信息，這些信息通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)從一種蛋白質(zhì)傳遞到另一種蛋白質(zhì)來參與生命機(jī)制的運(yùn)作，可用于探索病理機(jī)制[1]、研究細(xì)胞應(yīng)答過程[2]、遏制疾病的發(fā)生[1]、預(yù)測蛋白質(zhì)功能[3]等。在人類PPIs網(wǎng)絡(luò)中，PPIs通常參與多個(gè)細(xì)胞過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其方向需要進(jìn)一步的探索和研究。

經(jīng)典的高通量技術(shù)手段往往用來預(yù)測蛋白質(zhì)之間是否發(fā)生相互作用，很難發(fā)現(xiàn)PPIs間的方向性，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，研究者們開始利用計(jì)算的手段將單個(gè)蛋白質(zhì)的研究轉(zhuǎn)向PPIs網(wǎng)絡(luò)。目前，許多研究小組已經(jīng)應(yīng)用生物信息學(xué)方法在PPIs網(wǎng)絡(luò)中定向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。例如，STEFFEN et al[4]通過實(shí)驗(yàn)獲得的PPIs與DNA微陣列的表達(dá)譜相結(jié)合來定向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，但是該研究結(jié)果受到步長的限制；VINAYAGAM et al[5]利用每對PPI的最短路徑數(shù)來定向人類信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，這依然受到最短路徑的影響；LIU et al[6]通過使用蛋白功能注釋隱含的上下游關(guān)系來區(qū)分PPIs的信號流向，但會因蛋白質(zhì)研究程度的深淺而導(dǎo)致注釋分布不均勻，最終限制該方法的使用。在本文中，為避免這些限制的影響，提出了一種基于網(wǎng)絡(luò)傳播具有良好拓展性的定向算法，并將其應(yīng)用于人類PPIs網(wǎng)絡(luò)。

隨著隨機(jī)游走[7]和迭代算法的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)傳播[8]的出現(xiàn)為指導(dǎo)大規(guī)模信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的研究提供了基礎(chǔ)。這類方法的原理基于網(wǎng)絡(luò)上信息的迭代傳播，使信息遍布整個(gè)網(wǎng)絡(luò)，它可以度量每個(gè)節(jié)點(diǎn)的表型在網(wǎng)絡(luò)中的相似性而不受最短路徑和步數(shù)的限制。網(wǎng)絡(luò)傳播可以靈活地應(yīng)用于各種網(wǎng)絡(luò)，因此可以進(jìn)一步擴(kuò)展成定向人類復(fù)雜PPIs網(wǎng)絡(luò)的方法。目前，只有SILVERBUSH et al[9]嘗試將網(wǎng)絡(luò)傳播算法應(yīng)用于人類大規(guī)模PPIs網(wǎng)絡(luò)。在此方法的基礎(chǔ)上，本文還創(chuàng)新地結(jié)合了蛋白質(zhì)語義相似性度量[10]和重疊聚類算法[11]，并將其應(yīng)用于預(yù)測人類大型PPIs網(wǎng)絡(luò)的信號流方向。

雖然傳播步數(shù)和最短路徑的限制可以被網(wǎng)絡(luò)傳播算法彌補(bǔ)，但是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)自身不對稱性和PPIs權(quán)重測量方法的自身缺陷會導(dǎo)致無向PPIs和有向PPIs的區(qū)分困難。通過結(jié)合重疊聚類算法來檢測無向的PPIs，改善了網(wǎng)絡(luò)傳播算法關(guān)于識別無向PPIs的問題。在人類PPIs網(wǎng)絡(luò)中，蛋白質(zhì)復(fù)合物形成了密集的連接區(qū)域，且相應(yīng)的節(jié)點(diǎn)可能屬于一個(gè)以上的聚類，即參與多種復(fù)合物并發(fā)揮生物作用，這樣的節(jié)點(diǎn)非常適合采用具有重疊鄰域擴(kuò)展的聚類算法進(jìn)行預(yù)測。

為了度量蛋白質(zhì)間的關(guān)聯(lián)程度，從而為信號游走提供依據(jù)，需要計(jì)算PPIs的權(quán)重。雖然實(shí)驗(yàn)類型的證據(jù)可以作為蛋白質(zhì)相互作用的度量手段，但是因?qū)嶒?yàn)條件與細(xì)胞環(huán)境的影響容易造成假陰性數(shù)據(jù)。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，功能相似的蛋白質(zhì)之間傾向于相互作用。基于GO(gene ontology)[12]語義相似度的simIC[13]和BMA(best-mach average)[14]來計(jì)算PPIs的權(quán)重，這避免了受實(shí)驗(yàn)類型測量和蛋白質(zhì)淺注釋的限制。

本文的目的是區(qū)分有向PPIs和無向的PPIs，并預(yù)測有向PPIs的方向性，從而定向人類的PPIs網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的研究打下基礎(chǔ)。為實(shí)現(xiàn)這一目的，本文通過結(jié)合蛋白質(zhì)語義相似性度量和重疊聚類算法，利用網(wǎng)絡(luò)傳播算法來定向人類PPIs網(wǎng)絡(luò)的信號流方向。

1 材料和方法

1.1 算法框架

為定向PPIs網(wǎng)絡(luò)，算法的過程分以下幾步：1) 利用蛋白質(zhì)語義相似性計(jì)算PPIs的權(quán)重；2) 運(yùn)行網(wǎng)絡(luò)傳播算法，獲得每個(gè)PPI的得分；3) 利用Cluster ONE區(qū)分無向PPIs和有向PPIs；4) 判斷有向PPIs的方向，形成有向的PPIs網(wǎng)絡(luò)。其中，步驟2)和3)不分先后順序可同時(shí)進(jìn)行。

算法的輸入為通過預(yù)處理的無向的PPIs網(wǎng)絡(luò)以及網(wǎng)絡(luò)涉及的源蛋白和靶蛋白，這里的源蛋白為整個(gè)PPIs網(wǎng)絡(luò)的信號起點(diǎn)，靶蛋白為信號終點(diǎn)。算法輸出的是PPIs的分?jǐn)?shù)列表，每對PPI都有對應(yīng)的分?jǐn)?shù)來代表信號流的方向。算法框架如圖1所示。

圖1 算法的框架Fig.1 Framework of the algorithm

1.2 數(shù)據(jù)集

1.2.1網(wǎng)絡(luò)和測試集

為了改進(jìn)算法，本文準(zhǔn)備了網(wǎng)絡(luò)，并刪除了其方向信息。該網(wǎng)絡(luò)來自KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/)的VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，且僅包括蛋白質(zhì)間的相互作用，PPIs的權(quán)重是通過蛋白質(zhì)功能注釋來計(jì)算的。網(wǎng)絡(luò)中的源蛋白和靶蛋白均從VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)圖中獲得。

同時(shí)，還收集了已知方向的PPIs和經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的蛋白質(zhì)復(fù)合物作為測試集，如下：

1) 從CORUM數(shù)據(jù)庫(http://mips.helmholtz-muenchen.de/corum/)中整理了2 916個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物。

2) 從KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/)中下載了567對涉及整合素參與的PPIs，其中包括137對有向的PPIs，430對無向的PPIs.

3) 從VINAYAGAM et al[5]計(jì)算的結(jié)果中獲得34 814對有向的PPIs.

1.2.2人類PPIs網(wǎng)絡(luò)

為構(gòu)建人類PPIs網(wǎng)絡(luò)，收集了473個(gè)參與KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的蛋白質(zhì)(其中有99個(gè)蛋白質(zhì)與整合素參與的網(wǎng)絡(luò)有關(guān))，并對此數(shù)據(jù)集做了預(yù)處理。首先，在String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)中獲得初步的PPIs網(wǎng)絡(luò)，并輸入收集到的473個(gè)蛋白質(zhì)，設(shè)置蛋白質(zhì)相互作用來源為文字挖掘、實(shí)驗(yàn)、資料庫、共表達(dá)、基因融合等，剔除相互作用的得分低于0.7的PPIs(分?jǐn)?shù)高于0.7的PPIs可靠性高)，最終獲得4 668對PPIs；其次，處理PPIs中的假陽性問題，利用蛋白質(zhì)語義相似性篩選并獲得4 220對權(quán)重大于0.4的PPIs(本文設(shè)置權(quán)重為0.4作為區(qū)分蛋白質(zhì)功能關(guān)聯(lián)的閾值)；最后，構(gòu)建加權(quán)的功能相關(guān)的PPIs網(wǎng)絡(luò)。

1.3 權(quán)重的計(jì)算

PPIs的權(quán)重將從根本上決定信號傳播方向的準(zhǔn)確性問題。本文結(jié)合simIC和BMA，借助DaGO-Fun軟件[15]來計(jì)算PPIs權(quán)重。該方法根據(jù)蛋白質(zhì)的GO注釋來計(jì)算蛋白質(zhì)的語義相似性或者功能相似性，從而表征PPIs權(quán)重。計(jì)算方法如下：

(1)

(2)

式(1)定義了術(shù)語的語義相似性度量。其中，t是注釋蛋白質(zhì)的術(shù)語；MICA表示t1和t2的信息最豐富的共同祖先；IC(t)代表術(shù)語t在語料庫中的普及程度。式(2)通過評價(jià)注釋兩個(gè)蛋白質(zhì)的所有術(shù)語之間的語義相似性來確定PPIs權(quán)重。其中，p和q是相互作用的蛋白；x代表生物學(xué)過程(BP)本體注釋的一組GO術(shù)語，給定的蛋白質(zhì)n，m分別代表集合中GO項(xiàng)的數(shù)量。

1.4 網(wǎng)絡(luò)傳播

參照SILVERBUSH et al[9]的方法將網(wǎng)絡(luò)傳播應(yīng)用于PPIs網(wǎng)絡(luò)。首先，輸入一個(gè)加權(quán)的PPIs網(wǎng)絡(luò)，源蛋白和靶蛋白(源蛋白為膜蛋白，靶蛋白為肌動(dòng)蛋白和基因調(diào)控蛋白)；其次，網(wǎng)絡(luò)傳播將信息從源蛋白開始以迭代的方式傳播到附近的節(jié)點(diǎn)直到收斂，傳播結(jié)束后PPIs網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)蛋白質(zhì)獲得的分?jǐn)?shù)代表其與源蛋白的接近度，同理，將信息從靶蛋白開始傳播，每個(gè)蛋白質(zhì)獲得的分?jǐn)?shù)代表其與靶蛋白的接近度；最后，算法通過組合兩個(gè)蛋白質(zhì)的得分來比較兩個(gè)蛋白質(zhì)接近源蛋白和靶蛋白的程度，輸出代表PPIs方向的分?jǐn)?shù)。算法過程如下：

Input:G(V,E)，ci∈C，ti∈T，w(u,v)

from sources:Pc=(c1,c2,…,cn)1×nF'c=α·Fc·W+(1-α)Pcif ‖F(xiàn)'c-Fc‖2<β:stop????????from sources:Pt=(t1,t2,…,tn)1×nF't=α·Ft·W+(1-α)Ptif ‖F(xiàn)'t-Ft‖2<β:stop

if score(u,v)>1:u→v

if score(u,v)<1:u←v

輸入一個(gè)無向圖G=(V,E)，其中，V表示蛋白質(zhì)的集合；E表示PPIs的集合；C和T分別是源蛋白和靶蛋白的集合，w(u,v)表示蛋白質(zhì)u和v相互作用的權(quán)重。在算法的過程中：W是歸一化的權(quán)重矩陣，N(u)代表蛋白質(zhì)u的鄰居的集合。Pc和Pt分別是關(guān)于源蛋白和靶蛋白的先驗(yàn)知識的向量(若ci∈C，ci=1，ti同理)。α是網(wǎng)絡(luò)和先驗(yàn)知識的平衡參數(shù)，設(shè)為0.6.β=10-5是控制傳播停止的參數(shù)。算法結(jié)束后，獲得PPIs的分?jǐn)?shù)列表。PPIs的分?jǐn)?shù)大于1，意味著u比v更靠近源蛋白，u、v間的信號流方向u→v；當(dāng)PPIs的分?jǐn)?shù)小于1，u、v間的信號流方向u←v.

1.5 重疊聚類算法

重疊聚類算法用來區(qū)分無向PPIs與有向PPIs. ClusterONE算法通過尋找具有內(nèi)聚性的重疊蛋白質(zhì)復(fù)合物團(tuán)來預(yù)測無向PPIs，算法的實(shí)現(xiàn)借助Cytoscape軟件[16]中的ClusterONE插件。在操作過程中，分別選擇了加權(quán)的PPIs網(wǎng)絡(luò)和未加權(quán)的PPIs網(wǎng)絡(luò)作為輸入，使用表1中的參數(shù)來計(jì)算聚類。

表1 ClusterONE參數(shù)Table 1 Parameters of ClusterONE

1.6 評估方法

大型的PPIs網(wǎng)絡(luò)中，無向PPIs并未經(jīng)過全面的驗(yàn)證，使用傳統(tǒng)的準(zhǔn)確率、靈敏度等來評估預(yù)測的無向PPIs會降低分?jǐn)?shù)。本文使用GO功能富集分析來評估無向PPIs的預(yù)測能力，利用具有生物學(xué)意義P值范圍內(nèi)的無向PPIs數(shù)量占所有預(yù)測的無向PPIs數(shù)量的比例，來量化預(yù)測的無向PPIs的生物學(xué)意義。

為了評估預(yù)測的有向PPIs的方向性，計(jì)算了ROC曲線。ROC曲線展示了不同閾值下的敏感性和1-特異性，敏感性和特異性用來衡量定向算法在不同閾值下識別有向PPIs中真陽性和假陽性的能力。閾值是分界線，被用來區(qū)分PPIs的方向。如果PPI(蛋白質(zhì)u與蛋白質(zhì)v相互作用)的分?jǐn)?shù)高于閾值，則方向?yàn)閡→v，反之亦然。ROC曲線下的面積(AUC)越大，算法的性能越好。

2 結(jié)果和討論

2.1 VEGF網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果和分析

為了初步測試PPIs權(quán)重對定向的影響，網(wǎng)絡(luò)傳播算法對區(qū)分無向PPIs和有向PPIs以及預(yù)測有向PPIs方向性的性能，選擇了VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。將加權(quán)的(通過蛋白質(zhì)語義相似性來計(jì)算)網(wǎng)絡(luò)輸入到網(wǎng)絡(luò)傳播中，獲得PPIs分?jǐn)?shù)，從而繪制分?jǐn)?shù)分布的統(tǒng)計(jì)圖，如圖2所示。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)傳播算法，分?jǐn)?shù)分布在1左右的PPIs，因兩個(gè)蛋白在接近源蛋白與靶蛋白的程度上相近而被歸類為無向的PPIs. 為了檢驗(yàn)該結(jié)論，將PPIs得分進(jìn)行了劃分(見圖3)，并將結(jié)果與已知方向的信號路徑進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，如果僅使用網(wǎng)絡(luò)傳播算法，將限制無向PPIs和有向PPIs的劃分，因此需要結(jié)合其他方法來區(qū)分無向PPIs和有向PPIs，以實(shí)現(xiàn)比VEGF通路更復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)的定向。

圖2 PPIs分?jǐn)?shù)的分布Fig.2 Score distribution of PPIs

圖3 不同分?jǐn)?shù)段中的PPIs數(shù)量Fig.3 Number of PPIs in different fractions

為了消除分布在1左右的分?jǐn)?shù)對區(qū)分無向PPIs和有向PPIs的影響，將所有PPIs視為有向PPIs，并以分?jǐn)?shù)1作為分界線來區(qū)分信號流的方向，獲得了有向VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(見圖4).與KEGG中的原始通路相比，本文只有一個(gè)PPI被錯(cuò)誤地預(yù)測，而原始方法有4個(gè)PPIs被錯(cuò)誤地預(yù)測。因此，當(dāng)不考慮無向PPIs的區(qū)分時(shí)，通過使用蛋白質(zhì)語義相似性來計(jì)算小型PPIs網(wǎng)絡(luò)的權(quán)重提高了信號流方向的預(yù)測水平。

圖2中，當(dāng)不考慮無向PPIs的得分時(shí)，期望得分大于1的PPI的方向性為u→v(蛋白質(zhì)u和v之間的相互作用)，得分小于1的PPI的方向性為u←v. 圖3中，有4對PPIs在0.9～1.1的得分范圍內(nèi)，只有1對屬于真正的無向PPI，其得分為0.910 9，這意味著網(wǎng)絡(luò)傳播算法在識別無向PPIs時(shí)存在缺陷。當(dāng)面向更加復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)時(shí)，分?jǐn)?shù)1左右的PPIs的數(shù)量將更加龐大，會摻雜更多的假陽性數(shù)據(jù)。圖4中，節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，線代表PPIs，箭頭代表預(yù)測的信號流方向。該網(wǎng)絡(luò)包含28種蛋白質(zhì)，其中紅色矩形為源蛋白質(zhì)，藍(lán)色菱形為目標(biāo)蛋白質(zhì)。在32個(gè)PPIs中有一個(gè)PPI被錯(cuò)誤預(yù)測，用紅線標(biāo)記。

圖4 PPIs的方向Fig.4 Direction of PPIS

2.2 人類PPIs網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果及評估

結(jié)合蛋白質(zhì)語義相似性測量和重疊聚類算法，將改良后的算法用于定向大型的人類PPIs網(wǎng)絡(luò)。在無向PPIs的預(yù)測中，使用加權(quán)PPIs網(wǎng)絡(luò)和未加權(quán)PPIs網(wǎng)絡(luò)，分別獲得了兩組預(yù)測的無向PPIs，為了評估預(yù)測的無向PPIs，分別對其進(jìn)行GO功能富集分析，并統(tǒng)計(jì)了P<0.05以內(nèi)不同范圍的無向PPIs數(shù)量以及占所有預(yù)測的無向PPIs數(shù)量的比例，結(jié)果見表2.雖然兩組預(yù)測的結(jié)果中，具有顯著的生物學(xué)意義的無向PPIs均占較高的比例，分別為86.86%和95.79%，但是未加權(quán)PPIs網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果優(yōu)于加權(quán)的PPIs網(wǎng)絡(luò)，這也許與該網(wǎng)絡(luò)為蛋白質(zhì)功能相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)而非物理相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。最終選取未加權(quán)的PPIs網(wǎng)絡(luò)獲得的1 664對PPIs作為預(yù)測集的無向PPIs.

表2 GO功能富集分析Table 2 Functional enrichment analysis of GO

預(yù)測的2 556對有向的PPIs，其方向性的統(tǒng)計(jì)如圖5所示。為了評估算法對有向PPIs的方向性的預(yù)測性能，分別將結(jié)果與KEGG數(shù)據(jù)集和VINAYAGAM et al[5]的計(jì)算結(jié)果相重疊的部分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(如圖6所示)繪制ROC曲線，KEGG測試集中PPIs的方向性得到了大量數(shù)據(jù)的驗(yàn)證，當(dāng)以KEGG作為測試集時(shí)，算法的結(jié)果獲得了較好的性能(見圖7)，這表明本文的結(jié)果具有較好的參考價(jià)值。

圖5 預(yù)測的有向PPIs方向性數(shù)量分布Fig.5 Predicted directional quantity distribution of oriented PPIs

圖5中，分?jǐn)?shù)小于1的信號流的方向規(guī)定為u←v，分?jǐn)?shù)大于1的信號流的方向規(guī)定為u→v.圖6驗(yàn)證了分?jǐn)?shù)1在大型的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中也不能明確區(qū)分無向PPIs和有向PPIs，表明改良后的算法在區(qū)分無向PPIs和有向PPIs的必要性。由圖7可以看出，算法在經(jīng)過大量驗(yàn)證的KEGG數(shù)據(jù)集上獲得了較好的結(jié)果(AUC為0.813).

圖6 預(yù)測的無向PPIs和有向PPIs分?jǐn)?shù)分布箱型圖Fig.6 Predicted unerieuted and oriented PPIs box graphs

圖7 兩組測試集的ROC曲線Fig.7 ROC curves for two test sets

3 結(jié)束語

本文提出了一個(gè)新的網(wǎng)絡(luò)傳播的方法來預(yù)測PPIs網(wǎng)絡(luò)信號流的方向，它結(jié)合了蛋白質(zhì)語義相似性度量和重疊聚類算法。將此方法用于人類PPIs網(wǎng)絡(luò)并取得了較好的結(jié)果，這個(gè)結(jié)果將有助于進(jìn)一步研究人類PPIs網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)信息。

雖然方法的性能較好，但是仍存在一些缺陷。1) 此方法只能用于復(fù)雜的PPIs網(wǎng)絡(luò)，因?yàn)橹丿B聚類算法在簡單通路中不能正確獲得無向的PPIs；2) 源蛋白和靶蛋白來源于已知信息，不能進(jìn)行源蛋白和靶蛋白的預(yù)測；3) 需要進(jìn)一步考慮范圍在1左右的分?jǐn)?shù)對有向PPIs和無向PPIs區(qū)分的影響。