薛金嫚，安文強(qiáng)，張 茜，楊 敏，劉 鵬，郭 迎，吳曉牧

(1.北京銀豐鼎誠生物工程技術(shù)有限公司，北京 102600； 2.江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南昌 330006)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的自身免疫性疾病，導(dǎo)致髓鞘及其少突膠質(zhì)細(xì)胞的破壞，從而留下容易損傷和變性的脫髓鞘軸突，最終導(dǎo)致軸突喪失和永久性神經(jīng)功能障礙[1-3]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)與MS的臨床癥狀及病理特征相似，故常用EAE作為MS實(shí)驗(yàn)研究的動(dòng)物模型。目前MS主要使用免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制藥物治療，但藥物治療價(jià)格昂貴，且不能從根本上改善疾病進(jìn)展及患者的運(yùn)動(dòng)功能障礙[4]。

干細(xì)胞研究的進(jìn)展為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了新的策略。神經(jīng)干細(xì)胞移植及其提供的少突膠質(zhì)細(xì)胞替代和介導(dǎo)髓鞘修復(fù)的潛能越來越引起研究者關(guān)注[5]。人神經(jīng)干細(xì)胞(human neural stem cells，hNSCs)可多譜系分化為神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，具有自我更新以及多譜系分化的能力[6-7]。因此，hNSCs為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和神經(jīng)再生帶來希望[4]。近幾年，NSCs治療MS的研究正逐漸增多。目前，關(guān)于NSCs治療MS的研究主要集中在臨床前的動(dòng)物研究且NSCs供體為同種異體動(dòng)物。例如，GAO等[8]研究發(fā)現(xiàn)鼠來源的NSCs能抑制慢性EAE大鼠的腦炎癥并改善髓鞘密度。ZHANG等[9]移植誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的NSCs治療小鼠MS，顯著減少了EAE小鼠的T細(xì)胞浸潤(rùn)，改善了白質(zhì)損傷。hNSCs治療MS的研究?jī)H有國(guó)外的2項(xiàng)，且處于臨床I期的研究階段(數(shù)據(jù)來源ClinicalTrial)。然而，hNSCs治療MS動(dòng)物模型的研究較少。本研究以C57BL/6(6N)小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象構(gòu)建EAE模型，hNSCs鑒定后進(jìn)行EAE小鼠的移植治療，觀察hNSCs治療EAE的療效，以期為臨床治療MS提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

DMEM/F-12培養(yǎng)基、胰酶(TP-EDTA)均購自美國(guó)Gibco公司；抗體均購自Abcam公司；蘇木精、伊紅均購自北京中杉金橋科技有限公司；多因子試劑盒購自Biolegend公司(貨號(hào)：740446)；hNSCs系來自北京銀豐鼎誠生物工程技術(shù)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性 C57BL/6(6N) 40只，8～12周齡，體重18～20 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。在SPF級(jí)環(huán)境下進(jìn)行小鼠的培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 hNSCs的培養(yǎng)

hNSCs復(fù)蘇后計(jì)數(shù)，接種于T75培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中傳代、換液培養(yǎng)8～14 d，于倒置熒光顯微鏡中觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)[10]。錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)法計(jì)算hNSCs在第1～10天的細(xì)胞數(shù)目，然后計(jì)算hNSCs代內(nèi)增殖倍數(shù)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hNSCs干性標(biāo)志物

hNSCs處理后，對(duì)其進(jìn)行膜表面標(biāo)記、細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記和細(xì)胞核標(biāo)記染色[11]。細(xì)胞清洗、固定后，通過流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)干性標(biāo)志物CD133、vimentia、Nestin、Musashi、PAX6、SOX2的表達(dá)，于CytExpert軟件統(tǒng)計(jì)并分析陽性率。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)hNSCs分化標(biāo)志物

hNSCs處理后，接種于24孔板中培養(yǎng)并固定，對(duì)其進(jìn)行GFAP、TUJ-1及O4的免疫熒光染色，于倒置熒光顯微鏡下拍照，photoshop合成圖片后用Image-Pro Plus統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)目并計(jì)算陽性率[9]。

1.2.4 Transwell法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移能力

含hNSCs的細(xì)胞懸液加在transwell的上室中，并取hNSCs培養(yǎng)基置于下室中，小室放于24孔板中；將24孔板放置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)14、18、20 和22 h，于倒置顯微鏡下拍照，photoshop處理圖片后用Image-Pro Plus統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)目并計(jì)算遷移率[12]。

1.2.5 EAE小鼠模型的建立

選取8～12周齡雌性C57BL/6(6N)小鼠稱取體重，確認(rèn)不同小鼠個(gè)體間體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。選取30只小鼠用于建立模型，10只小鼠作為空白對(duì)照。將溶于PBS的MOG35-55肽段(每只小鼠600 μg)與完全弗式佐劑(含5 mg·mL-1結(jié)核分枝桿菌)等體積充分混勻成油包水乳劑，于小鼠脊柱背側(cè)中線兩側(cè)分4點(diǎn)皮下注射(每個(gè)部位50 μL)，并于免疫當(dāng)日和48 h后分別通過腹腔注射百日咳毒素300 ng (溶解于 300 μL PBS)，以進(jìn)行免疫誘導(dǎo)制備EAE模型。

1.2.6 hNSCs的移植及實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分3組：hNSCs治療組(NSC治療組)、模型組、空白組，每組10只小鼠。造模10 d后，以出現(xiàn)尾部遠(yuǎn)端無力作為EAE造模成功的標(biāo)準(zhǔn)，最后造模成功小鼠20只。將培養(yǎng)的hNSCs消化計(jì)數(shù)，立體定位儀定位到沿中縫向后前囟前后-0.5 mm、中縫向右中縫左右 1 mm、深度顱骨平面向下2.5 mm，于腦室注射10 μL(含2.5×105)細(xì)胞?？瞻捉M于腦室注射10 μL PBS。

1.2.7 小鼠神經(jīng)功能評(píng)分

自造模日(d0)起每日記錄實(shí)驗(yàn)小鼠體重、動(dòng)態(tài)觀察臨床體征并進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，直至細(xì)胞移植后14 d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)TOADER等[13]的5級(jí)評(píng)分法。0分，無任何臨床癥狀；1分，尾癱；2分，雙后肢無力；3分，雙后肢癱瘓；4分，雙后肢及部分前肢癱瘓；5分，完全四肢癱瘓或死亡。癥狀介于兩者之間記0.5分。

1.2.8 HE染色

細(xì)胞移植14 d后將各組小鼠處死取腦組織，取材后直接放入4%多聚甲醛中固定超過24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋并制成石蠟切片。根據(jù)步驟說明進(jìn)行HE染色[14]。于顯微鏡觀察并分析炎性細(xì)胞情況。

1.2.9 細(xì)胞因子的檢測(cè)

細(xì)胞移植14 d后，利用多因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10的水平，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行操作。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析獲得樣本中各細(xì)胞因子的水平。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Graphpad Prism5.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)、組間比較均采用t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hNSCs的形態(tài)及生長(zhǎng)變化

hNSCs培養(yǎng)8～14 d后神經(jīng)球直徑達(dá)到200 μm以上，且經(jīng)過消化后能夠穩(wěn)定傳代擴(kuò)增，其倍增時(shí)間為傳代后3～4 d。見圖1。

2.2 hNSCs干性標(biāo)志物的表達(dá)

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，hNSCs干性標(biāo)志物Musashi表達(dá)陽性率為73.49%；Nestin表達(dá)陽性率為97.87%；CD133表達(dá)陽性率為80.97%；SOX2表達(dá)陽性率為97.66%；vimentia表達(dá)陽性率為98.58%；PAX6表達(dá)陽性率為91.8%。見圖2。

圖2 hNSCs干性標(biāo)志物的表達(dá)(流式細(xì)胞術(shù))

圖2(續(xù))

2.3 hNSCs分化標(biāo)志物的表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示，神經(jīng)元標(biāo)志物TUJ-1表達(dá)的陽性率為60.8%，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP表達(dá)的陽性率為25%，少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物O4表達(dá)的陽性率為0.4%。見圖3。

2.4 hNSCs的遷移能力

Transwell結(jié)果顯示，hNSCs遷移率在14、18、20 h隨著時(shí)間增加逐漸增高，20 h遷移率高達(dá)43%。見圖4。

圖4 hNSCs細(xì)胞的遷移情況

2.5 各組體重及神經(jīng)功能的評(píng)分

如圖5所示，空白組、模型組、NSC治療組小鼠體重基本相同；模型組小鼠見尾癱并伴隨雙后肢無力現(xiàn)象，神經(jīng)功能評(píng)分為1.5，NSC治療組小鼠僅見尾癱現(xiàn)象，神經(jīng)功能評(píng)分為1。

2.6 各組的HE染色

HE染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠腦組織中見較多炎癥細(xì)胞，而經(jīng)hNSCs治療后小鼠腦組織炎癥細(xì)胞數(shù)目顯著降低。見圖6。

圖6 各組腦組織的HE染色(箭頭所示為炎癥細(xì)胞)

2.7 各組細(xì)胞因子的水平

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組血清中促炎因子IL-1β、IL-6的水平顯著升高(均P<0.05)，IL-10的水平降低(P<0.05)；與模型組比較，NSC治療組血清中促炎因子IL-1β、IL-6的水平顯著降低(均P<0.05)，IL-10的水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清細(xì)胞因子水平的比較

表1 各組血清細(xì)胞因子水平的比較

組別nIL-1βIL-6IL-10空白組3182.77±161.99140.3±97.031420.38±961.57模型組3414.83±219.70*581.82±424.54*1017.54±441.00*NSC治療組3243.68±40.55#339.47±200.42#1620.16±816.39#

*P<0.05與空白組比較；#P<0.05與模型組比較。

3 討論

MS是一種神經(jīng)退行性疾病，可導(dǎo)致脫髓鞘并伴有身體或認(rèn)知功能障礙。多灶性炎癥進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)是MS損傷的主要原因[15]。干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)的潛在作用，是治療神經(jīng)退行性疾病的一種有前途的策略。神經(jīng)干細(xì)胞可以調(diào)節(jié)趨化因子水平，導(dǎo)致免疫細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損部位遷移[16-17]，這些信號(hào)分子對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)入白質(zhì)也很重要[18]。許多動(dòng)物研究[19-23]表明用動(dòng)物源神經(jīng)干細(xì)胞治療多發(fā)性硬化是有效的，其有益作用主要由免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)機(jī)制介導(dǎo)。YANG等[24]通過靜脈注射同種異體側(cè)腦室外側(cè)壁腦室下區(qū)的NSCs和骨髓源NSCs治療EAE鼠，結(jié)果表明二者對(duì)EAE鼠具有相同的治療潛力，但側(cè)腦室外側(cè)壁腦室下區(qū)的NSCs存在倫理問題而備受爭(zhēng)議，這使骨髓源NSCs成為治療MS的更優(yōu)治療方式。但是骨髓源NSCs來源少且取材不方便，故研究者們[9,25]嘗試研究誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的NSCs對(duì)MS的可能治療作用。ZHANG等[9]利用小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞源NSCs治療EAE小鼠，結(jié)果表明經(jīng)多能干細(xì)胞源NSCs治療后小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的T細(xì)胞浸潤(rùn)大大減少，髓鞘的再形成顯著增加，運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)也提高了。MCINTYRE等[14]研究發(fā)現(xiàn)人胚胎干細(xì)胞源的NSCs移植后，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加，并促進(jìn)EAE小鼠的再髓鞘化，但是出現(xiàn)了免疫排斥反應(yīng)。臨床上hNSCs治療MS目前有2項(xiàng)研究，其目的主要為觀察其治療的安全性，但尚處于I期階段，已激活但尚未招募(數(shù)據(jù)來源clinicaltrials.gov)。故迄今有關(guān)hNSCs治療MS在臨床上的安全性研究尚未報(bào)道。

本研究通過注射MOG35-55肽段進(jìn)行小鼠EAE的誘導(dǎo)，模擬人MS的病理及行為學(xué)改變。通過對(duì)小鼠行為學(xué)評(píng)判，本研究成功建立了小鼠EAE模型。進(jìn)一步通過腦立體定位進(jìn)行hNSCs腦內(nèi)移植， 結(jié)果顯示NSC治療組、模型組和空白組3組體重基本保持不變，但是NSC治療組的神經(jīng)功能得到明顯緩解，特別是NSC治療組體重?zé)o明顯變化與TOADER等[13]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，經(jīng)hNSC治療后小鼠腦組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，同時(shí)伴隨促炎因子IL-1β、IL-6的含量降低，抗炎因子IL-10的含量增加，提示hNSCs治療對(duì)EAE具有改善作用，這為臨床治療MS提供新的思路和方法。同時(shí)，本研究采用多因子方法進(jìn)行細(xì)胞因子表達(dá)的檢測(cè)，解決了小鼠血清含量少的問題。但是，本研究?jī)H探討了hNSCs在EAE模型中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的改善作用，對(duì)軸突損傷修復(fù)及NSCs移植后體內(nèi)分化、分布、存活、遷移等情況尚未做深入研究，這些將是筆者未來研究的方向。

綜上，本研究通過體外培養(yǎng)鑒定hNSCs，并將其移植至EAE小鼠腦內(nèi)進(jìn)行定位治療，顯示hNSCs具有改善EAE小鼠神經(jīng)功能及炎癥浸潤(rùn)的作用，這為其應(yīng)用于臨床MS的治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。