柯 靚，徐菁銘，史亞楠，王蓉蕓，武 彪，徐小宏

(1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，南昌 330006； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)a.第一臨床學(xué)院，杭州 310053； b.護(hù)理學(xué)院，杭州 310053； c.附屬第一醫(yī)院乳腺科，杭州 310006)

estrogen receptor-α; progesterone receptor; Ki-67; animals,laboratory; SD rats

乳腺增生癥(MGH)多見于育齡婦女，在乳腺疾病中約占70%以上，常表現(xiàn)為乳房疼痛和乳房腫塊，異型乳腺增生與乳腺癌密切相關(guān),近年來，呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)[1]。目前臨床上尚缺乏有效的治療手段，傳統(tǒng)內(nèi)分泌治療或內(nèi)服中藥治療雖然短期內(nèi)可緩解乳房疼痛等癥狀，但療效并不確切，而且長(zhǎng)期服用易產(chǎn)生內(nèi)分泌紊亂或肝腎毒性等嚴(yán)重副作用[2]。因此，如何長(zhǎng)期有效地緩解乳房疼痛和抑制乳腺增生成為臨床亟待解決的問題。本研究采用乳腺寧貼片外敷于乳腺增生模型SD大鼠的乳房，探討乳腺寧貼片對(duì)乳腺增生癥效應(yīng)及其可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只雌性SPF級(jí)SD大鼠，體重180～200 g,7～8周齡，性成熟，購自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(SCXK(滬)2018-0006)。在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，溫度控制在20～25 ℃，濕度控制在50%～60%，光與暗環(huán)境間隔12 h循環(huán)。

1.1.2 試劑與儀器

乳腺寧貼片主要成分硫酸鹽粉末及賦形劑成品(桂林市威諾敦醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：201906131)；苯甲酸雌二醇注射液(寧波第二激素廠，批號(hào)：181214)，黃體酮注射液(寧波第二激素廠，批號(hào)：190320)，增殖細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki-67(美國Abcam 公司，批號(hào)：ab16667)，雌激素受體α抗體(ERα，美國Abcam公司,批號(hào)：ab32063)，孕激素受體抗體(PR，美國Abcam,批號(hào)：ab2765)；Nikon eclipse 80i顯微鏡(Nikon公司)，濱松數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng) NanoZoomer 2.0RS(日本濱松公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模與給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只雌性SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、乳腺增生組(M組)和乳腺寧貼片組(T組)，每組10只。M組及T組參照文獻(xiàn)[3]構(gòu)建乳腺增生模型：對(duì)2組大鼠給予連續(xù)25 d 肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇0.5 mg·kg-1·d-1，序貫5 d肌內(nèi)注射黃體酮針4 mg·kg-1·d-1。C組每日肌內(nèi)注射NS 0.5 mL·kg-1·d-1，連續(xù)25 d。給藥方法：從肌內(nèi)注射開始,T組于大鼠第2對(duì)和第3對(duì)乳頭外敷乳腺寧貼片中的膏藥3 g，C組及M組于大鼠第2對(duì)和第3對(duì)乳頭外敷等劑量賦形劑。3組大鼠每24 h換藥1次，在每次外敷后都用縛帶將大鼠的軀干部位纏繞，大鼠單籠喂養(yǎng)。

1.2.2 乳頭直徑、高度測(cè)量

干預(yù)第30天測(cè)量3組SD大鼠乳房的直徑和高度，用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量SD大鼠第2對(duì)乳頭的直徑(即測(cè)量乳頭的水平最大徑)，高度(即測(cè)量從乳頭尖到乳頭基底的距離),并觀察乳房的外觀。

1.2.3 HE染色觀察乳腺組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

干預(yù)30 d后處死各組大鼠，取下大鼠左側(cè)第2個(gè)乳頭連同周圍0.5 cm范圍的皮膚，取材深度至肌肉層上方，浸泡至10%甲醛溶液中，通過固定、包埋、切片后，進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察乳腺組織形態(tài)學(xué)變化。

判斷乳腺增生的指標(biāo)之一是乳腺的局部病理改變，可以進(jìn)行半定量檢測(cè)。腺泡的數(shù)量與導(dǎo)管腔的分泌物按分泌量分為4個(gè)級(jí)別[4]:“-”表示腔內(nèi)沒有分泌物；“+”表示乳腺導(dǎo)管腔內(nèi)有分泌物，所占面積不足導(dǎo)管腔體積的1/4；“”表示乳腺導(dǎo)管腔內(nèi)分泌物所占面積超過導(dǎo)管腔內(nèi)體積的1/4且不足導(dǎo)管腔內(nèi)體積的1/2 ；“”表示乳腺導(dǎo)管腔內(nèi)分泌物所占面積超過導(dǎo)管腔內(nèi)體積的1/2以上。根據(jù)增生程度可以將乳腺導(dǎo)管上皮增生分成4個(gè)級(jí)別 : “-”表示導(dǎo)管上皮無增生；“+”表示導(dǎo)管上皮的細(xì)胞層次為2層以上；“”表示導(dǎo)管上皮出現(xiàn)乳頭狀突起； “”表示導(dǎo)管上皮出現(xiàn)實(shí)性乳腺增生，導(dǎo)管腔內(nèi)布滿上皮細(xì)胞。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)乳腺組織ERα、PR和Ki-67蛋白表達(dá)

將SD大鼠的第2對(duì)乳頭浸泡在10%的甲醛溶液中，固定至少24 h，并在蠟包埋后切成4 μm的切片。將切片放入60 ℃的烤箱中進(jìn)行烘焙2 h，隨后將切片脫蠟至水中，用蒸餾水洗滌2 min，然后進(jìn)行高壓熱修復(fù)，用3%H2O2溶液封閉過氧化酶10 min，再經(jīng)PBS洗5 min，如此重復(fù)3遍；向切片中分別添加一抗的抗雌激素受體a抗體(1：300)、孕激素受體抗體(1：200)和Ki-67抗體(1：100)，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌5 min，重復(fù)3次；滴加二抗，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌5 min，重復(fù)3次；DAB顯色1～2 min，復(fù)染、透明后對(duì)切片進(jìn)行封片，使用Nikon eclipse 80i顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照，如若細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色的顆粒則表示為免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞表達(dá)，然后運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)算3組照片的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 乳頭直徑和高度

3組大鼠的乳頭外形均無破損，M組的乳頭豎起較堅(jiān)實(shí),乳頭直徑較C組顯著增加(P<0.01)；T組乳頭直徑較M組顯著減小(P<0.05)。M組乳頭高度較C組顯著增加(P<0.01)；T組乳頭高度較M組顯著減小(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠乳頭直徑和高度比較

2.2 乳腺組織形態(tài)學(xué)變化

C組大鼠的乳腺導(dǎo)管及管腔在光鏡下沒有明顯擴(kuò)張及分泌物，導(dǎo)管的上皮細(xì)胞呈排列規(guī)則；M組大鼠乳腺小葉的數(shù)量較C組呈明顯增多趨勢(shì)，乳腺的腺腔擴(kuò)張同時(shí)出現(xiàn)大量分泌物，導(dǎo)管的上皮細(xì)胞呈排列紊亂且增生明顯；T組大鼠的小葉數(shù)較M組呈減少趨勢(shì)，大鼠的腺泡數(shù)呈減少趨勢(shì)，乳腺的導(dǎo)管及管腔分泌呈減少趨勢(shì)。見圖1、表2。

A：C組；B：M組；C：T組。圖1 3組大鼠乳腺組織HE染色(×200)

表2 3組大鼠乳腺組織病理學(xué)變化比較

2.3 乳腺組織ERα、PR和Ki-67的表達(dá)

M組ERα、PR和Ki-67表達(dá)水平較C組均顯著增加(P<0.01)，T組ERα、PR和Ki-67表達(dá)水平較M組均顯著減小(P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 3組大鼠乳腺組織免疫組織化學(xué)表現(xiàn)

表3 3組大鼠乳腺組織ERα、PR和Ki-67表達(dá)水平比較

3 討論

乳腺增生病多見于育齡女性，是乳腺疾病中的常見病，在中醫(yī)學(xué)里是屬于“乳癖”范疇，在乳腺組織形態(tài)中常表現(xiàn)為乳腺小葉腺泡數(shù)量呈增多趨勢(shì)、導(dǎo)管上皮呈現(xiàn)過度增生、形態(tài)上發(fā)生變異、排列上發(fā)生紊亂以及復(fù)舊不全；與雌孕激素代謝紊亂、乳腺組織ERα和PR表達(dá)量增加或受體蛋白與性激素親和力增加密切相關(guān)[2]。SAMOLI等[5]研究發(fā)現(xiàn)乳腺增生時(shí)體內(nèi)雌二醇(E2)、雌酮和睪酮水平，尤其雌激素水平常高于乳房非增殖性疾病，這種激素水平升高的現(xiàn)象常常見于年齡在圍絕經(jīng)期或絕經(jīng)后階段的女性。E2絕對(duì)或相對(duì)增加能夠在一定程度上促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖并增加Ki-67表達(dá)，與此同時(shí)，E2的增加抑制了乳腺細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，從而降低了乳腺組織的自我修復(fù)能力[6]。

本研究應(yīng)用了肌內(nèi)注射苯甲酸雌二醇25 d序貫肌內(nèi)注射黃體酮5 d構(gòu)建成大鼠乳腺增生病模型，M組大鼠的乳頭高度及直徑呈顯著增加，在鏡下可以看見乳腺小葉的腺泡數(shù)量增多，乳腺導(dǎo)管與腺泡上皮細(xì)胞的排列發(fā)生紊亂，腺管腔呈現(xiàn)顯著擴(kuò)張趨勢(shì)，與此同時(shí)腺管內(nèi)的分泌物呈增多趨勢(shì)，這項(xiàng)研究中乳腺增生模型的病理特點(diǎn)與文獻(xiàn)[3]報(bào)道相符。

有研究[7]發(fā)現(xiàn)，在非病理狀態(tài)下(即正常時(shí))乳腺組織中自由基的產(chǎn)生與清除是處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的趨勢(shì)，而過氧化氫酶(CAT)可以清除在炎癥發(fā)生過程中的過氧化物自由基，從而達(dá)到強(qiáng)烈的抗炎作用，并可及時(shí)修復(fù)受損的乳腺細(xì)胞；在乳腺增生形成的過程中，腺體脂質(zhì)過氧化水平和自由基活性通常呈現(xiàn)異常升高的趨勢(shì)，而脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物是丙二醛(MDA)，其具有細(xì)胞毒性的特性，從而能夠?qū)е氯橄偌?xì)胞發(fā)生損傷，進(jìn)而導(dǎo)致導(dǎo)管上皮與纖維結(jié)締組織產(chǎn)生不同程度的增生，乳腺導(dǎo)管擴(kuò)張和囊腫形成，甚至乳腺癌；在具有特異性催化特性的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的催化作用下，呈異常升高趨勢(shì)的超氧陰離子自由基可以產(chǎn)生出H2O2和O2，H2O2再被過氧化氫酶還原形成H2O，從而導(dǎo)致乳腺間質(zhì)水腫反復(fù)發(fā)作。乳腺組織間隙水腫時(shí)細(xì)胞外滲透壓下降，促發(fā)乳腺上皮細(xì)胞低滲應(yīng)激而激活細(xì)胞ERK1/2磷酸化，在乳腺增生的發(fā)生與發(fā)展過程中，ERK1/2通路是最重要的信號(hào)通路之一， ER同時(shí)也可調(diào)控Ras/Raf/ERK信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化，致使增強(qiáng)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，而VEGF的表達(dá)與乳腺增生的程度呈正相關(guān)，而VEGF能夠?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞的增生，增強(qiáng)其滲透性[8]。

PAN等[9]報(bào)道芒硝(是一種含水的硫酸鈉礦物)外敷腹壁可預(yù)防老年性重癥胰腺炎急性腸胃道損傷，其作用機(jī)理是由于硫酸鹽粉末的晶體滲透壓比人體組織的滲透壓高，對(duì)于局部而言，外敷時(shí)組織形成一個(gè)高滲的環(huán)境，組織水可以通過滲透壓的作用從而滲出，同時(shí)加速淋巴的循環(huán)，增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的吞噬能力，進(jìn)而減少白細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而促進(jìn)炎癥因子的吸收。乳腺寧貼片主要為硫酸鹽礦石粉末加適量賦形劑制得硬膏，硫酸鹽礦石粉末是一種多硫酸鹽類，由硫酸根離子與多種金屬元素陽離子相結(jié)合而成，主要成分包括Na2SO4、CaSO4、BaSO4、KAl(SO4)2。因此，本課題組進(jìn)一步研究硫酸鹽礦石粉末外敷乳腺增生模型大鼠，觀察其療效并分析可能機(jī)制。結(jié)果表明乳腺寧貼片外敷乳腺增生模型大鼠的乳頭，可以達(dá)到降低其乳頭直徑和高度的效果，而且能夠抑制乳腺的腺泡增長(zhǎng)，抑制了導(dǎo)管上皮增生和分泌物產(chǎn)生，同時(shí)顯著降低乳腺組織中ERa、PR 和Ki-67的表達(dá)。發(fā)揮效應(yīng)可能為硫酸鹽粉末外敷乳頭增加了局部滲透壓，通過皮膚滲透性作用，調(diào)節(jié)乳腺腺體間和上皮細(xì)胞的滲透壓，加速局部乳腺間質(zhì)間水腫的消退，減輕滲透應(yīng)激，改變細(xì)胞的形態(tài)和血管脆性，減輕乳房疼痛和緩解乳腺增生。由于腫瘤放化療常致嚴(yán)重的毒副作用，近年來通過滲透壓等物理手段調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化以及抑制腫瘤生長(zhǎng)成為研究熱點(diǎn)[10]。

本研究創(chuàng)新性通過硫酸鹽礦石粉末外敷乳腺等物理手段有效緩解乳腺增生，避免長(zhǎng)期服用他莫昔芬所致的內(nèi)分泌紊亂，同時(shí)也避免靜脈輸注或經(jīng)胃腸道用藥，不僅用藥安全而且價(jià)廉使用方便。