韓文素 王澤如 劉宇 高景林 趙冬香 鐘義海 趙珊

摘 ?要：為明確市售昆蟲病原線蟲制劑對蜂巢小甲蟲（Aethina tumida）幼蟲和蛹的致病力，為該害蟲的防治提供新的技術(shù)措施，室內(nèi)采用浸漬法、土壤法測定了5種不同品系昆蟲病原線蟲對蜂巢小甲蟲末齡老熟幼蟲和蛹的致病力，采用土壤法測定了小卷蛾斯氏線蟲（Steinernema carpocapsae All）不同施用時間、不同施用劑量對蜂巢小甲蟲幼蟲致病力的影響。浸漬法生物測定結(jié)果表明，5種不同品系昆蟲病原線蟲對蜂巢小甲蟲幼蟲的致病力差異很大，其中小卷蛾斯氏線蟲All侵染4 d、12 d后，蜂巢小甲蟲幼蟲的校正死亡率分別為67.50%±0.05%和72.36%±3.14%，均顯著高于其他品系。土壤法生物測定結(jié)果表明，昆蟲病原線蟲對蜂巢小甲蟲幼蟲具有明顯的致死作用，其中小卷蛾斯氏線蟲All對蜂巢小甲蟲幼蟲的侵染效果達(dá)100%，顯著高于其他線蟲品系。蜂巢小甲蟲幼蟲入土后，按不同時間順序施用小卷蛾斯氏線蟲All，結(jié)果表明14 d前施用均能取得良好的防治效果。侵染期線蟲小卷蛾斯氏線蟲All與蜂巢小甲蟲幼蟲數(shù)量之比大于213∶1時，防治效果最佳。因此小卷蛾斯氏線蟲All具有防治蜂巢小甲蟲的潛力，可在發(fā)生蜂巢小甲蟲危害的蜂場推薦使用。

關(guān)鍵詞：昆蟲病原線蟲;小卷蛾斯氏線蟲;蜂巢小甲蟲;致病力;生物測定

中圖分類號：S476.15;S895 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： This study aims to evaluate the pathogenicity of commercially available entomopathogenic nematodes against Aethina tumida larvae and pupa， thus develop a new agricultural method to control A. tumida beetle. The pathogenicity of 5 strains of entomopathogenic nematodes （EPNs） against wandering larvae and pupae of A. tumida were determined by the dipping and sand bioassays in the laboratory， respectively. In addition， the influence of different application time and dosage on the virulence of Steinernema carpocapsae All to A. tumida larvae was tested by sand bioassays under laboratory condition. The dipping bioassay results showed that the pathogenicity of 5 EPNs strains against A. tumida larvae was different under laboratory condition. The infection incubation of S. carpocapsae All against A. tumida larvae was the highest. The corrected mortality rate of A. tumida larvae infected by S. carpocapsae All were 67.50%±0.05% and 2.36%±3.14% after 4 d and 12 d， respectively， which was higher than that of other EPNs. The sand bioassay result demonstrated a significant treatment effect on A. tumida mortality when compared to the control. The S. carpocapsae All provided excellent control with 100% mortality of A. tumida larvae being obtained， which showed significantly higher mortality than A. tumida larvae exposed to any other nematode strains. Sequential applications of the nematodes following larvae entering sand also provided excellent control before 14 d application. The optimal control effect would be achieved when the ratio of S. carpocapsae All to A. tumida was more than 213∶1. So entomopathogenic nematodes S. carpocapsae All has a potential to control A. tumida larvae and pupae， it could be recommended for use in apiary where A. tumida occurred.

Keywords： entomopathogenic nematodes; Steinernema carpocapsae; Aethina tumida; pathogenicity; bioassay

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.028

蜂巢小甲蟲（Aethina tumida Murray）屬鞘翅目露尾甲科，也譯為蜂箱小甲蟲，是源于撒哈拉以南非洲地區(qū)土著蜜蜂和其他社會性蜂群的一種寄生蟲和食腐動物[1]。在當(dāng)?shù)?，它們危害性極小。但是蜂巢小甲蟲入侵美國和澳大利亞后，給當(dāng)?shù)仞B(yǎng)蜂業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]，被認(rèn)為是造成蜂群崩潰失調(diào)?。╟olony collapse disorder）的因素之一[4]。當(dāng)前蜂巢小甲蟲分布于除南極洲以外的所有大陸[5-8]。據(jù)報(bào)道，2017年我國廣東省汕尾新田鎮(zhèn)蜂群首次發(fā)現(xiàn)蜂巢小甲蟲的危害[9]，2018年在海南省昌江縣、白沙縣、瓊中縣蜂場發(fā)現(xiàn)危害，造成當(dāng)?shù)胤淙簱p毀[10]，因此對于蜂巢小甲蟲的防治刻不容緩。

蜂巢小甲蟲成蟲在蜂巢內(nèi)產(chǎn)卵，卵孵化為幼蟲后取食蜂箱內(nèi)的蜂蜜、花粉、蜜蜂幼蟲，常常破壞掉整個蜂巢，發(fā)育到老熟階段（wandering larvae），便離開蜂巢到附近的土壤里化蛹[8]。蛹期的發(fā)育時間可根據(jù)外界的環(huán)境溫度而發(fā)生變化，如在溫度為20～30 ℃的范圍內(nèi)，蜂巢小甲蟲在土壤內(nèi)的時間為18～84 d[11]。蜂巢小甲蟲在低溫條件下發(fā)育緩慢[12]。老熟幼蟲和蛹均藏身于土壤內(nèi)，此階段是防治蜂巢小甲蟲切斷其生活史的最好時機(jī)。據(jù)報(bào)道，國外的蜂農(nóng)使用殺蟲劑如芐氯菊酯（permethrin）控制土壤里蜂巢小甲蟲幼蟲和蛹[13]，但長期使用殺蟲劑易使害蟲產(chǎn)生抗藥性，同時對蜜蜂等昆蟲和人類健康會造成危害。因此篩選安全、高效、可持續(xù)性的防治方法對蜂巢小甲蟲的防控是非常重要的。

昆蟲病原線蟲（entomopathogenic nematodes， EPNs）是一類專門寄生昆蟲的有益線蟲，是20世紀(jì)初發(fā)展起來的很有潛能的生物防治因子，不污染環(huán)境，對人畜等脊椎動物安全。用于農(nóng)林害蟲防治的昆蟲寄生線蟲主要分布于斯氏屬（Steinernema）和異小桿屬（Heterorhabditis）。侵染期線蟲利用昆蟲體表的自然開口（肛門、氣門）、節(jié)間膜或傷口侵入寄主體內(nèi)，穿過腸壁或氣管壁進(jìn)入寄主血腔，釋放攜帶的共生細(xì)菌，共生細(xì)菌在害蟲的體腔內(nèi)迅速繁殖，分泌殺蟲毒素蛋白抑制寄主免疫反應(yīng)，從而致使寄主死亡[14-16]。EPNs可以在侵染的寄主體內(nèi)循環(huán)繁殖，直至線蟲密度大和營養(yǎng)匱乏時重新回到土壤中尋找新的寄主，因此EPNs可在土壤中存活很長時間[17]。EPNs能主動搜索寄主，對地下害蟲特效[18]，但昆蟲病原線蟲對地下害蟲的防治效果受線蟲種類和品系及害蟲種類的影響[19]。國外已有利用昆蟲病原線蟲防治蜂巢小甲蟲的報(bào)道[20-21]，但不同品系對蜂巢小甲蟲的防治效果差異很大。我國昆蟲病原線蟲資源豐富，有很多品系已經(jīng)商品化，海南氣候獨(dú)特，非常有必要篩選益于當(dāng)?shù)厥褂玫木€蟲品系。因此本研究室內(nèi)測定了已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的小卷蛾斯氏線蟲（Steinernema carpocapsae All）等5種不同品系昆蟲病原線蟲對蜂巢小甲蟲的侵染力，以期為制定蜂巢小甲蟲有效的防治措施提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

蜂巢小甲蟲（Aethina tumida）：2019年5月23日，在海南省瓊中縣中華蜜蜂養(yǎng)蜂場中采集的蜂巢小甲蟲幼蟲，帶回中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所蜜蜂與傳粉昆蟲實(shí)驗(yàn)室的隔離養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)方法參照Neumann等[22]的方法，蜂巢小甲蟲成蟲用蜂蜜飼喂，幼蟲用蜂糧（含蜂蜜、花粉、蛋白質(zhì)）飼喂。飼養(yǎng)條件為：溫度28 ℃，相對濕度80%，未成熟幼蟲，黑暗無光照約2周;老熟即將化蛹的幼蟲，自然光照14 h，持續(xù)1周，以便老熟幼蟲離開食物入土化蛹，隨后無光持續(xù)約20 d;蛹羽化為成蟲出土后，取食，交配，產(chǎn)卵，自然光照14 h。選擇發(fā)育整齊的末齡幼蟲（wandering larvae）備用。

供試線蟲：小卷蛾斯氏線蟲（S. carpocapsae All，簡稱All）、長尾斯氏線蟲（S. Longicaudum X-7，簡稱X-7）、芫菁夜蛾斯氏線蟲（S. Feltiae SF-SN，簡稱SN）有2種劑型，粉劑由濰坊宏潤農(nóng)業(yè)科技有限公司提供;芫菁夜蛾斯氏線蟲（S. Feltiae JY-90，簡稱JY-90）和All、X-7、SN海綿吸附劑型由浙江綠神天敵生物技術(shù)有限公司提供。印度異小桿線蟲（Heterorhabditis indian LN2，簡稱LN2）劑型為海綿吸附劑型，由浙江綠神天敵生物技術(shù)有限公司提供。試驗(yàn)前將線蟲置于8 ℃冰箱冷藏備用。

1.2 ?方法

1.2.1 ?不同昆蟲病原線蟲直接暴露和間接暴露對蜂巢小甲蟲的致病力測定 ?試驗(yàn)1：直接暴露—浸漬法。參照Cuthbertson等[20]的方法，略有改動。具體步驟如下：將粉劑或海綿吸附劑線蟲用蒸餾水溶解，并用解剖顯微鏡評估1 mL線蟲懸浮液中存活的線蟲數(shù)量。然后根據(jù)廠家推薦，配置約10 000 IJs/mL的線蟲懸浮液（感染期蟲態(tài)infective juveniles，IJS），將單個蜂巢小甲蟲末齡老熟幼蟲浸入到含線蟲的懸浮液中，輕輕晃動2～3 s，將試蟲取出放于含有蒸餾水浸濕的濾紙上，并置于直徑6 cm的培養(yǎng)皿中。每個處理設(shè)置10次重復(fù)，每個重復(fù)10頭供試幼蟲，以不含線蟲的蒸餾水設(shè)為對照，將各處理放入溫度為28 ℃，相對濕度為70%，光照為16L∶8D的暗室中。在處理后4 d、12 d記錄幼蟲的死亡情況。判斷試蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)：用毛筆尖輕觸蟲體，5 s內(nèi)蟲體不動即視為死亡。同時將死亡幼蟲浸入1%氯化鉀溶液，在超景深三維顯微系統(tǒng)（基恩士，KEYENCE）下進(jìn)行觀察并拍照，確認(rèn)昆蟲病原線蟲的侵染情況。

試驗(yàn)2：間接暴露—土壤法。將蜂場帶回的沙質(zhì)土壤在烘箱內(nèi)烘干，裝入7 cm×15 cm（直徑×高）的塑料杯，每杯裝500 g。配置10 000 IJs/mL的各品系線蟲懸浮液，將50 mL懸浮液均勻倒進(jìn)塑料杯的土壤表面（土壤濕度10%），待溶液滲透到土壤中，即放入蜂巢小甲蟲末齡老熟幼蟲10頭。待幼蟲完全鉆入土壤，用封口膜（扎孔）封住塑料杯，放于試驗(yàn)1相同的環(huán)境中。1個品系為1個處理，每個處理10杯（即每個處理10次重復(fù)），每杯10頭幼蟲，以蒸餾水為對照。為了滿足蜂巢小甲蟲羽化為成蟲的時間，各處理將持續(xù)存放6周。4周后每天觀察蜂巢小甲蟲成蟲的羽化情況并記錄。將沒有羽化為成蟲的數(shù)量視為死亡數(shù)量，以此計(jì)算死亡率。

1.2.2 ?昆蟲病原線蟲不同施用時間對土壤內(nèi)蜂巢小甲蟲的致病力測定 ?選用1.2.1中高致病力線蟲品系為研究對象，測定其不同施用時間對土壤內(nèi)蜂巢小甲蟲幼蟲或蛹的致病力。線蟲濃度和塑料杯大小同1.2.1。同一時間將10頭末齡老熟幼蟲放入裝有土壤的塑料杯內(nèi)，杯內(nèi)加適量水，待幼蟲完全鉆入土壤內(nèi)，用封口膜封住杯口，放于與1.2.1相同的試驗(yàn)環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4個處理時間，每個處理時間間隔1周，每個處理設(shè)10次重復(fù)（10杯），同一時間以蒸餾水處理為對照。末齡老熟幼蟲入土24 h后首次將配置好的昆蟲病原線蟲懸浮液40 mL均勻倒入塑料杯內(nèi)土壤。從幼蟲入土?xí)r間算起，每處理4周后每天觀察成蟲出土情況，記錄羽化成蟲數(shù)量。每處理持續(xù)存放6周，將沒有羽化為成蟲的數(shù)量視為死亡數(shù)量，以此計(jì)算死亡率。

1.2.3 ?線蟲不同劑量對土壤內(nèi)蜂巢小甲蟲致病力的測定 ?選用1.2.1中高致病力昆蟲病原線蟲，測定其不同劑量對蜂巢小甲蟲末齡老熟幼蟲的致病力。用蒸餾水將昆蟲病原線蟲稀釋為0、425、850、1700、3500、5000、10 000 IJs/mL的懸浮液。在5 cm×7.5 cm（直徑×高）的塑料杯內(nèi)裝入濕度約8%的土壤（高溫烘干）150 g，然后放入8頭末齡老熟幼蟲。每杯加入1 mL線蟲懸浮液，相當(dāng)于每個處理的線蟲劑量為0、53、106、213、438、625、1250 IJs/頭甲蟲幼蟲。實(shí)驗(yàn)設(shè)6個濃度，每個濃度為1個處理，每個處理重復(fù)5次（5杯）。每隔4～5 d塑料杯內(nèi)加適量水，以保持合適的土壤濕度。4周后每天觀察記錄蜂巢小甲蟲成蟲羽化情況。將未羽化的數(shù)量視為死亡數(shù)量，以此計(jì)算死亡率。其他試驗(yàn)條件同1.2.1。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

利用SPSS Base Ver. 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析不同處理之間的差異顯著性，采用Tukeys HSD test進(jìn)行多重比較，采用獨(dú)立樣本t檢測進(jìn)行兩組間的差異比較，采用GraphPad Prism 5軟件制圖。試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用以下公式計(jì)算：

死亡率=死亡蟲數(shù)/供試總蟲數(shù)×100%。

校正死亡率=[（處理死亡率-對照死亡率）/（1-對照死亡率）]×100%。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同品系昆蟲病原線蟲對蜂巢小甲蟲致病力的影響

不同品系昆蟲病原線蟲直接暴露對蜂巢小甲蟲末齡老熟幼蟲的致病力如圖1所示。小卷蛾斯氏線蟲All海綿吸附劑侵染蜂巢小甲蟲幼蟲4 d和12 d后，蜂巢小甲蟲幼蟲的校正死亡率分別為72.00%±0.05%和78.00%±4.67%，小卷蛾斯氏線蟲All粉劑侵染蜂巢小甲蟲幼蟲4 d和12 d后，蜂巢小甲蟲幼蟲的校正死亡率分別為67.50%± 0.05%和72.36%±3.14%。小卷蛾斯氏線蟲All 2種劑型間差異不顯著性，而均顯著高于對照和其他線蟲品系（4 d： df=6， 63， F=123.145， P<0.001; 12 d： df=6， 63， F=151.628， P<0.001）。將蜂巢小甲蟲幼蟲浸于1%氯化鉀溶液內(nèi)，超景深三維顯微鏡下可觀察到小卷蛾斯氏線蟲All存在于蜂巢小甲蟲幼蟲的體腔、脂肪等組織內(nèi)（圖2）。顯微鏡下還可觀察到存活的小卷蛾斯氏線蟲All主動從蜂巢小甲蟲幼蟲游向1%氯化鉀溶液。因此證實(shí)小卷蛾斯氏線蟲All即使短暫接觸蜂巢小甲蟲幼蟲2～3 s也具備侵染能力。芫菁夜蛾斯氏線蟲SN、長尾斯氏線蟲X-7、芫菁夜蛾斯氏線蟲JY-90和印度異小桿線蟲LN2侵染造成蜂巢小甲蟲幼蟲的校正死亡率僅為0%～（8.00±2.91）%，與對照間差異不顯著，尤其是芫菁夜蛾斯氏線蟲JY-90幾乎不能侵染蜂巢小甲蟲幼蟲。因此這幾種線蟲短暫暴露不具備侵染蜂巢小甲蟲幼蟲的潛力。

通過土壤法測定不同品系昆蟲病原線蟲對蜂All：小卷蛾斯氏線蟲All海綿吸附劑;All（P）：小卷蛾斯氏線蟲All粉劑;SN（P）：芫菁夜蛾斯氏線蟲SN粉劑;X-7（P）：長尾斯氏線蟲X-7粉劑;JY-90：芫菁夜蛾斯氏線蟲JY-90海綿吸附劑;LN2：印度異小桿線蟲LN2海綿吸附劑。

巢小甲蟲末齡老熟幼蟲的致病力如圖3所示。此方法可以更好地模擬蜂農(nóng)防治蜂場土壤內(nèi)蜂巢小甲蟲末齡老熟幼蟲或蛹的狀況。不同品系昆蟲病原線蟲施入土壤6周后，蜂巢小甲蟲幼蟲的校正死亡率均顯著高于對照（df=6， 63， F=47.713， P<0.001）。小卷蛾斯氏線蟲All 2種劑型對蜂巢小甲蟲幼蟲的侵染效果幾乎達(dá)到100%，顯著高于其他線蟲品系，2種劑型間差異不顯著。在處理后2周，顯微鏡下可以觀察到塑料杯封口膜扎孔處有聚集的昆蟲病原線蟲。芫菁夜蛾斯氏線蟲SN、長尾斯氏線蟲X-7、芫菁夜蛾斯氏線蟲JY-90和印度異小桿線蟲LN2處理土壤后6周，蜂巢小甲蟲幼蟲的校正死亡率達(dá)（62.83±6.93）%～（78.61± 5.66）%。

2.2 ?小卷蛾斯氏線蟲All不同施用時間對蜂巢小甲蟲致病力的影響

小卷蛾斯氏線蟲All粉劑不同施用時間對土壤內(nèi)蜂巢小甲蟲幼蟲或蛹均具有良好的防效，處理組的蜂巢小甲蟲校正死亡率顯著高于對照組（P<0.001）。幼蟲入土1、7 d后施用小卷蛾斯氏線蟲All，無蜂巢小甲蟲成蟲羽化，蜂巢小甲蟲幼蟲校正死亡率達(dá)100%;幼蟲入土14、21 d后，此時已在土壤內(nèi)化蛹，施用小卷蛾斯氏線蟲All，蜂巢小甲蟲蛹的校正死亡率分別為99.00%±1%、52.72%±5.74%（圖4）。

2.3 ?小卷蛾斯氏線蟲All不同劑量對蜂巢小甲蟲致病力的影響

蜂巢小甲蟲幼蟲死亡率隨線蟲劑量的增加而顯著升高（df=6， 28， F=73.867， P<0.001）（圖5）。當(dāng)線蟲與蜂巢小甲蟲幼蟲的數(shù)量比為53∶1和106∶1時，蜂巢小甲蟲幼蟲的死亡率分別為55.00%±6.37%和62.50%±3.95%;而線蟲與蜂巢小甲蟲幼蟲的數(shù)量比超過625∶1時，蜂∶巢小甲蟲幼蟲全部死亡，未出現(xiàn)羽化的成蟲。因此，利用小卷蛾斯氏線蟲All防治土壤中蜂巢小甲蟲幼蟲的推薦濃度為≥3500 IJs/mL。

試驗(yàn)線蟲為小卷蛾斯氏線蟲All粉劑;不同小寫字母表示處理間差異顯著（Tukeys HSD檢測，P<0.05）。

3 ?討論

昆蟲病原線蟲喜潮濕隱蔽環(huán)境，適于防治土棲害蟲[23]，但不同品系昆蟲病原線蟲對同一害蟲的防治效果不同[24]。蜂巢小甲蟲是近兩年入侵我國的蜂群害蟲，急需有效的綠色防控手段。國內(nèi)商業(yè)化生產(chǎn)的小卷蛾斯氏線蟲All、長尾斯氏線蟲X-7、芫菁夜蛾斯氏線蟲SN/ JY-90、印度異小桿線蟲LN2可有效防治小地老虎（Agrotis ypsilon）、韭菜遲眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga）、暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela）、黃曲條跳甲（Phyllotreta striolata）等農(nóng)業(yè)害蟲[19， 25-27]，而國內(nèi)利用昆蟲病原線蟲對蜂巢小甲蟲的防治研究尚無報(bào)道。本研究結(jié)果表明，5種不同品系昆蟲病原線蟲對蜂巢小甲蟲幼蟲的侵染力差別很大，其中小卷蛾斯氏線蟲All的致病力最高。此研究結(jié)果與Cuthbertson等[20]的研究結(jié)果相似，其使用的小卷蛾斯氏線蟲品系S. carpocapsae （Capsanem）對蜂巢小甲蟲的致死率高于S. kraussei和S. feltiae品系;而Ellis等[21]篩選了7個種、10個品系昆蟲病原線蟲對蜂巢小甲蟲幼蟲的致病力，結(jié)果表明S. riobrave和H. indica對蜂巢小甲蟲幼蟲的致病力最高。據(jù)Ebssa等[28]報(bào)道，昆蟲病原線蟲的致病力受昆蟲病原線蟲種類、寄主齡期和評估時間的影響。一般而言，增加昆蟲病原線蟲的數(shù)量和延長暴露時間均能提高不同齡期寄主的死亡率。本研究供試的蜂巢小甲蟲幼蟲均為即將化蛹的老熟幼蟲，直接暴露相同濃度的昆蟲病原線蟲2～3 s，僅小卷蛾斯氏線蟲All成功附著蜂巢小甲蟲幼蟲體表并進(jìn)入其體內(nèi)，使67.50%～78.00%的幼蟲死亡;間接暴露相同濃度的昆蟲病原線蟲6周，5種昆蟲病原線蟲侵染蜂巢小甲蟲幼蟲使其死亡率達(dá)62.83%～100.00%，均顯著高于對照，因此本研究表明延長暴露時間會不同程度地提高昆蟲病原線蟲的致病力。

寄主蛹期是昆蟲病原線蟲最不敏感的階段。已有研究表明，小卷蛾斯氏線蟲S. carpocapsae 1、S. carpocapsae All對小地老虎的蛹無侵染能力[25]，S. carpocapsae有些品系對小地老虎的侵染致死率不及50%[28]。蜂巢小甲蟲在土壤里的化蛹階段是對其進(jìn)行防治的最佳時期，此階段蜂巢小甲蟲離開蜂箱，不會對蜜蜂產(chǎn)生負(fù)面影響。本研究結(jié)果表明，小卷蛾斯氏線蟲All能有效防控蜂巢小甲蟲蛹，在蜂巢小甲蟲幼蟲入土14 d和21 d后（已化蛹），施用小卷蛾斯氏線蟲All后蜂巢小甲蟲死亡率分別達(dá)99.00%±1%和100.00%。Ellis等[21]研究表明，蜂巢小甲蟲蛹對昆蟲病原線蟲敏感，線蟲S. riobrave 7-12和H. indica品系對蜂巢小甲蟲蛹的致死率大于76%。已知侵染期線蟲刺入寄主并在其體內(nèi)取食/繁殖約14 d后，新的侵染期線蟲從寄主體內(nèi)爬出開始尋找新的寄主[29]，因此可利用線蟲持續(xù)防控不斷入土化蛹的蜂巢小甲蟲老熟幼蟲和蛹。

昆蟲病原線蟲的施用劑量是影響防治效果的一個重要因素。一般而言，提高線蟲的施用劑量會提高寄主的死亡率，但也會增加使用成本。本研究結(jié)果表明，小卷蛾斯氏線蟲All與蜂巢小甲蟲幼蟲的數(shù)量比超過213∶1時，其侵染力無顯著性差異，致使約100%的蜂巢小甲蟲幼蟲死亡。因小卷蛾斯氏線蟲對滲透壓、干燥、低溫、缺氧、高溫和紫外線輻射有較強(qiáng)的耐受性，國內(nèi)生產(chǎn)廠家可以采用體外培養(yǎng)體系批量生產(chǎn)[30]。結(jié)合復(fù)雜的蜂場環(huán)境以及本研究結(jié)果，按廠家的推薦劑量（10 000 IJs/mL）施用可以有效防治土壤中的蜂巢小甲蟲。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，劑型影響線蟲存活的保質(zhì)期。本研究中侵染蜂巢小甲蟲的優(yōu)勢線蟲小卷蛾斯氏線蟲All粉劑和海綿吸附劑2種劑型，均在冰箱冷藏1周，試驗(yàn)前解剖顯微鏡下觀察到線蟲存活狀況較為一致。直接暴露（浸漬法）和間接暴露（土壤法）測定結(jié)果表明，2種劑型對蜂巢小甲蟲的防治效果無顯著性差異，因此生產(chǎn)實(shí)踐中均可使用。

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