李文秀 賀軍軍 張華林 羅萍

摘 ?要：早期快速鑒定橡膠樹F1雜交子代，獲取真雜種對(duì)橡膠樹優(yōu)良品系的創(chuàng)育和遺傳學(xué)研究具有重要的意義。以橡膠樹優(yōu)良品系‘PR107和‘93-114進(jìn)行雜交，獲得雜交組合子代，以親本作為模板從104對(duì)SSR引物中篩選出3對(duì)多態(tài)性引物對(duì)35株雜交子代進(jìn)行真實(shí)性鑒定，結(jié)果表明：35株雜交子代均鑒定為真雜種苗;篩選出的3對(duì)多態(tài)性引物都具有較高的雜種鑒定率，并驗(yàn)證了1對(duì)引物鑒定真?zhèn)坞s種的可靠性，后續(xù)可作為橡膠樹雜交子代真實(shí)性鑒定的理想SSR分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：橡膠樹;SSR分子標(biāo)記;雜種鑒定;雜交育種

中圖分類號(hào)：S794.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Early and rapid identification of F1 hybrid progeny of Hevea brasiliensis and acquisition of true hybrids are of great significance to the creation and genetic research of H. brasiliensis. In this paper， ‘PR107 and ‘93-114 were used to hybridize， and three pairs of polymorphic complementary primers were selected from 104 pairs of SSR primers. The results showed that all 35 hybrid progenies were identified as true hybrid seedlings. All the three pairs of polymor-phic primers screened had high heterosis identification rate， and the reliability of the identification of genuine and false hybrids was verified by one pair of primers， which could be used as ideal SSR molecular markers for the authenticity identification of rubber tree hybrids later.

Keywords： Hevea brasiliensis; SSR molecular marker; hybrid identification; hybrid breeding

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.015

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產(chǎn)于巴西亞馬遜流域，為多年生大戟科（Euphobiaceae）落葉喬木。橡膠樹產(chǎn)生的乳狀汁液是可再生的天然橡膠，具有良好的絕緣性、耐磨性和可塑性，是重要的工業(yè)原料，在軍工、化工、醫(yī)療等行業(yè)用途十分廣泛，對(duì)國民經(jīng)濟(jì)具有重要的意義。在橡膠樹育種實(shí)踐中，一個(gè)優(yōu)良品種的選出一般須經(jīng)過有性雜交，有性雜交是通過雌雄授粉相交而結(jié)成種子來繁殖后代的方法，橡膠樹有性繁殖一般有兩種方法：人工授粉和自然雜交[1]。橡膠樹為常異花授粉作物[2]，天然雜交率在4%～50%之間，自交不衰退且其有性生殖的后代會(huì)發(fā)生遺傳變異，性狀會(huì)發(fā)生分離，在雜交F1代即可進(jìn)行篩選重組優(yōu)良個(gè)體。同時(shí)，由于橡膠樹基因型高度雜合，雜交育種實(shí)踐中，選擇實(shí)生后代的工作量大，非生產(chǎn)期和育種周期長，加上橡膠樹有性繁殖過程中容易因自交、串粉、機(jī)械混雜等因素造成真假雜種混雜，使橡膠樹育種工作效益降低。所以，對(duì)橡膠樹雜交F1子代進(jìn)行早期快速鑒定，對(duì)橡膠樹雜交育種工作的開展和優(yōu)良品系的創(chuàng)育具有重要的意義。

F1雜種真假鑒定的方法有形態(tài)標(biāo)記鑒定、生化標(biāo)記鑒定、細(xì)胞標(biāo)記鑒定和分子標(biāo)記鑒定等[3]，其中，分子標(biāo)記鑒定不受時(shí)空影響，具有快速、準(zhǔn)確和方便等優(yōu)點(diǎn)[4]。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物育種的各個(gè)方面，特別是SSR標(biāo)記（simple sequence repeats，簡單重復(fù)序列），相比于AFLP、RAPD和RFLP等標(biāo)記，其在單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上就可做共顯性的等位基因分析[5]，重復(fù)性高、可靠性強(qiáng)、多樣性豐富，被廣泛應(yīng)用于植物雜種后代的鑒定，如在水稻[6]、大豆[7]、沙田柚[8]、蘋果[5]等多種作物品種純度鑒定中得到應(yīng)用。在橡膠樹上，早期品種鑒定的方法是選擇正常生長的營養(yǎng)器官及花、果、種子等外部形態(tài)特征進(jìn)行甄別[1]，但由于橡膠樹遺傳基礎(chǔ)狹窄，形態(tài)學(xué)鑒定方法易受主觀因素影響，存在天然的弊端;如今隨著分子技術(shù)快速發(fā)展，分子標(biāo)記也開始應(yīng)用于橡膠樹無性系的鑒定，如Low等[9]和Besse等[10]利用RFLP標(biāo)記指紋圖譜對(duì)橡膠樹品種進(jìn)行鑒定，Saha等[11]利用4個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記逐一區(qū)分了27個(gè)無性系品種，謝黎黎等[12]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了中國87個(gè)橡膠樹無性系的DNA指紋圖譜，但利用SSR分子標(biāo)記鑒定橡膠樹雜種F1子代的真?zhèn)涡圆⑽匆妶?bào)道。因此，本研究以橡膠樹品種‘93-114為母本，品種‘PR107為父本，授粉雜交獲得的F1雜交子代為材料，通過篩選獲得特異SSR標(biāo)記，并鑒定雜交子代的真?zhèn)?，為橡膠樹雜交育種的早期鑒定提供簡單、快捷的方法。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站收集保存的‘PR107（父本）和‘93-114（母本）的后代群體資源，共35份材料，于2016年建立親本和后代群體的初級(jí)系比試驗(yàn)區(qū)，試驗(yàn)區(qū)分為3個(gè)小區(qū)，每小區(qū)按照株行距為3 m×3 m隨機(jī)種植親本和子代群體，每份資源相鄰種植3株，共3次重復(fù)，從每份材料中隨機(jī)挑選1株，共35株單株作為試驗(yàn)材料。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA提取 ?參考安澤偉等[13]的方法對(duì)橡膠樹基因組葉片DNA進(jìn)行提取。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度與濃度，原液于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?引物篩選 ?SSR引物：104對(duì)SSR引物中，24對(duì)來自Souza等[14]，4對(duì)來自Saha等[11]，5對(duì)來自謝黎黎等[12]，71對(duì)來自Gouvêa等[15]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，每對(duì)引物都進(jìn)行重復(fù)擴(kuò)增。利用母本‘93-114和父本‘PR107作為DNA模板對(duì)合成的104對(duì)引物進(jìn)行篩選。

1.2.3 ?引物鑒定真?zhèn)坞s種可靠性驗(yàn)證 ?挑選3個(gè)非‘PR107（父本）和‘93-114（母本）來源的橡膠樹品種作為對(duì)照，驗(yàn)證引物鑒定真?zhèn)蔚目煽啃浴?/p>

1.2.4 ?SSR-PCR體系 ?PCR擴(kuò)增反應(yīng)在TaKaRa TP-600 PCR儀上進(jìn)行。采用10 ?L反應(yīng)體系：DNA模板1 ?L，ddH2O 4 ?L，4 ?L mix（2×Taq DNA Polymerase，2×PCR Buffer，2×dNTP），上游引物和下游引物各0.5 ?L。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，復(fù)性30 s（溫度以引物最適退火溫度而定），72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。

1.2.5 ?PAGE凝膠電泳及檢測(cè) ?采用6%聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電壓180 V，電流80 A，時(shí)間為60～90 min。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?橡膠樹雜交子代的獲得

以橡膠樹品種‘93-114為母本，品種‘PR107為父本，授粉雜交獲得F1雜交子代。通過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1雜交子代葉片表型差異較大，如葉色、葉緣波浪、葉柄等都發(fā)生了較大的變異（圖1）。本研究所用的親本‘93-114和‘PR107表型性狀大部分類似，同時(shí)，這些雜交子代在表型上與親本存在著較大的差異。因此，無法用形態(tài)學(xué)鑒定的方法進(jìn)行鑒定，需開展更深入的分子方面的鑒定。

2.2 ?橡膠樹真假雜種子代鑒定引物的篩選

以橡膠樹品種母本‘93-114和父本‘PR107作為DNA模板對(duì)合成的104對(duì)引物進(jìn)行篩選，引物多態(tài)性頻率為31.73%，合適的條帶多態(tài)性引物僅有3對(duì)。根據(jù)電泳條帶呈現(xiàn)的結(jié)果，104對(duì)引物中沒有擴(kuò)增明顯條帶的有9對(duì);61對(duì)引物在父母本能擴(kuò)增出相同大小的條帶，沒有多態(tài)性;有多態(tài)性引物對(duì)數(shù)為33對(duì)，多態(tài)性頻率為31.73%，經(jīng)過多次重復(fù)，最終確定了在雙親中均有多態(tài)性的引物IAC-HV06、IAC-HV10和IAC-HV33用于雜交子代的鑒定，引物序列見表1，結(jié)果見圖2。從圖2可見，3對(duì)引物都為共顯性標(biāo)記，在親本間的條帶差異較大，是比較理想的真?zhèn)坞s種鑒定引物。

2.3 ?橡膠樹雜交子代的分子鑒定

引物IAC-HV06對(duì)35個(gè)雜交子代單株的鑒定結(jié)果顯示（圖3A），所有單株材料都具有雙親帶型。從引物IAC-HV10的鑒定結(jié)果可以看出（圖3B），25號(hào)沒有擴(kuò)增結(jié)果，其他檢測(cè)材料都帶有父本特征帶型。引物IAC-HV33檢測(cè)結(jié)果顯示（圖3C），材料2、3、9、10、25、32、33、34號(hào)被鑒定為母本帶型，其余27個(gè)材料單株都具有雙親帶型。

比較3對(duì)引物鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，35株單株被鑒定為真雜種苗，真雜種率為100%。一般認(rèn)為，同時(shí)具有母本和父本特異性條帶的雜合型個(gè)體才為真雜種。但種子收獲自母本時(shí)，只要具有父本的特征帶即可認(rèn)定為真雜種[16]。另外，橡膠樹是基因型高度雜合的植物，親本為雜合體;在減數(shù)分裂形成配子的過程中，標(biāo)記位點(diǎn)的DNA區(qū)域可能會(huì)由于同源染色體間的交換而導(dǎo)致擴(kuò)增位點(diǎn)改變，從而使得母本或父本的標(biāo)記條帶在子代中消失。所以不能指望僅用1對(duì)引物來單獨(dú)鑒定后代真?zhèn)?，?yīng)是同時(shí)用多對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)，只有多對(duì)引物檢測(cè)不出父本帶型的才可能是偽雜種。從本研究中可以發(fā)現(xiàn)引物IAC-HV06可以一次性將所有雜交子代鑒定出來，都為真雜種，鑒定效率達(dá)到100%;引物IAC-HV10可將34株材料鑒定為真雜種，鑒定率為97.14%;在引物IAC-HV33擴(kuò)增結(jié)果中看出，8份材料為母本帶型，其余27株材料都具有雙親雜合帶型，可確認(rèn)為真雜種，鑒定率為77.14%。3對(duì)引物都具有較高的真雜種鑒定率，后續(xù)可作為橡膠樹雜交子代真實(shí)性鑒定的理想SSR標(biāo)記。

2.4 ?引物鑒定真?zhèn)坞s種可靠性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證引物鑒定真?zhèn)坞s交子代的可靠性，挑選鑒定率最低的引物IAC-HV33，以非‘PR107（父本）和‘93-114（母本）來源的橡膠樹品種作為對(duì)照，進(jìn)行引物可靠性驗(yàn)證。從圖4可見，‘PR107（父本）和‘93-114（母本）來源的雜交子代能擴(kuò)增出父本的條帶，為真雜種;而非‘PR107（父本）和‘93-114（母本）來源的材料1～3號(hào)沒有擴(kuò)增出父本帶型，可能為偽雜種，說明引物IAC-HV33鑒定真假雜種較為可靠。

3 ?討論

開展橡膠樹雜交子代早期鑒定，獲得真實(shí)的雜種是開展雜交育種及其他遺傳學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。雜交育種是創(chuàng)育橡膠樹優(yōu)良品系的一個(gè)常規(guī)方法，是培育橡膠樹新品種的重要途徑[1]，由于橡膠樹為多年生木本植物，非生產(chǎn)期長，有必要開展橡膠樹雜交子代早期的鑒定工作，剔除假雜種，提高育種效率。同時(shí)，加上橡膠樹本身雜合性高，生產(chǎn)雜交子代中容易受機(jī)械混雜或自花授粉的影響，從種質(zhì)資源的角度看，應(yīng)用分子標(biāo)記對(duì)雜交種進(jìn)行早期的鑒定，有利于材料質(zhì)量的保證和種質(zhì)資源的充分利用。另外，早期快速鑒定出橡膠樹雜交真雜種，也能為指紋圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等分子標(biāo)記輔助育種工作提供有益的參考。

鑒別橡膠樹F1雜種真假，傳統(tǒng)的方法是根據(jù)形態(tài)的差異進(jìn)行識(shí)別，由于橡膠樹遺傳基礎(chǔ)狹窄，表型差異不大且不好分辨，傳統(tǒng)辨識(shí)方法已不能滿足人們的需求，隨著技術(shù)的發(fā)展，鑒別F1雜種真?zhèn)螌?huì)有更多便捷、可靠的方法。目前大多數(shù)真假雜種鑒定方法是利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定，SSR分子標(biāo)記具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于不同作物[17-19]的雜種鑒定。鑒定的過程首先是篩選親本多態(tài)性SSR引物，同時(shí)該引物在雜種后代中表現(xiàn)為多態(tài)互補(bǔ)性引物時(shí)，可進(jìn)行雜種后代的鑒定。由于SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，相比于AFLP和RAPD分子標(biāo)記，具有簡單、效率高等優(yōu)勢(shì)，且在理論上1對(duì)引物即可完成鑒定。但SSR分子標(biāo)記在實(shí)際操作中利用1對(duì)引物鑒定雜種真假有可能存在誤差，如本文利用SSR引物對(duì)F1雜種進(jìn)行鑒定，出現(xiàn)不同引物鑒定同一樣品出現(xiàn)不同鑒定結(jié)果[20]，其原因Powell等[21]和Gianfranceschi等[22]指出是利用SSR標(biāo)記檢測(cè)基因高度雜合的個(gè)體時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)啞等位基因，導(dǎo)致無法表現(xiàn)共顯性;或者是雙親特異性條帶消失，出現(xiàn)特異性條帶等現(xiàn)象，其原因可能是橡膠樹親本為雜合體，在減數(shù)分裂過程中，標(biāo)記位點(diǎn)的DNA區(qū)域可能會(huì)由于同源染色體間的交換而導(dǎo)致擴(kuò)增位點(diǎn)改變，從而使得母本或父本的標(biāo)記條帶在子代中消失。所以在應(yīng)用SSR標(biāo)記進(jìn)行鑒定真?zhèn)蔚倪^程中，不能僅用1對(duì)引物單獨(dú)鑒定后代真?zhèn)危瑧?yīng)是同時(shí)用多對(duì)引物進(jìn)行檢測(cè)，如本研究利用3對(duì)多態(tài)且互補(bǔ)的引物同時(shí)對(duì)35株雜交后代進(jìn)行鑒定，其結(jié)果才更加真實(shí)可靠。

本研究中，橡膠樹品種‘PR107是初生代無性系，具有優(yōu)良的抗性耐性特征描述，以‘PR107為親本，先后選育出的品種有‘熱研7-33-97‘云研77‘大豐95等;品種‘93-114是原華南熱帶作物科學(xué)研究院粵西試驗(yàn)站于1967年從無性系‘天任31-45和‘合口3-11雜交子代中選育的次生代無性系，抗寒力強(qiáng)，抗風(fēng)能力好，通過有性雜交期望篩選具備雙親優(yōu)良性狀的品種資源?？购透弋a(chǎn)一直以來都是我國橡膠樹選育種的重要方向，選擇抗寒的親本和高產(chǎn)的親本進(jìn)行有性雜交過程中工作量大，且容易出現(xiàn)雜株，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)在苗期進(jìn)行早期快速鑒定，有利于提高育種效率，同時(shí)通過鑒定得到的真實(shí)雜種為后期開展分子標(biāo)記輔助育種和遺傳圖譜的構(gòu)建提供材料支持。因此，本研究通過篩選多態(tài)性引物，鑒定橡膠樹品種‘PR107和‘93-114的雜種子代真實(shí)性，可為今后開展重要性狀的QTL定位以及橡膠樹真假雜種鑒定提供參考。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)