齊蘭 王世正 黃麗云 周煥起 劉立云

摘 ?要：檳榔是海南重要的熱帶特色經(jīng)濟(jì)作物，具有很高的藥用價(jià)值，被列為“四大南藥”之首。但其基礎(chǔ)研究落后，缺乏對(duì)種質(zhì)資源的系統(tǒng)研究，遺傳多樣性尚不明確。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)海南島58份栽培檳榔資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在明確檳榔栽培種的親緣關(guān)系，為檳榔雜交育種、功能基因的挖掘提供理論依據(jù)。結(jié)果表明：從500對(duì)SSR引物中篩選出32對(duì)多態(tài)性好、條帶清晰的引物，在58份種質(zhì)資源中共檢測(cè)到79個(gè)等位基因，每個(gè)SSR位點(diǎn)2～5個(gè)，平均2.4688個(gè)，其中有效等位變異占觀測(cè)等位變異的58.92%。各引物PIC值變幅為0.0169～0.5969，平均值為0.2254，Shannon信息指數(shù)（I）為0.0496～1.2552，平均值為0.4496;Neis遺傳多樣性指數(shù)（Nei）變幅為0.0171～0.6492，平均值為0.2596，說(shuō)明所選SSR引物在供試樣品中檢測(cè)等位基因遺傳多樣性偏低。利用UPGMA構(gòu)建58份栽培檳榔的遺傳聚類樹(shù)狀圖，第V組材料遺傳多樣性最豐富，其他分組群體遺傳多樣性較低，聚類結(jié)果說(shuō)明海南栽培檳榔品種無(wú)明顯的區(qū)域劃分，表明海南檳榔不同地區(qū)間的種苗交流頻繁，總體遺傳多樣性水平較低，該研究為檳榔遺傳育種親本選擇提供依據(jù)，也為今后引進(jìn)種質(zhì)增補(bǔ)差異資源提供參考。

關(guān)鍵詞：檳榔;SSR標(biāo)記;聚類分析;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S792.91 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Arecanut （Areca catechu L.） is an important tropical economic and social importance plant in Hainan Prov-ince. It has high medicinal value and is listed as the first of the four south China medicinal plants. Areca is mostly planted in underdeveloped areas， and the basic research is weak. The germplasm diversity of areca from Hainan remains unclear due to lack of systemic research of germplasm. We analyzed the genetic diversity among 58 arecanut accessions from Hainan by SSR molecular marker technology to clarify the genetic relationship and provide a theoretical basis for the hybrid breeding and functional gene mining. The results showed that 32 primers with high polymorphism and clear bands were screened out from 500 SSR primers. A total of 79 alleles were detected from the 58 arecanut germplasm resources， and there were 2-5 loci per SSR， with an average of 2.4688 alleles at each marker， and the number of effective allele was accounted for 58.92% of the observed one. The range of PIC was 0.0169-0.5969， with an average of 0.2254. The Shannon index （I） of all primers ranged from 0.0496 to 1.2552， with an average of 0.4496. Neis genetic diversity index （Nei） was ranged from 0.0171 to 0.6492， with an average of 0.2596. The genetic diversity of alleles detected by SSR primers was low. UPGMA Cluster analysis showed that the genetic diversity of group V was the richest. Genetic analysis showed that the 58 arecanut were separated from the effect of regional isolation. The conclusion of frequent exchanges among different regions of arecanut in Hainan and lower genetic diversity in Hainan cultivars would provide theoretical guidance for the selection of parents in the genetic breeding of arecanut， while reference for collecting germplasm to supplement different resources in the future.

Keywords： arecanut; SSR markers; clustering analysis; genetic diversity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.014

檳榔（Areca catechu L.）是棕櫚科檳榔屬多年生常綠植物，原產(chǎn)于馬來(lái)西亞，我國(guó)主要栽培于海南、云南以及臺(tái)灣等地，其中海南產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)的99%（未計(jì)臺(tái)灣省）[1]。檳榔是海南重要的熱帶特色經(jīng)濟(jì)作物，具有很高的藥用價(jià)值，被列為“四大南藥”（檳榔、砂仁、益智、巴戟）之首。含有多種人體所需的營(yíng)養(yǎng)元素和有益物質(zhì)，檳榔原果的主要成分為酚類、多糖、脂肪、粗纖維和生物堿，檳榔種子總生物堿含量達(dá)0.3%～ 0.6%，主要為檳榔堿，并含有少量檳榔次堿，是驅(qū)蟲(chóng)的有效成分，還具有消積導(dǎo)滯、行氣利水、降血壓的功能[2-3]。

我國(guó)檳榔栽培歷史悠久，尤其是在海南，形成了一些各具特色的地方品種，不同類型的檳榔在產(chǎn)量、品質(zhì)、果實(shí)形狀等方面存在很大差異[4]，但是檳榔種質(zhì)資源基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱，對(duì)種質(zhì)資源的多樣性缺乏系統(tǒng)的比較和研究，存在種質(zhì)混雜，同名異物或者同物異名等情況[1]。隨著檳榔產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，農(nóng)戶在引種時(shí)偏向于栽培商品喜好型品種，栽培品種單一，一些特有種質(zhì)正在逐步消失，遺傳基礎(chǔ)可能存在逐年變窄的趨勢(shì)。種質(zhì)資源的收集、保存和鑒定評(píng)價(jià)對(duì)作物新品種選育具有重要作用，種質(zhì)資源遺傳多樣性是檳榔遺傳育種的基礎(chǔ)和前提，因此，對(duì)來(lái)源于不同生態(tài)區(qū)域的檳榔種質(zhì)資源開(kāi)展系統(tǒng)遺傳多樣性研究，對(duì)檳榔種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和創(chuàng)新利用具有重要意義。

DNA分子標(biāo)記目前廣泛應(yīng)用于作物種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，其中SSR標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性豐富、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于水稻[5]、小麥[6]、甘薯[7]、綠豆[8]、新麥草[9]等大田作物及牧草，以及椰子[10-11]、油棕[12]等棕櫚科植物的遺傳多樣性評(píng)價(jià)研究。我國(guó)檳榔種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究較少，任軍方[13]利用ISSR標(biāo)記對(duì)海南保亭的檳榔栽培居群進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示海南保亭的檳榔多樣性水平較低。

本研究調(diào)查收集海南不同地區(qū)、不同果形的58份栽培檳榔資源，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行海南栽培檳榔遺傳多樣性研究，明確目前海南栽培檳榔的遺傳基礎(chǔ)，闡明不同材料間的親緣關(guān)系，為我國(guó)檳榔種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)、遺傳育種與改良奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試驗(yàn)材料共58份，來(lái)自海南省各市縣栽培檳榔園，選取檳榔樹(shù)株型、果型中有差異的作為試驗(yàn)樣品，其中P74為從臺(tái)灣引進(jìn)的檳榔種質(zhì)資源，栽培在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所檳榔種質(zhì)資源圃，資源圃內(nèi)編號(hào)為P74，其余樣品編號(hào)規(guī)則：按照各市縣在海南省的地理位置分為：西部地區(qū)（X）、中部地區(qū)（Z）、南部地區(qū)（N）、北部地區(qū)（B）、東部地區(qū)（D），加上樣品采集地市縣名稱拼音首字母縮寫，樣品基本信息見(jiàn)表1。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA的提取 ?采集檳榔成齡植株葉片，裝入自封袋，置于放冰袋的泡沫盒帶回實(shí)驗(yàn)室。葉片剪碎后，放入研缽加液氮磨樣，采用植物基因組DNA快速提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取葉片基因組DNA，風(fēng)干后，加入100 μL TE緩沖液溶解。吸取1 μL DNA原液，利用NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA質(zhì)量和濃度，工作液濃度稀釋至20 ng/μL，DNA原液和工作液儲(chǔ)存于?20 ℃冰箱備用。

1.2.2 ?引物篩選 ?利用12份地理來(lái)源不同，形態(tài)差異較大的材料進(jìn)行引物篩選，從500多對(duì)SSR引物序列中篩選特異性好，條帶清晰的引物32對(duì)，用于海南栽培檳榔品種基因型檢測(cè)（表2）。本研究用到的SSR引物是利用‘熱研一號(hào)檳榔品種的葉片、雌花和果實(shí)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)的SSR引物，引物序列由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所楊耀東博士提供，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 ?PCR反應(yīng)和產(chǎn)物檢測(cè) ?SSR分子標(biāo)記試驗(yàn)PCR反應(yīng)體系參考齊蘭等[14]的方法，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，33個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，最后設(shè)置4 ℃保存。用已經(jīng)篩選出的多態(tài)性高且穩(wěn)定性好的SSR引物進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染顯色，條帶清晰后在膠片觀察燈上進(jìn)行拍照。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

對(duì)照Marker（D 2000）的分子量大小根據(jù)條帶有無(wú)來(lái)記錄跑膠結(jié)果，將SSR引物擴(kuò)增出的DNA片段按照從大到小的順序依次排列，相同大小的分子量遷移處，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，缺失數(shù)據(jù)記為“9”，建立0-1形式的二進(jìn)制數(shù)字矩陣，通過(guò)DataFormater軟件將0-1數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成Popgen、Powermarker等軟件所需的數(shù)據(jù)模式[15]。

采用Popgene 1.32軟件[16]計(jì)算檳榔種質(zhì)資源的觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、期望雜合度（He）和觀測(cè)雜合度（Ho）、Shannons信息指數(shù)（I）和Neis遺傳多樣性指數(shù)（Nei）等遺傳參數(shù)。并計(jì)算分組群體間的遺傳多樣性和遺傳距離;利用Powermarker V3.25軟件[17]計(jì)算每對(duì)引物的多態(tài)性信息含量（polymorphic information content， PIC）;采用Ntsys 2.11軟件[18]，利用Clustering的SAHN程序中的非加權(quán)類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，通過(guò)Tree-plot程序生成遺傳聚類圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

檳榔DNA提取原液通過(guò)微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，各檢測(cè)樣品DNA濃度范圍為610～1053 ng/μL，OD260/280比值介于1.8～2.0之間，說(shuō)明提取樣品DNA的純度高，滿足SSR-PCR擴(kuò)增要求。

利用篩選的32對(duì)SSR引物，對(duì)58份檳榔種質(zhì)資源進(jìn)行基因型檢測(cè)，結(jié)果顯示，32對(duì)引物共檢測(cè)到79個(gè)等位基因，每個(gè)SSR位點(diǎn)2～5個(gè)，平均2.4688個(gè)，其中有效等位變異占觀測(cè)等位變異的58.92%。觀測(cè)雜合度（Ho）變幅為0.0000～ 0.7586，平均值為0.1886，說(shuō)明所檢測(cè)等位基因位點(diǎn)雜合度稍低;期望雜合度（He）變幅為0.0172～0.6549，平均值為0.2618，PIC值變幅為0.0169～0.5969，平均值為0.2254，中度及以上多態(tài)性信息位點(diǎn)（PIC>0.25）有13個(gè)。Shannons信息指數(shù)（I）的范圍為0.0496～1.2552，平均為0.4496;Neis遺傳多樣性指數(shù)（Nei）變幅為0.0171～0.6492，平均值為0.2596，說(shuō)明SSR引物在供試樣品中檢測(cè)等位基因遺傳多樣性偏低（表3）。

2.2 ?不同檳榔種質(zhì)資源遺傳聚類分析

利用SSR標(biāo)記檢測(cè)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建親緣關(guān)系聚類圖（圖1）。從聚類分析樹(shù)狀圖可以看出，遺傳相似系數(shù)矩陣（GS）變化范圍為0.63～0.94。在遺傳相似系數(shù)為0.70處可以將海南栽培檳榔與臺(tái)灣種檳榔區(qū)分開(kāi)。在遺傳相似系數(shù)0.82處（圖1中參考線所示），根據(jù)離散程度，將供試樣本分為5個(gè)組，其中第I組劃分為2個(gè)亞組，I-1和I-2組，將未聚類在一起的與其他樣品親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的4份材料劃為第Ⅴ組，分別是來(lái)自中部瓊中、五指山，北部定安以及1份臺(tái)灣種質(zhì)。

第I組分為2個(gè)亞組，I-1組主要包括中部、北部和東部的材料，其中還有3份來(lái)自南部陵水的材料。亞組I-2組的材料來(lái)源相對(duì)分散，大多數(shù)是來(lái)自西部和中部地區(qū)的樣本，該組的材料來(lái)源相對(duì)復(fù)雜，占供試材料的2/3，基本覆蓋了海南島各地的樣品。其中有幾份來(lái)自不同地區(qū)的樣本

遺傳距離很接近，遺傳相似系數(shù)達(dá)到0.95，推測(cè)這些材料可能來(lái)自相同的親本，說(shuō)明海南栽培檳榔在不同地區(qū)的種苗交流很頻繁。第Ⅱ組和第Ⅲ組包含的材料相對(duì)分散，無(wú)明顯的區(qū)域性劃分，第IV組的3份材料來(lái)自南部的陵水和樂(lè)東。第V組的材料1份來(lái)自臺(tái)灣，另外3份與其他海南本地種資源遺傳差異較大，這4份材料各自成為1個(gè)分支，推測(cè)可能是早期從周邊東南亞國(guó)家引進(jìn)的種質(zhì)。

2.3 ?基于SSR標(biāo)記的檳榔分組群體遺傳多樣性與遺傳距離

根據(jù)SSR標(biāo)記基礎(chǔ)上的遺傳聚類結(jié)果，將58份海南栽培檳榔種質(zhì)資源分為5組，由于第I組

成員較多，明顯分為2個(gè)亞組，因此按照6個(gè)分組，即I-1、I-2、Ⅱ、Ⅲ、IV和V組，利用Popgene 1.32軟件分析檳榔種質(zhì)分組群體內(nèi)的遺傳多樣性參數(shù)（表4）。對(duì)分組群體SSR標(biāo)記多態(tài)性分析結(jié)果顯示，第V組的觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）最高（2.2188），最低為第IV組（1.5312）;有效等位基因數(shù)（Ne）最高為第V組（1.8001），最低為第Ⅱ組（1.2909）;Shannons指數(shù)（I）最高的是第V組（0.6106），最低為第Ⅱ組（0.2753）;Neis遺傳多樣性指數(shù)（Nei）最高為第V組（0.3828），最低為第Ⅱ組（0.1704）;觀測(cè)雜合度（Ho）和期望雜合度（He）分別為0.1328～0.3047和0.1818～0.4375，均為第V組最高。結(jié)果表明，第V組的遺傳多樣性最豐富，其他幾組遺傳多樣性參數(shù)值稍低，說(shuō)明海南本地栽培檳榔群體遺傳多樣性水平偏低。

利用Popgene 1.32軟件計(jì)算6個(gè)分組群體間的遺傳一致度和遺傳距離，群體I-1和I-2組間的遺傳距離最?。?.0192），遺傳一致性系數(shù)最大（0.9810）;群體IV和群體V的遺傳距離最大（0.1423），遺傳一致性系數(shù)最小（0.8673）;總體來(lái)講不同分組群體的遺傳距離差異不大（表5），表明海南檳榔不同分組群體遺傳差異較小，需要引進(jìn)國(guó)外種質(zhì)資源以拓寬其遺傳基礎(chǔ)。遺傳一致度和遺傳距離分別是從相同和相反方面度量群體間遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近，遺傳距離系數(shù)大，相應(yīng)的遺傳一致性系數(shù)小，材料間的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn);因此開(kāi)展雜交育種時(shí)建議選擇親緣關(guān)系遠(yuǎn)的組合，更有利于產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)。

3 ?討論

檳榔是熱帶亞熱帶地區(qū)一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，栽培地區(qū)多為不發(fā)達(dá)地區(qū)，基礎(chǔ)研究薄弱。印度是最早對(duì)檳榔開(kāi)展系統(tǒng)性研究的國(guó)家，自1957年開(kāi)始先后從中國(guó)等世界各地收集檳榔種質(zhì)，已經(jīng)達(dá)到117份，保存在印度的維塔檳榔實(shí)驗(yàn)站[19]。國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展檳榔種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析研究，劉慧娟[20]利用10對(duì)RAPD標(biāo)記對(duì)海南20個(gè)檳榔主要種植縣市的74份樣品進(jìn)行聚類分析，在遺傳相似系數(shù)為0.78左右檳榔群體被分為2組，第1組包括印度、柬埔寨樣品，還有部分中國(guó)云南與海南的樣品等，第2組樣品包括來(lái)自中國(guó)云南和海南樣品，說(shuō)明海南栽培檳榔與周邊東南亞國(guó)家存在種苗交換現(xiàn)象。任軍方[13]利用ISSR標(biāo)記對(duì)海南保亭的檳榔居群進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示保亭檳榔12個(gè)居群總的遺傳多樣性Neis指數(shù)為0.2878，表明海南保亭檳榔的多樣性水平比較低，可能是由于采樣區(qū)域太小。臺(tái)灣學(xué)者Hu等[21]開(kāi)發(fā)了9對(duì)SSR引物，對(duì)臺(tái)灣屏東縣的36份檳榔材料進(jìn)行了群體遺傳分析，預(yù)期雜合度和觀測(cè)雜合度分別為0.71～0.94和0.00～0.88。Sankaran等[22]利用11對(duì)RAPD標(biāo)記對(duì)10份印度檳榔種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，PIC值范圍為0.17～0.60，UPGMA聚類分析顯示野生種檳榔與栽培種檳榔遺傳差異大。印度農(nóng)作物研究中心（Central Plantation Crops Research Institute， CPCRI）的Bharath等[23]利用RAPD標(biāo)記對(duì)60份檳榔種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，遺傳相似系數(shù)介于0.68～0.93之間，印度本地收集材料聚類在一起，其他國(guó)家收集資源聚類在一起，聚類分析結(jié)果與地理來(lái)源有顯著相關(guān)性。RAPD標(biāo)記技術(shù)的一個(gè)缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，反應(yīng)條件的變化常常導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果帶形的變化，結(jié)果可靠性較低[20]。而SSR標(biāo)記具有重復(fù)性高，可靠性強(qiáng)且品種間多態(tài)性豐富等特點(diǎn)。Ramaswamy等[24]利用檳榔葉片開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在檳榔基因組上鑒定到6853個(gè)含SSR位點(diǎn)的區(qū)域，可開(kāi)發(fā)更多的SSR標(biāo)記用于檳榔種質(zhì)資源研究。

本研究篩選了32對(duì)多態(tài)性SSR引物，在58份栽培檳榔材料中共檢測(cè)到79個(gè)等位基因，每個(gè)SSR位點(diǎn)2～5個(gè)，平均2.4688個(gè)。PIC值變幅為0.0169～0.5969，平均值為0.2254。Shannons信息指數(shù)（I）范圍為0.0496～1.2552，平均為0.4496;Neis遺傳多樣性指數(shù)平均值為0.2596，說(shuō)明本研究所用SSR引物在供試樣品中檢測(cè)等位基因遺傳多樣性偏低，需要更多的SSR標(biāo)記來(lái)評(píng)估更多的遺傳資源。

根據(jù)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行UPGMA遺傳聚類分析，從聚類分析圖可以看出，遺傳相似系數(shù)矩陣（GS）變化范圍為0.63～0.94。在遺傳相似系數(shù)為0.70處可以將海南栽培檳榔與臺(tái)灣檳榔種區(qū)分開(kāi)，表明海南本地檳榔與臺(tái)灣檳榔種的遺傳差異較大。第V組的材料1份來(lái)自臺(tái)灣，另外3份與其他海南本地種資源遺傳距離較遠(yuǎn)，該組的Shannons信息指數(shù)和Neis遺傳多樣性指數(shù)均為最高，表明該組樣品間遺傳差異較大。海南在20世紀(jì)90年代引種過(guò)東南亞部分國(guó)家或地區(qū)的檳榔品種，后期由于果實(shí)品質(zhì)不能滿足市場(chǎng)需求，在海南的種植面積越來(lái)越少，本次采集的這3份檳榔材料是否為從國(guó)外引種遺留下來(lái)的資源有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。遺傳分析結(jié)果顯示海南栽培檳榔無(wú)明顯的地域聚類，說(shuō)明海南島檳榔栽培種苗交流比較頻繁，且海南栽培檳榔遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，其原因可能是農(nóng)民選種時(shí)喜歡商品性較好的品種，主栽優(yōu)良品種由于長(zhǎng)時(shí)間的人工馴化、不同地區(qū)間資源共享，導(dǎo)致遺傳多樣性水平降低。因此，在今后的育種工作中應(yīng)積極引進(jìn)國(guó)內(nèi)外的檳榔種質(zhì)資源以拓寬其遺傳背景。本研究明確了海南栽培檳榔品種的遺傳多樣性差異，為檳榔種質(zhì)資源保存利用及遺傳育種、改良、育種親本選擇提供理論指導(dǎo)，也為檳榔種質(zhì)資源保護(hù)和今后引進(jìn)種質(zhì)增補(bǔ)差異資源提供參考。

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