宋春艷，馬思佳 綜述，錢(qián)明 審校

吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春130021

每年由于各種疾病、意外等可造成大量人體組織和器官損傷，3D生物打印是將細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和生物材料結(jié)合在一起，制造出模仿自然組織特征的生物醫(yī)學(xué)部件，有望為人體組織和器官損傷的治療提供新途徑。3D生物打印作為組織工程的手段之一，已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)生物制造技術(shù)如冷凍干燥、靜電紡絲、氣體發(fā)泡等［1］，盡管可制備出三維的生物構(gòu)建體，但其內(nèi)部結(jié)構(gòu)及精確性難以控制。組織器官的相關(guān)生理活動(dòng)和功能主要取決于其微觀結(jié)構(gòu)，如腎臟的毛細(xì)血管、心臟的心肌纖維［2］，都與其各自功能密切相關(guān)。與傳統(tǒng)制造技術(shù)不同，3D生物打印在宏觀和微觀上均可以達(dá)到對(duì)結(jié)構(gòu)個(gè)性化的精確控制［3］，該技術(shù)以計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)／計(jì)算機(jī)輔助制造為基礎(chǔ)，將細(xì)胞和生物材料等構(gòu)建成具有高度復(fù)雜層次的組織器官［4］，在控制細(xì)胞分布方面有較大優(yōu)勢(shì)，但目前該技術(shù)仍處于發(fā)展階段，較多方面仍不成熟，如機(jī)械強(qiáng)度、流變性能、生物相容性等［5］，其中，細(xì)胞活力及生物學(xué)行為是3D生物打印技術(shù)的關(guān)鍵之一，也是評(píng)價(jià)3D生物打印成功的重要指標(biāo)。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者為改善并增強(qiáng)細(xì)胞活力和生物學(xué)行為進(jìn)行了大量研究，并取得了一些進(jìn)展。本文就3D生物打印中細(xì)胞活力的影響因素及提高和改善其活力的方法作一綜述。

1 細(xì)胞活力的影響因素

動(dòng)物細(xì)胞的體外存活對(duì)周?chē)h(huán)境要求較高，首先要求無(wú)菌、無(wú)毒，其次需要具有充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、脂肪、維生素等，還需具備適宜溫度、pH、滲透壓及一定濃度的O2和CO2。在3D生物打印的特殊條件下，細(xì)胞的活力還受其他多種因素的共同影響。

1.1 生物墨水特性 生物墨水是3D生物打印的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，主要由細(xì)胞和生物活性材料組成。理想的生物墨水應(yīng)具備一定的物理、化學(xué)、生物學(xué)特性，可為細(xì)胞提供合適的微環(huán)境，支持細(xì)胞的各種活動(dòng)。細(xì)胞種類(lèi)對(duì)細(xì)胞活力可產(chǎn)生較大影響，不同種類(lèi)的細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境的敏感性也不同。干細(xì)胞由于具有無(wú)限增殖和分化潛力成為生物打印的優(yōu)良選擇，但與成熟體細(xì)胞相比，干細(xì)胞對(duì)惡劣環(huán)境的反應(yīng)更強(qiáng)，不易存活［2］。另外，細(xì)胞含量也可影響細(xì)胞活力，高細(xì)胞密度可降低剪切應(yīng)力，并改變墨水的流變性能，影響?zhàn)ざ龋瑥亩黾蛹?xì)胞活力［6］。

水凝膠是充滿水分的三維網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，可模仿細(xì)胞外基質(zhì)，常作為裝載細(xì)胞的生物活性材料。水凝膠的種類(lèi)、濃度、黏度、剛度、交聯(lián)劑的類(lèi)型、交聯(lián)程度等［6］均會(huì)影響細(xì)胞的活力。不同種類(lèi)的水凝膠生物相容性不同，與人工合成的水凝膠比較，天然水凝膠的生物相容性更好，細(xì)胞活力更高。KOCH等［7］研究了藻酸鹽、膠原蛋白、纖維蛋白、透明質(zhì)酸等多種水凝膠對(duì)細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)基于透明質(zhì)酸的水凝膠的細(xì)胞生存狀態(tài)最佳。ZHANG等［8］和PARK等［9］分別研究了藻酸鹽濃度和成分對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，低濃度（0.8%，w／v）更有利于保持細(xì)胞活力和形態(tài)，且當(dāng)藻酸鹽高低分子量比例為2∶1時(shí)，最有利于細(xì)胞的增殖和分化。低濃度、低黏度、低剛度及低交聯(lián)的水凝膠由于其具有疏松多孔的特性，更有利于氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝廢物的擴(kuò)散及細(xì)胞的遷移，因此細(xì)胞活力更佳。另外，不同類(lèi)型的交聯(lián)劑毒性有所差異，3D生物打印多選擇低毒甚至無(wú)毒的交聯(lián)劑，毒性過(guò)大，如甲醇和戊二醛，不適用于3D生物打?。?0］。

1.2 打印方法及參數(shù) 有研究顯示，細(xì)胞活力與剪切應(yīng)力密切相關(guān)，二者成指數(shù)關(guān)系，高剪切應(yīng)力可引起細(xì)胞變形，甚至破壞細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致低細(xì)胞活力［11］。不同打印方法產(chǎn)生的剪切應(yīng)力不同，細(xì)胞活力也存在較大差異。擠壓式3D生物打印由于剪切應(yīng)力更大，細(xì)胞活力僅為40%~80%；噴墨式和激光輔助3D生物打印細(xì)胞活力分別高于85%和95%［10］。

對(duì)于同一種打印方法，打印參數(shù)也對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生顯著影響。噴嘴直徑、形狀、噴射速度、分配壓力、暴露時(shí)間均可通過(guò)剪切應(yīng)力影響細(xì)胞活力及打印結(jié)構(gòu)，如大小、孔徑、形狀、孔隙率等，可通過(guò)物質(zhì)交換來(lái)影響細(xì)胞的生存和生物學(xué)行為。小直徑噴嘴可增加打印體的精確度，但會(huì)增加對(duì)細(xì)胞的剪切應(yīng)力和擠壓應(yīng)力，從而削弱細(xì)胞活力［12］。研究顯示，不同形狀噴嘴產(chǎn)生的應(yīng)力也不同，與圓柱形噴嘴比較，錐形噴嘴具有平滑的收縮形狀，所產(chǎn)生的應(yīng)力更小，對(duì)細(xì)胞的損傷也更低［13］。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，低噴射速度、低分配壓力、低暴露時(shí)間及能量激光更有利于細(xì)胞的存活［11］。由于氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的擴(kuò)散距離有限，因此高孔隙率、相互貫通通道、合適的孔徑、形狀更有利于物質(zhì)交換，而多孔結(jié)構(gòu)還有利于血管形成，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

2 改善細(xì)胞活力的方法

2.1 優(yōu)化生物墨水 近年國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，目前單一種類(lèi)的水凝膠存在各自的局限性，因此常將不同種類(lèi)水凝膠復(fù)合制備成復(fù)合水凝膠。另有多位學(xué)者通過(guò)改善水凝膠特性或開(kāi)發(fā)新型水凝膠來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞活力，主要有以下幾種方式：優(yōu)化交聯(lián)過(guò)程、添加抗氧化劑、添加生物活性因子等。

2.1.1 優(yōu)化交聯(lián)過(guò)程 通過(guò)3D生物打印構(gòu)建組織器官時(shí)，要求生物墨水能迅速?gòu)囊后w狀態(tài)轉(zhuǎn)化為凝膠狀態(tài)，才能維持生物打印體的長(zhǎng)期穩(wěn)定，這主要是通過(guò)物理或化學(xué)交聯(lián)實(shí)現(xiàn)的［14］。目前的交聯(lián)劑類(lèi)型和密度在一定程度上均會(huì)影響細(xì)胞活性，因此研究者嘗試各種方法設(shè)計(jì)和優(yōu)化交聯(lián)過(guò)程。DUBBIN等［15］以藻酸鹽和重組基因工程蛋白為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了雙組分雙交聯(lián)水凝膠，克服了細(xì)胞沉降、細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞脫水的挑戰(zhàn)，最終顯著提高了細(xì)胞活力。PATTA等［16］構(gòu)建了雙重交聯(lián)的透明質(zhì)酸生物墨水，酶促反應(yīng)交聯(lián)適合加載細(xì)胞，可見(jiàn)光交聯(lián)可保持打印結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，可獲得14 d的細(xì)胞活力。另外，與小分子交聯(lián)劑比較，聚合物交聯(lián)劑，尤其是支鏈交聯(lián)劑，可允許通過(guò)更高密度的交聯(lián)基團(tuán)，多官能支化聚合物不僅參與交聯(lián)，還可與其他官能團(tuán)結(jié)合提高細(xì)胞活性。RUTZ等［17］利用聚乙二醇交聯(lián)劑在提高支架機(jī)械性能的同時(shí)，改變了生物墨水的性能，可保持1個(gè)月以上的高細(xì)胞活力。因此，交聯(lián)在3D生物打印構(gòu)建組織的過(guò)程中至關(guān)重要，可通過(guò)多重交聯(lián)策略、改變交聯(lián)劑種類(lèi)和濃度等來(lái)改善細(xì)胞活力。

2.1.2 添加抗氧化劑 由于3D生物打印過(guò)程會(huì)產(chǎn)生較大的機(jī)械壓力和剪切應(yīng)力，使細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的活性氧和自由基，激活細(xì)胞凋亡、炎癥途徑。DATTA等［18］在生物墨水中添加了抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力在第1天就得到了顯著改善（91%），第3天改善更加顯著，對(duì)細(xì)胞凋亡和炎癥標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果表明，該氧化劑在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重大作用。相對(duì)于改變擠出壓力、噴嘴直徑、聚合物濃度等方法，該方法促進(jìn)細(xì)胞活力的效果更加明顯。除了N-乙酰半胱氨酸之外，氧化石墨烯也具有抗氧化活性，可清除各種活性氧，還可吸附培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)，與細(xì)胞表面的整合素結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞的生存［19］。CHOE等［20］制備了氧化石墨烯 ／藻酸鹽新型生物墨水用于骨再生的研究，以雙氧水模擬氧化應(yīng)激環(huán)境，結(jié)果顯示，含氧化石墨烯的生物墨水更有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和增殖。因此，添加抗氧化劑對(duì)于提高細(xì)胞活力是十分有效的方法，其他抗氧化劑在3D生物打印中對(duì)細(xì)胞活力的影響需進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。

2.1.3 添加生物活性因子 研究表明，加入生物活性因子，如生長(zhǎng)因子、肽序列，可改善水凝膠的生物活性、刺激細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和分化。生長(zhǎng)因子是可溶于水的生理多肽，在改善生物活性、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化方面具有顯著效果。目前，已有多種生長(zhǎng)因子用于3D生物打印中，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7，可刺激前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子可誘導(dǎo)成軟骨，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可促進(jìn)血管或神經(jīng)的形成［21］。另外，有研究顯示，某些生長(zhǎng)因子可協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子均可與骨形態(tài)發(fā)生蛋白協(xié)同促進(jìn)骨形成［22-23］。除生長(zhǎng)因子外，肽序列也可促進(jìn)生物活性，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）可被細(xì)胞整聯(lián)蛋白識(shí)別，促進(jìn)細(xì)胞黏附。LOZANO等［24］使用RGD肽修飾的結(jié)冷膠作為生物墨水，進(jìn)行3D生物打印構(gòu)建腦樣結(jié)構(gòu)，與未修飾的相比，細(xì)胞黏附和增殖明顯增加，活力得到改善。因此，通過(guò)生長(zhǎng)因子、肽序列等生物活性因子來(lái)改善并增強(qiáng)3D生物打印中細(xì)胞活力是切實(shí)可行的，未來(lái)或許可有更多種類(lèi)活性因子用于3D生物打印中。

2.1.4 其他 除了優(yōu)化交聯(lián)過(guò)程、添加生物活性因子和抗氧化劑之外，研究者還探討了其他改善細(xì)胞活力的方法和策略，包括增加氧氣含量、控制滲透壓及添加活性成分等。氧氣是細(xì)胞成活的一個(gè)重要條件，但通常情況下，3D生物打印體無(wú)充足氧氣滿足細(xì)胞代謝需求。為提高氧氣含量，ERDEM等［25］向生物墨水中添加一定濃度的過(guò)氧化鈣，既可作為氧氣的來(lái)源，又降低了生物墨水的黏度，大幅提高了細(xì)胞活力。除了氧氣之外，滲透壓對(duì)于細(xì)胞正常的生命活動(dòng)也至關(guān)重要。在3D生物打印的過(guò)程中，細(xì)胞承受的滲透壓常被忽略，為證明3D生物打印過(guò)程中滲透壓對(duì)細(xì)胞的重要影響，CARVALHO等［26］以蔗糖作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，結(jié)果表明，通過(guò)控制滲透壓可提高3D生物打印體中細(xì)胞的活力。另外，納米黏土是具有高生物活性的材料，可作為活性成分添加至生物墨水中，并增加材料的機(jī)械性能。蒙脫石是納米黏土的一種，目前已被FDA批準(zhǔn)作為藥物添加劑［27］。CUI等［28］將活性材料蒙脫石引入甲基丙烯酸二醇?xì)ぞ厶堑墓庹T導(dǎo)水凝膠體系，發(fā)現(xiàn)重量比為1.5%的蒙脫石可顯著增加細(xì)胞活力，并促進(jìn)體內(nèi)和體外的骨再生。

2.2 優(yōu)化打印方法和參數(shù) 目前，用于3D生物打印的方法主要有3種：噴墨式生物打印、擠壓式生物打印、激光輔助生物打印，3種方法各有優(yōu)勢(shì)和局限性。為提高細(xì)胞活力和生物學(xué)行為，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究對(duì)新型打印方式和優(yōu)化打印參數(shù)進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)。

2.2.1 構(gòu)建中空管道 盡管水凝膠可進(jìn)行一定程度上的物質(zhì)交換，但過(guò)程緩慢，且擴(kuò)散距離有限，為增加氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的物質(zhì)交換，有學(xué)者構(gòu)建了可灌注的脈管系統(tǒng)，避免打印體內(nèi)部抑制細(xì)胞活力，甚至壞死的情況。這種脈管系統(tǒng)多以犧牲材料為基礎(chǔ)，要求材料打印結(jié)束后易去除，且表面張力好，打印出的結(jié)構(gòu)表面光滑［29］。普朗尼克、明膠、糖基材料、瓊脂糖等均可作為犧牲材料［1］。RICHARD等［30］還開(kāi)發(fā)了一種新方法，以冰作為犧牲材料構(gòu)建了血管結(jié)構(gòu)，細(xì)胞活力有所改善。另有學(xué)者設(shè)計(jì)了多層同軸噴嘴，如JIA等［31］和ATTALLA等［32］利用同軸噴嘴，通過(guò)控制流速、打印速度、材料濃度生成了類(lèi)似血管結(jié)構(gòu)的可灌注空心管，在保持結(jié)構(gòu)完整的前提下，還促進(jìn)了細(xì)胞黏附，提高了細(xì)胞活力。因此，為增加細(xì)胞的物質(zhì)交換，促進(jìn)其生存，通過(guò)犧牲材料或同軸噴嘴構(gòu)建中空管道模擬血管結(jié)構(gòu)是行之有效的方法，未來(lái)將有更多方法來(lái)構(gòu)建這種中空管道。

2.2.2 微囊化及納米囊化 由于動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，直接暴露于各種刺激的外界環(huán)境下，有學(xué)者提出微囊化、納米囊化的方法，即將細(xì)胞封裝于生物相容性良好的保護(hù)殼內(nèi)，與周?chē)h(huán)境隔離，來(lái)降低外界環(huán)境對(duì)細(xì)胞的刺激。微乳化、微流控技術(shù)均是微囊化、納米囊化的有效方法，可通過(guò)產(chǎn)生微米級(jí)水凝膠珠來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受外界刺激［33］。KAMPERMAN等［34］將高通量微流控技術(shù)和基于流式細(xì)胞儀的分選技術(shù)相結(jié)合，生產(chǎn)出單細(xì)胞微凝膠，包封率>90%，可并入生物打印的大凝膠中，且細(xì)胞在結(jié)構(gòu)中均勻分布，但其未進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)。另外，VOSSOUGHI等［35］開(kāi)發(fā)了電噴霧技術(shù)，制備了包含間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊，并觀察到其具有高細(xì)胞活力。因此，微囊化和納米囊化為3D生物打印提高細(xì)胞活力提供了新思路，目前，微囊化和納米囊化仍處于3D生物打印研究的起始階段，該方法將更好地改善細(xì)胞活力。

2.2.3優(yōu)化打印參數(shù) 3D生物打印的打印參數(shù)也會(huì)影響細(xì)胞的生存活力，因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)優(yōu)化打印噴嘴直徑、噴射速度、構(gòu)建體的孔徑、形狀、孔隙率等來(lái)探討最佳打印參數(shù)。劉煜凡等［36］分別采用直徑為210、340、420μm的打印噴嘴來(lái)構(gòu)建3D打印體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，420μm的打印噴嘴可保持較高細(xì)胞活力，并可促進(jìn)細(xì)胞增殖。ALI等［37］以激光輔助生物打印為基礎(chǔ)，研究噴射速度對(duì)細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)與高速?lài)娚浔容^，緩慢噴射更有利于間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSC）的生存。DOMINGOS等［38］設(shè)計(jì)了不同內(nèi)部幾何形狀的支架，研究支架的形態(tài)特征對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明，大的四邊形孔會(huì)增強(qiáng)MSC的活力和增殖。因此，通過(guò)優(yōu)化打印參數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞活力的改善是行之有效的策略，但不同種類(lèi)細(xì)胞和水凝膠的最佳打印參數(shù)不同，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的結(jié)論有所差異，尚未對(duì)具體的打印參數(shù)形成共識(shí)。

2.2.4 其他 除了上述途徑提高細(xì)胞活力之外，還有學(xué)者研究出其他方法來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞活力，包括壓電換能器法、雙通道法、顯微組織構(gòu)建法。高剪切應(yīng)力可導(dǎo)致低細(xì)胞活力，為降低噴嘴內(nèi)的剪切應(yīng)力，KOO等［39］提出使用壓電換能器輔助擠壓式生物打印的創(chuàng)新方法，不僅降低了對(duì)細(xì)胞的損傷，還可打印高黏度生物墨水，機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞活力均得到了改善。細(xì)胞分布不均勻也會(huì)對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生影響，ZHAI等［40］發(fā)明了雙通道方法，通過(guò)交替擠壓兩種不同成分生物墨水，最終獲得了納米復(fù)合水凝膠，與單通道相比，雙通道方法可使細(xì)胞分布更均勻，從而增加細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞增殖。相對(duì)于單細(xì)胞懸液的接種，研究表明，大量細(xì)胞自組裝成三維微組織更有利于細(xì)胞的存活［41］。JIN等［42］采用懸滴法在含有人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的平滑肌誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生成人脂肪衍生干細(xì)胞顯微組織，并將顯微組織進(jìn)行3D生物打印，結(jié)果表明，該方法可促進(jìn)細(xì)胞向平滑肌分化，并保持更高的細(xì)胞活力。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，3D生物打印的細(xì)胞活力與生物墨水特性及打印方法、參數(shù)密切相關(guān)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也從這兩個(gè)方面進(jìn)行了大量探索和研究，并取得了較為豐碩的成果。但由于3D生物打印過(guò)程復(fù)雜，尚處于發(fā)展階段，目前，仍有一些問(wèn)題有待解決。首先，細(xì)胞活力受多重因素疊加的影響，且敏感性強(qiáng)，控制單一變量對(duì)細(xì)胞的影響是需面臨的挑戰(zhàn)之一；其次，目前3D生物打印的研究多集中在體外，更有意義的體內(nèi)研究較少，今后應(yīng)更關(guān)注體內(nèi)的相關(guān)研究。