趙麗麗，朱玉強(qiáng)，馬動(dòng)，張貴民，劉忠

山東新時(shí)代藥業(yè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，山東臨沂273400

CD20人鼠嵌合單克隆抗體又稱利妥昔單抗（商品名：美羅華），1997年在美國(guó)上市，是全球最暢銷的單抗類藥物之一，獲批的適應(yīng)癥有：濾泡性非霍奇金淋巴瘤、彌漫大B細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤（diffuse large B-cell non Hodgkin′s lymphoma，DLBCL）等，目前國(guó)內(nèi)利妥昔單抗僅有上海復(fù)宏漢霖生物制藥有限公司產(chǎn)品（商品名：漢利康）于2019年2月25日獲批上市。

近年來(lái)，質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（Qulity by Design，QbD）理念在抗體藥物領(lǐng)域得到極大的推廣和應(yīng)用［1-2］。生產(chǎn)通常在大規(guī)模生物反應(yīng)器中進(jìn)行，如何穩(wěn)定地進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，需要企業(yè)在藥品研發(fā)進(jìn)入后期時(shí)，建立合適的規(guī)模縮小模型，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（Design of Experiment，DOE）研究，分析細(xì)胞培養(yǎng)過程參數(shù)對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attribute，CQA）的影響，確定過程參數(shù)的操作范圍，以確保大型生物反應(yīng)器具有穩(wěn)定可靠的生產(chǎn)能力。

近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外抗體藥物陸續(xù)上市，越來(lái)越多的研究關(guān)注規(guī)模縮小模型的建立，其中大部分縮小模型建立考慮等P／V策略［3-4］。同時(shí)，隨著高通量技術(shù)和一次性材料的發(fā)展與應(yīng)用，極小規(guī)模的生物反應(yīng)器（250 mL）被應(yīng)用于縮小模型建立，以減少研發(fā)成本及提高研發(fā)效率［5-6］。目前，國(guó)內(nèi)針對(duì)規(guī)模縮小模型建立的文獻(xiàn)報(bào)道較少，本文基于等P／V策略對(duì)規(guī)模縮小模型的建立進(jìn)行相關(guān)研究。等P／V策略在縮小模型建立時(shí)，考慮生產(chǎn)規(guī)模反應(yīng)器攪拌槳輸入功率與反應(yīng)工作體積的比值應(yīng)與小規(guī)模生物反應(yīng)器一致，相關(guān)公式為P／V=Npρn3D5／V。大型生物反應(yīng)器與小型生物反應(yīng)器相比，通常由于混合及傳質(zhì)效果變差而引起培養(yǎng)體系中的二氧化碳分壓（pCO2）升高，較高的pCO2使細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體表達(dá)量降低［7-8］。因此，在建立規(guī)?？s小模型時(shí)，本研究應(yīng)用降低空氣通氣量的方式，減少培養(yǎng)體系中CO2的溢出，以期保持與放大規(guī)模相近的pCO2。同時(shí)應(yīng)盡量模擬大型生物反應(yīng)器的空氣及氧氣同期控制策略，以期小型生物反應(yīng)器能夠較好地代表規(guī)?；a(chǎn)。

規(guī)?？s小模型的建立過程中除了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況進(jìn)行監(jiān)測(cè)外，還需對(duì)細(xì)胞的代謝情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)和分析，通常乳酸和銨離子是CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中非常重要的代謝副產(chǎn)物［9］。孫祥明等［10］研究發(fā)現(xiàn)，氨濃度的增加明顯改變了細(xì)胞的代謝途徑。因此，本文主要對(duì)規(guī)?？s小模型的乳酸和銨離子進(jìn)行研究。代謝產(chǎn)物通常對(duì)CHO細(xì)胞的pH值等產(chǎn)生影響，從而影響CHO細(xì)胞的活力，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)及單克隆抗體表達(dá)量［11］。

本研究應(yīng)用3 L生物反應(yīng)器建立生產(chǎn)規(guī)模450 L生物反應(yīng)器的縮小模型，采用親和層析純化抗CD20單克隆抗體，為進(jìn)一步應(yīng)用DOE法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)過程表征研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 穩(wěn)定表達(dá)抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體的CHO細(xì)胞由山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司構(gòu)建。

1.2 主要試劑及儀器 T31基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基由山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司研發(fā)，均不含任何動(dòng)物源成分；5 mL HiTrapTMrProtein A柱為美國(guó)GE公司產(chǎn)品；TSKgel G3000SW色譜柱為日本TSK公司產(chǎn)品；WCX-10弱陽(yáng)離子色譜柱為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；變性液PNGaseF為美國(guó)Prozyme公司產(chǎn)品；2AB-標(biāo)記試劑盒為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；XBrige Amide色譜柱和糖型分析抽提小柱為美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；乳酸和銨離子檢測(cè)試劑和生化分析儀為瑞士羅氏公司產(chǎn)品；血?dú)夥治鰞xRIPID-348為德國(guó)西門子公司產(chǎn)品；3 L和450 L生物反應(yīng)器為德國(guó)賽多利斯公司產(chǎn)品。

1.3 C H O細(xì)胞培養(yǎng)制備抗體 采用3 L（7個(gè)批次）和450 L（3個(gè)批次）生物反應(yīng)器流加-批式工藝進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，相關(guān)培養(yǎng)參數(shù)見表1，其中3 L生物反應(yīng)器初始空氣通氣量為50 ccm，氧氣通氣量與溶氧級(jí)聯(lián)控制，與450 L罐溶氧控制方式一致，從培養(yǎng)第10天起空氣通氣量關(guān)閉，只通過純氧控制溶氧。攪拌轉(zhuǎn)速根據(jù)公式P／V=Npρn3D5／V計(jì)算得到，式中V代表工作體積，Np代表功率常數(shù)，n代表攪拌轉(zhuǎn)速，ρ為培養(yǎng)液密度，D為攪拌槳直徑。不同的攪拌槳類型Np不同，本研究基于等P／V策略進(jìn)行縮小模型建立，研究用3 L生物反應(yīng)器的Np為0.70，D為54 mm；450 L生物反應(yīng)器的Np為1.30，D為325 mm。培養(yǎng)過程中每天取樣監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，并計(jì)算細(xì)胞活率（活細(xì)胞總數(shù) ／細(xì)胞總數(shù) ×100%）。應(yīng)用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)離線pCO2含量，生化分析儀檢測(cè)主要代謝副產(chǎn)物乳酸和銨離子含量。

表1 3 L和450 L生物反應(yīng)器流加-批式工藝細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)控制Tab.1 Control of cell culture parameters of fed-batch process in 3 L and 450 L bioreactors

1.4抗體純化 細(xì)胞培養(yǎng)16d收獲，培養(yǎng)液經(jīng)4528×g離心20 min后，經(jīng)0.22μm濾器過濾，上HiTrapTMrProtein A親和層析柱，分離純化抗體，紫外分光光度法檢測(cè)抗體表達(dá)量。

1.5 抗體質(zhì)量檢測(cè) 經(jīng)5 mL HiTrapTMrProtein A柱親和層析后的抗體應(yīng)用TSKgel G3000SW色譜柱（7.8 mm×300 mm，5μm）檢測(cè)抗體聚體，流動(dòng)相為0.1 mol／L硫酸鈉和1 mol／L磷酸氫二鈉，流速1.0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，檢測(cè)時(shí)間20 min；應(yīng)用WCX-10弱陽(yáng)離子色譜柱（4 mm×250 mm）檢測(cè)抗體酸性峰和堿性峰，流動(dòng)相為50 mol／L磷酸二氫鉀和1 mol／L氯化鈉，流速1.0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，檢測(cè)時(shí)間30 min；應(yīng)用XBrige Amide色譜柱（3.5μm，4.6 mm×150 mm）檢測(cè)抗體糖型含量，流動(dòng)相為100 mmol／L甲酸銨溶液和100%乙腈溶液，流速1.0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)激發(fā)光為330 nm，發(fā)射光為420 nm。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用mini-tab軟件對(duì)生產(chǎn)規(guī)模批次和規(guī)?？s小模型批次親和層析后的抗體表達(dá)量、聚體含量、酸性峰含量、堿性峰含量及糖型結(jié)果（G0和G1F+G2F）進(jìn)行雙單側(cè)檢驗(yàn)（Two One-Sided Test，TOST）分析（α值設(shè)定0.05），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及p CO2水平 應(yīng)用3 L生物反應(yīng)器建立的縮小模型與450 L生物反應(yīng)器相比，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及活率基本一致，3 L和450 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)活細(xì)胞密度均在培養(yǎng)第14天達(dá)峰值，分別為27.8×106和27.3×106cells／mL，下罐密度分別為25.3×106和25.4×106cells／mL，下罐細(xì)胞活率分別為94.2%和92.6%，見圖1。兩種類型的生物反應(yīng)器比較，3 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)10 d后應(yīng)用單純通氧氣策略，細(xì)胞培養(yǎng)后期pCO2水平與450 L生物反應(yīng)器中基本一致，見圖2。

圖1 3 L和450 L生物反應(yīng)器細(xì)胞生長(zhǎng)狀況Fig.1 Cell growth in 3 L and 450 L bioreactors

圖2 3 L和450 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)液中pCO2含量Fig.2 The pCO2 contents in culture medium of 3 L and 450 L bioreactors

2.2 細(xì)胞代謝情況 應(yīng)用3 L生物反應(yīng)器建立的縮小模型與450 L生物反應(yīng)器相比，乳酸及氨的代謝基本一致，3 L和450 L生物反應(yīng)器中平均乳酸含量培養(yǎng)前期增長(zhǎng)較快，均在培養(yǎng)第5天達(dá)峰值，分別為1 636和1 557 mg／L，然后逐漸下降，下罐時(shí)乳酸含量分別為155和148 mg／L，見圖3。3 L和450 L生物反應(yīng)器中銨離子含量培養(yǎng)前期增加較快，培養(yǎng)第10～13天達(dá)平臺(tái)期，然后繼續(xù)增加，培養(yǎng)第16天下罐時(shí)達(dá)峰值，見圖4。

圖3 3 L和450 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)液中乳酸含量Fig.3 Lactic acid contents in culture medium of 3 L and 450 L bioreactors

圖4 3 L和450 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)液中銨離子含量Fig.4 Ammonium ion content in culture medium of 3 L and 450 L bioreactors

2.3 抗體表達(dá)量及質(zhì)量 3 L縮小模型抗體表達(dá)量、聚體、酸性峰和堿性峰、糖型G0和G1F+G2F含量的均值與生產(chǎn)規(guī)模各結(jié)果均值的差值均在生產(chǎn)規(guī)模3倍標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)，見表2和表3。mini-tab軟件分析顯示，抗體表達(dá)量及各質(zhì)量參數(shù)變量P值均＜0.05，見表4，證明均拒絕原假設(shè)，原假設(shè)抗體表達(dá)量及各質(zhì)量參數(shù)變量在等價(jià)區(qū)間外，拒絕原假設(shè)即表達(dá)量及各質(zhì)量參數(shù)變量均在等價(jià)區(qū)間內(nèi)。因此可認(rèn)為，3 L生物反應(yīng)器建立的縮小模型與生產(chǎn)規(guī)模等價(jià)。

表2 3 L和450 L生物反應(yīng)器抗體表達(dá)量及各質(zhì)量參數(shù)均值和標(biāo)準(zhǔn)差Tab.2 Expression levels as well as mean and standard deviation of quality parameters of antibody in 3 L and 450 L bioreactors

表3 3 L和450 L生物反應(yīng)器抗體表達(dá)量及質(zhì)量參數(shù)TOST差值分析Tab.3 Analysis of TOST difference of antibody expression and quality parameters in 3 L and 450 L bioreactors

表4 3 L和450 L生物反應(yīng)器抗體表達(dá)量及質(zhì)量參數(shù)TOST分析T和P值Tab.4 T and P values of TOST analysis of antibody expression and quality parameters in 3 L and 450 L bioreactors

3 討論

隨著上海復(fù)宏漢霖生物制藥有限公司生產(chǎn)的CD20人鼠嵌合單克隆抗體（商品名：漢利康）于2019年2月上市，國(guó)內(nèi)其他CD20人鼠嵌合單克隆抗體也將陸續(xù)進(jìn)入臨床Ⅲ期。除此之外，越來(lái)越多的生物制品陸續(xù)進(jìn)入臨床Ⅲ期，合適的規(guī)?？s小模型有助于穩(wěn)定生產(chǎn)工藝的開發(fā)。因此，規(guī)?？s小模型的研究也越來(lái)越受到關(guān)注。

國(guó)內(nèi)外藥品監(jiān)督管理部門要求合理的規(guī)?？s小模型必須考慮規(guī)模效應(yīng)，并代表擬定的商業(yè)規(guī)模過程?？s小模型建立成功的關(guān)鍵過程參數(shù)包括活細(xì)胞密度、細(xì)胞密度峰值、產(chǎn)物表達(dá)量等，質(zhì)量屬性包含抗體聚體含量、電荷異構(gòu)體及糖型等。為了證明小試規(guī)模和生產(chǎn)規(guī)模質(zhì)量屬性的等價(jià)性，TOST越來(lái)越多地用于確定縮小模型和大規(guī)模工藝性能的可比性［12］。將規(guī)模可比性定義為-θ

本研究證明，應(yīng)用后期關(guān)閉空氣通氣策略，有助于提高pCO2水平，達(dá)到與生產(chǎn)規(guī)模相近的pCO2水平。使用基于等P／V原則標(biāo)準(zhǔn)建立的縮小模型，經(jīng)評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)、pCO2水平及主要代謝副產(chǎn)物含量，與生產(chǎn)規(guī)模相比具有等價(jià)性，本研究中的細(xì)胞經(jīng)等P／V原則計(jì)算的攪拌轉(zhuǎn)速所產(chǎn)生的剪切力不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大損傷，因此在縮小規(guī)模細(xì)胞密度與活率與生產(chǎn)罐表現(xiàn)基本一致，相似的細(xì)胞密度和活率才能保證在縮小規(guī)模的代謝水平與生產(chǎn)罐一致，從而保證培養(yǎng)結(jié)束時(shí)抗體產(chǎn)量和質(zhì)量的等價(jià)性。本研究應(yīng)用TOST法分析表達(dá)量、聚體含量、酸性峰和堿性峰含量及糖型，結(jié)果表明，酸性峰和G0含量的平均值存在差異，但通過TOST分析顯示，酸性峰和G0變量P值均小于0.05，因此差異并不顯著。經(jīng)綜合評(píng)價(jià)抗體表達(dá)量、聚體含量、酸性峰和堿性峰含量及糖型結(jié)果，3 L生物反應(yīng)器建立的規(guī)?？s小模型能夠代表450 L生產(chǎn)規(guī)模流程，模仿商業(yè)規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過程，培養(yǎng)終產(chǎn)品的質(zhì)量屬性能夠代表商業(yè)化規(guī)模的產(chǎn)品質(zhì)量屬性。

本研究中小規(guī)模生物反應(yīng)器縮小模型的成功建立，為進(jìn)一步應(yīng)用DOE法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)過程表征的研究奠定了基礎(chǔ)。DOE研究能夠應(yīng)用較少的資源及實(shí)驗(yàn)組，加速工藝表征及藥品上市進(jìn)程，使患者能夠更快地接受本公司研發(fā)的CD20人鼠嵌合單克隆抗體的生物治療。