徐康維，何蕊，權(quán)婭茹，蘇喆，王劍鋒，趙慧，李長貴

1.中國食品藥品檢定研究院呼吸道病毒疫苗室，北京102629；2.北京生物制品研究所有限責(zé)任公司質(zhì)量檢定室，北京100176；3.天津市藥品檢驗(yàn)研究院生化室，天津300070

新型冠狀病毒的大流行嚴(yán)重危害人類健康影響社會(huì)發(fā)展［1］。自疫情暴發(fā)以來，世界各地研究人員一直在努力開發(fā)新型冠狀病毒肺炎（coronaVirus Disease 2019，COVID-19）疫苗，目前已有上百種疫苗處于臨床前或臨床開發(fā)階段，包括重組亞單位疫苗、腺病毒載體疫苗、核酸疫苗、新型納米顆粒疫苗、純化滅活病毒疫苗等［2-4］。其中滅活病毒疫苗具備應(yīng)用歷史長、工藝成熟、有效性及安全性良好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于預(yù)防和控制新發(fā)傳染病中，如脊髓灰質(zhì)炎疫苗、流感疫苗等［5-7］。

新型冠狀病毒編碼S蛋白、包膜蛋白（envelope，E）、膜蛋白（membrane，M）和核衣殼（nucleocapsid，N）4種結(jié)構(gòu)蛋白［8-10］。S蛋白在病毒吸附及進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程中起重要作用，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效中和抗體（NAbs），同時(shí)也是新型冠狀病毒疫苗的主要靶蛋白［11-12］。之前研究報(bào)道，新型冠狀病毒滅活疫苗接種非人靈長類動(dòng)物主要產(chǎn)生針對(duì)S蛋白的抗體，并可對(duì)抗重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acuterespiratory synd-romecoronavirus2，SARS-CoV-2）起到保護(hù)作用［13］。臨床研究也顯示，新型冠狀病毒滅活疫苗在18~59歲健康受試者中具有良好耐受性、免疫原性及安全性［14-15］。本研究通過制備新型冠狀病毒重組S蛋白羊和兔抗血清，建立檢測新型冠狀病毒滅活疫苗抗原含量的雙抗體夾心ELISA方法，并初步對(duì)新型冠狀病毒滅活疫苗產(chǎn)品中S蛋白含量進(jìn)行定量檢測。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)山羊（體重約20 kg，雄性）和普通級(jí)新西蘭白兔（體重約2 kg，雄性）均購自北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，并委托該公司進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)、免疫及采血，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2020-0003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（京）-2020-0007。

1.2 病毒及原液 新型冠狀病毒滅活疫苗原液及微量中和試驗(yàn)用新型冠狀病毒野病毒（CZ01）購自北京科興中維生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑及儀器 重組新型冠狀病毒Spike蛋白（S1+S2，無血清培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)，以下簡稱Spike蛋白）購自北京義翹神州科技有限公司，貨號(hào)：40589-V08B1；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自荷蘭Nordic Mubio公司；Aqua Max4000洗板機(jī)購自美國Molecular Devices公司；Thermo Scientific Multiskan Ascent酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；蛋白G純化樹脂及AKTA pure蛋白純化儀均購自美國GE公司。

1.4 抗體制備

1.4.1 羊抗S蛋白多克隆抗體的制備 用200μg S蛋白與弗氏完全佐劑混合后，肌肉注射免疫2只山羊，2周后使用100μg S蛋白與弗氏不完全佐劑混合，進(jìn)行第2次免疫，之后隔周進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫。共免疫4次。免疫前和每次免疫后1周動(dòng)脈采血分離血清，檢測抗體效價(jià)。

1.4.2 兔抗S蛋白多克隆抗體的制備 用50μg S蛋白與弗氏完全佐劑混合后，皮下注射免疫4只家兔，2周后使用25μg S蛋白與弗氏不完全佐劑混合，進(jìn)行第2次免疫，之后隔周進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫。共免疫3次。免疫前和每次免疫后1周動(dòng)脈采血分離血清，檢測抗體效價(jià)。

1.5 抗血清EL I S A效價(jià)檢測 采用間接ELISA法。用PBS緩沖液（pH 7.2）將新型冠狀病毒滅活疫苗原液稀釋至蛋白含量為1μg／mL，加至96孔板，100μL／孔，4℃靜置過夜；PBS-T洗滌5次，加入封閉液（1%BSA，PBS溶解），200μL／孔，室溫封閉1 h；用封閉液將羊或兔抗血清從900倍開始進(jìn)行3倍系列稀釋，室溫孵育2 h；PBS-T洗滌5次，加入HRP標(biāo)記的抗羊或抗兔IgG，室溫孵育1 h；TMB底物顯色，1 mol／L H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定A450／630值。以大于陰性對(duì)照孔A值2.1倍的對(duì)應(yīng)抗血清稀釋倍數(shù)，作為抗血清效價(jià)。

1.6 抗血清中和效價(jià)檢測 采用微量中和試驗(yàn)。用199培養(yǎng)基將免疫前后的羊和兔血清樣品進(jìn)行4倍稀釋，56℃水浴滅活30 min；將滅活后血清加至96孔培養(yǎng)板中，每份樣品加2孔，50μL／孔，用199培養(yǎng)基從8倍開始進(jìn)行2倍系列稀釋，共12個(gè)稀釋度；加入100 CCID50／50μL新型冠狀病毒野病毒（CZ01株），50μL／孔，37℃培養(yǎng)箱靜置2 h；加入（1.2～2.0）×105個(gè) ／mL Vero細(xì)胞，100μL／孔，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d；顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，以半數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)病變的稀釋度計(jì)為該血清的中和抗體效價(jià)。

1.7 抗體特異性檢測 采用免疫印跡試驗(yàn)。用10%Bis-Tris預(yù)制膠和MES電泳緩沖液對(duì)新型冠狀病毒疫苗滅活原液進(jìn)行還原電泳，上樣量10μL，150 V電泳40 min。用干式轉(zhuǎn)膜儀7 V轉(zhuǎn)膜15 min，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用3%奶粉（含0.1%Tween20的PBS緩沖液）室溫封閉1 h；加入羊抗體或兔抗體（分別1∶4 000和1∶2 000稀釋），室溫?fù)u床孵育2 h；PBS-T洗滌3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG或HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（分別1∶10 000和1∶20 000稀釋），室溫?fù)u床孵育1 h；PBS-T洗滌3次，每次10 min，加入ECL顯色后，用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測。

1.8 多克隆抗體的純化 PBS平衡蛋白G親和層析柱，用PBS對(duì)抗血清進(jìn)行2倍稀釋后，上樣；PBS洗滌柱子至基線平穩(wěn)后，用0.1 mol／L pH 2.7甘氨酸溶液洗脫；收集洗脫液，用1 mol／L pH 9.0 Tris溶液平衡pH值后，置10 kD透析袋內(nèi)，用PBS緩沖液進(jìn)行透析。

1.9 新型冠狀病毒滅活疫苗原液雙抗體夾心EL I S A檢測方法的初步建立及應(yīng)用 用碳酸鹽包被液（pH 9.6 NaHCO3緩沖液）將已純化羊多克隆抗體進(jìn)行15 000倍稀釋，加至96孔板，100μL／孔，4℃包被過夜；PBS-T洗滌5次，1%BSA（PBS溶解）37℃封閉1 h；用1%BSA-T（含0.05%Tween20的PBS緩沖液）將新型冠狀病毒滅活疫苗原液按總蛋白含量，從64μg／mL進(jìn)行2倍系列稀釋，共12個(gè)稀釋度，加至封閉后的96孔板，100μL／孔，37℃孵育2 h；PBS-T洗滌5次，加入兔多克隆抗體（1%BSA-T 1∶3 000稀釋），37℃孵育1 h；PBS-T洗滌5次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1%BSA-T 1∶5 000稀釋），37℃孵育1 h；PBS-T洗滌5次，加入TMB底物，室溫顯色15 min；1 mol／L H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定A450／630值。用建立的方法對(duì)A、B兩個(gè)廠家各3批新型冠狀病毒滅活疫苗原液進(jìn)行檢測。

1.10 結(jié)果分析 使用EXCEL 2016和SoftMax 5.0軟件進(jìn)行分析處理并繪圖。

2 結(jié)果

2.1 抗血清EL I S A效價(jià) 結(jié)果顯示，2只山羊血清抗體效價(jià)均在第3次免疫后達(dá)到最高，第4次免疫后未再升高；1和2號(hào)羊血清抗體效價(jià)分別為220 000和70 000，采用1號(hào)羊血清進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。1和2號(hào)家兔免疫3次后，血清抗體效價(jià)均達(dá)到220 000，將兩只家兔血清混合，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；3和4號(hào)家兔3次免疫后血清抗體效價(jià)略低，均為70 000。見圖1。

圖1 間接ELISA法檢測新型冠狀病毒重組S蛋白免疫后羊（A）、兔（B）抗血清效價(jià)Fig.1 Determination of titers of goat（A）and rabbit（B）antisera against recombination S protein of SARS-CoV-2 by indirect ELISA

2.2 抗血清中和效價(jià) 結(jié)果顯示，2只山羊在初次免疫后1周，均可檢測到較低水平中和抗體，第2次免疫后，中和抗體效價(jià)增長顯著，第3次免疫后，僅略有增長，而第4次免疫后無增長；1號(hào)羊中和抗體效價(jià)較高，為1 536。4只家兔在初次免疫后，同樣均可檢測到較低水平中和抗體；第2次免疫后，中和抗體效價(jià)顯著增長，1號(hào)兔達(dá)到最高值4 096，第3次免疫后，2號(hào)兔也達(dá)到4 096；3和4號(hào)兔3次免疫后中和抗體效價(jià)均為768。見圖2。

圖2 微量中和試驗(yàn)檢測新型冠狀病毒重組S蛋白免疫后羊（A）、兔（B）抗血清中和效價(jià)Fig.2 Determination of titers of goat（A）and rabbit（B）antisera against Sprotein of SARS-CoV-2 by microneutralization assay

2.3 抗體特異性 結(jié)果顯示，羊和兔抗體均可與新型冠狀病毒滅活疫苗原液S蛋白特異性結(jié)合，出現(xiàn)2條條帶，S蛋白表觀相對(duì)分子質(zhì)量約190 000，而S1、S2亞基相對(duì)分子質(zhì)量接近，不能在電泳中得到區(qū)分，表觀相對(duì)分子質(zhì)量約90 000。見圖3。

圖3 免疫印跡試驗(yàn)檢測新型冠狀病毒重組S蛋白免疫后羊、兔抗體特異性Fig.3 Test for specificity of goat and rabbit antibodies against recombinant Sprotein by Western blot

2.4 雙抗體夾心EL I S A方法的初步建立及應(yīng)用 新型冠狀病毒滅活疫苗原液蛋白含量在0.031~64μg／mL范圍內(nèi)，呈典型四參數(shù)曲線，線性較好，R2>0.99，見圖4。該方法可用于A、B兩個(gè)廠家各3批新型冠狀病毒滅活疫苗原液抗原含量檢測，見表1。

圖4 不同抗原濃度下的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve at various antigen concentrations

表1 兩個(gè)廠家新型冠狀病毒滅活疫苗原液抗原含量檢測結(jié)果Tab.1 Determination results of antigen contents in bulks of inactivated SARS-CoV-2 vaccine from two manufacturers

3 討論

本研究中選擇新型冠狀病毒重組S蛋白作為免疫原，對(duì)羊和兔進(jìn)行免疫，得到了較高效價(jià)的抗血清，并通過蛋白G純化樹脂處理進(jìn)行純化，得到S蛋白抗體。免疫印跡結(jié)果顯示，兩抗體均能與滅活疫苗蛋白特異性結(jié)合，出現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量分別約190 000和90 000的2條帶。新型冠狀病毒全長S蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量為142 000，其表面的部分S蛋白可被furin蛋白酶切割成理論相對(duì)分子質(zhì)量分別為75 000和67 000的S1和S2兩個(gè)亞基。由于S蛋白的高度糖基化，其表觀相對(duì)分子質(zhì)量大于理論相對(duì)分子質(zhì)量，本研究結(jié)果也與之前報(bào)道的一致［16-17］。

本研究采用羊抗體作為包被抗體，兔抗體作為顯示抗體，初步建立了雙抗體夾心ELISA方法，該方法線性良好，R2>0.99，并對(duì)兩個(gè)廠家各3批次新型冠狀病毒滅活疫苗原液抗原含量進(jìn)行了檢測。本研究制備的抗體已分發(fā)至我國多家新型冠狀病毒滅活疫苗及重組疫苗研發(fā)生產(chǎn)企業(yè)，用于抗原檢測方法的建立及質(zhì)量控制研究。