張小芳，唐鳳鳴

成都市溫江區(qū)人民醫(yī)院，四川成都611130

藁本內(nèi)酯（ligustilide，LIG，3-丁烯基-4，5-二氫異苯并呋喃酮）是一種在當歸、川芎等中藥材中廣泛存在的苯酞類化合物。已有的藥理學(xué)研究表明，LIG具有非常多樣的治療作用，如保肝、利尿、抗炎、神經(jīng)保護和抗腫瘤等藥理活性［1］。在多種腫瘤細胞中，LIG已被證明具有抗凋亡活性、細胞周期阻滯能力和抗腫瘤細胞增殖活性。此外，有文獻報道，LIG對高糖導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細胞損傷具有明顯的保護作用，通過下調(diào)細胞內(nèi)Caspase-3表達并提升Bcl-2蛋白水平來抑制細胞凋亡［2］。低濃度的LIG可顯著保護PC12細胞免受氧糖剝奪導(dǎo)致的細胞凋亡。LIG在低濃度長時間孵育或高濃度短時間孵育情況下，可通過控制激素通路的激活和壓力蛋白的誘導(dǎo)來保護PC12細胞，促進氧糖剝奪模型中PC12細胞的生存。另一方面，高濃度長時間的LIG處理會導(dǎo)致大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，壓倒性的氧化應(yīng)激將導(dǎo)致PC12細胞大量死亡?？傊琇IG既可以在特定情況下促進細胞存活，也可能反過來導(dǎo)致細胞死亡，具體藥理作用與劑量、濃度和時間有關(guān)［3］。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是一種革蘭陰性細菌細胞壁中的毒性成分，也是細菌內(nèi)毒素的主要成分之一，通常在革蘭陰性細菌死亡溶解時釋放出來，導(dǎo)致系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)、免疫激活和組織損傷［4］。LPS在體外培養(yǎng)時可誘導(dǎo)肺上皮細胞凋亡，加入凋亡抑制劑可提高細胞存活率［5］。有研究認為，在LPS導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷模型中，減少肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮細胞的凋亡率可有效緩解肺組織損傷和提高小鼠存活率［6］。因此，研究LIG在緩解LPS誘導(dǎo)的肺上皮細胞損傷中的治療作用和機制對研發(fā)新的膿毒癥致急性肺損傷藥物具有重要的研究價值。在LPS導(dǎo)致的急性肺損傷早期階段，肺上皮細胞和肺泡毛細血管內(nèi)皮細胞受損，進而導(dǎo)致微循環(huán)功能障礙和肺水腫是疾病早期的主要生理標志［7］。此外，在LPS導(dǎo)致的急性肺損傷中，肺上皮細胞功能受損將會導(dǎo)致肺泡表面活性物質(zhì)合成受阻、肺水清除障礙，進而誘發(fā)膿毒癥，甚至不可逆的肺纖維化［8］。當前對LIG的血管內(nèi)皮細胞保護作用研究較多［1-3］，對于LIG保護肺泡上皮細胞免受LPS損傷的作用和機制尚不明確。本研究旨在探討LIG對LPS誘導(dǎo)的肺上皮細胞損傷的保護作用及其機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及質(zhì)粒 BEAS-2B肺上皮細胞購自中國科學(xué)院細胞庫；GFP-LC3質(zhì)粒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 LIG購自上海源葉生物科技有限公司；羥氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）和3-甲基嘌呤（3-methylpurine，3-MA）購自上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司；CCK-8試劑盒、Hoechst33258、Lipofectamine 2000和AnnexinV-FITC／PI雙染試劑盒均購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule associated protein light chain 3，LC3）、p62和Caspase-3單克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗人細胞色素C（cytochrome c）和Bcl-2多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP標記的羊抗兔IgG和ECL發(fā)光液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇BEAS-2B細胞，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.4 L I G對L PS誘導(dǎo)的B EA S-2B細胞增殖影響的檢測 將細胞濃度調(diào)整為（2～5）×103個／孔，向96孔板中加入約100μL細胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)使細胞貼壁。將細胞分為對照組、不同濃度LPS組（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 ng／mL）和各濃度LPS+LIG（2.0μmol／L）組，分別加入空白溶劑或?qū)?yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。向每孔中加入10μL CCK-8，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，在酶標儀上測定吸光度值，檢測波長450 nm，參比波長600 nm。

1.5 L I G對L PS誘導(dǎo)的B EA S-2B細胞凋亡影響的檢測

將BEAS-2B細胞接種至6孔板或24孔板中，細胞分為對照組、LPS（0.5 ng／mL）組和LPS（0.5 ng／mL）+LIG（2.0μmol／L）組，分別加入空白溶劑或?qū)?yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5.1 流式細胞術(shù) 向各孔中加入AnnexinV-FITC／PI雙染試劑，室溫避光孵育10 min；PBS洗滌2次，收集細胞于流式管中，流式細胞儀上機檢測。

1.5.2 Hoechst33258染色法 使用Hoechst33258檢測細胞核形態(tài)變化。

1.6 L I G對L PS誘導(dǎo)的B EA S-2B細胞形態(tài)影響的檢測 細胞分組及處理同1.5項。取各組細胞，用胰酶消化制成細胞懸液，經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌后離心，棄上清液，滴加2.5%戊二醛固定懸浮細胞2 h；在磷酸緩沖液中漂洗2 h，洗凈戊二醛，用1%鋨酸固定液固定2 h；乙醇脫水后在浸漬液中浸漬4 h，再放入純包埋劑中過夜。切片后進行醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。在透射電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、細胞質(zhì)等的變化，照相并記錄結(jié)果。

1.7 GF P-L C3轉(zhuǎn)染和激光共聚焦顯微鏡成像 用50μL無血清培養(yǎng)基分別稀釋GFP-LC3質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，孵育5 min后，將GFP-LC3質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混勻并靜置15 min，加入對照組、LPS（0.5 ng／mL）組和LPS（0.5 ng／mL）+LIG（2.μmol／L）組96孔板細胞中，置37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)4～6 h。各組細胞分別用胰酶消化，制成細胞懸液，移去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，滴加4%多聚甲醛，固定細胞20 min；吸棄多聚甲醛，PBS洗滌3次，滴加0.2%Triton X-100，室溫透膜20 min；吸棄Triton X-100，PBS洗滌3次，使用血清封閉液，置濕盒中37℃封閉30 min；去除封閉液，滴加一抗（1∶25稀釋），4℃濕盒中過夜孵育；PBS洗滌3次，滴加熒光二抗（1∶100稀釋），室溫下避光孵育1 h；PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.8 L I G對L PS誘導(dǎo)的B EA S-2B細胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達水平影響的檢測 采用Western blot法。將BEAS-2B細胞分為對照組、LPS（0.5 ng／mL）組和LPS（0.5 ng／mL）+不同濃度LIG（0.5、2.0μmol／L）組，分別加入空白溶劑或?qū)?yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組細胞棄去培養(yǎng)液，冷PBS洗滌2次，收集細胞，9 600×g冷凍離心5 min，棄去上清液，加入細胞裂解液，冰上裂解1 h，9 600×g冷凍離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白總濃度。取適量蛋白樣本，經(jīng)15%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以2.5%脫脂奶粉室溫振搖封閉2 h；加入一抗（1∶100稀釋），4℃振搖過夜；洗滌后加入二抗（1∶500稀釋），室溫振搖2 h；洗滌后滴加ECL發(fā)光液，化學(xué)凝膠成像儀曝光成像。

1.9 自噬抑制劑對L I G緩解L PS誘導(dǎo)的B EA S-2B細胞影響的檢測 將BEAS-2B細胞分為對照組、LPS（0.5 ng／mL）+不同濃度LIG（0、0.25、0.5、1.0、2.0μmol／L）組、LPS（0.5 ng／mL）+HCQ（50μmol／L）+不同濃度LIG（0、0.25、0.5、1.0、2.0μmol／L）組和LPS（0.5 ng／mL）+3-MA（250μmol／L）+不同濃度LIG（0、0.25、0.5、1.0、2.0μmol／L）組，分別加入空白溶劑或?qū)?yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。CCK-8法檢測各組細胞增殖情況，流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Graphpad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值 ±標準偏差（mean±standard derivation，SD）表示。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，試驗均重復(fù)3次或以上，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 L I G對L PS誘導(dǎo)的B EA S-2B細胞增殖的影響LPS會顯著抑制BEAS-2B細胞的增殖能力，且隨著LPS濃度的升高細胞增殖能力逐漸下降，LPS濃度在0.125～0.5 ng／mL時，可顯著抑制細胞增殖。各濃度LPS組加入LIG均可不同程度地增強細胞增殖活性，LPS濃度為0.5 ng／mL時，LPS組細胞存活率為（56.4±6.24）%，LPS+LIG組細胞存活率為（69.2±9.8）%。LPS濃度不高于0.5 ng／mL時，LPS+LIG組細胞增殖能力與空白對照差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.67～2.65，P＞0.05），治療效果較好。見圖1。

圖1 LIG對LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細胞增殖的影響Fig.1 Effect of LIG on proliferation of BEAS-2B cells induced by LPS

2.2 L I G對L PS誘導(dǎo)的B EA S-2B細胞凋亡的影響

2.2.1 流式細胞術(shù) 0.5 ng／mL LPS處理24 h后，BEAS-2B細胞凋亡率從（1.90±0.18）%上升至（15.96±0.21）%，而0.5 ng／mL LPS+2.0μmol／L LIG處理24 h后，細胞凋亡率下降至（3.69±0.38）%，LPS組顯著高于對照組和LPS+LIG組（t分別為4.65和3.26，P分別為0.016和0.0276）。見圖2和圖3。

圖2 流式細胞術(shù)檢測各組BEAS-2B細胞的凋亡Fig.2 Flow cytometry of apoptosis of BEAS-2B cells in various groups

圖3 各組BEAS-2B細胞的凋亡率Fig.3 Apoptosis rates of BEAS-2B cells in various groups

2.2.2 Hoechst33258法 LPS組部分細胞核出現(xiàn)了固縮、碎裂和熒光亮度增強等典型的細胞凋亡現(xiàn)象，而LPS+LIG組和對照組細胞核形態(tài)無顯著區(qū)別，見圖4。

圖4 Hoechst33258染色檢測各組BEAS-2B細胞的凋亡（標尺：50μm）Fig.4 Test for apoptosis of BEAS-2B cells in various groups by Hoechst33258 staining（bar=50μm）

2.3 L I G對L PS誘導(dǎo)的B EA S-2B細胞形態(tài)的影響透射電鏡觀察顯示，對照組BEAS-2B細胞未發(fā)現(xiàn)明顯異常；LPS組細胞中部分線粒體結(jié)構(gòu)不完整，線粒體膜破壞；LPS+LIG組細胞中可觀察到較多自噬空泡，并可見部分自噬空泡與受損的線粒體融合。見圖5。表明LIG可能通過增強自噬從而發(fā)揮對BEAS-2B細胞的保護作用。

圖5 透射電鏡觀察各組BEAS-2B細胞的線粒體等細胞器形態(tài)（標尺：1μm）Fig.5 TEM of morphology of main organelle including mitochondrion in BEAS-2Bcells in various groups（bar=1μm）

2.4 激光共聚焦顯微鏡下觀察GF P-L C3熒光 熒光顯微鏡觀察顯示，對照組BEAS-2B細胞存在一定的綠色GFP-LC3熒光點；而LPS組熒光點較對照組顯著減少，綠色熒光彌散性分布于整個細胞中；與對照組和LPS組比較，LPS+LIG組熒光點數(shù)量顯著增加，且綠色熒光區(qū)域顯著聚集于熒光亮點中。見圖6。

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察各組BEAS-2B細胞的自噬小體（標尺：10μm）Fig.6 Laser confocal microscopy of autophagosomes in BEAS-2B cells of various groups（bar=10μm）

2.5 L I G對L PS誘導(dǎo)的B EA S-2B細胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達水平的影響 Western blot分析顯示，LPS組BEAS-2B細胞的細胞色素C和cleaved Caspase-3蛋白表達水平高于對照組，而LPS+LIG組較LPS組有所下降；同時與對照組比較，LPS組BEAS-2B細胞Bcl-2蛋白表達下調(diào)，LPS+LIG組有所提升。表明LIG可部分緩解LPS導(dǎo)致的BEAS-2B細胞凋亡。對照組中LC3-Ⅱ蛋白表達水平高于LPS組，而LPS+LIG組可部分恢復(fù)LC3-Ⅱ的表達水平。LPS組p62蛋白表達水平高于對照組，而LPS+LIG組p62表達水平下調(diào)。見圖7。結(jié)合透射電鏡和激光共聚焦顯微鏡結(jié)果，LPS可導(dǎo)致BEAS-2B細胞線粒體損傷和誘導(dǎo)凋亡，并抑制細胞自噬，而加入LIG可有效提高BEAS-2B細胞的自噬水平。

圖7 Western blot分析LIG處理前后各組BEAS-2B細胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白的變化Fig.7 Western blotting of expressions of apoptosis-and autophagy-associated proteinsin BEAS-2Bcellsof variousgroups

2.6 自噬抑制劑對L I G緩解L PS誘導(dǎo)的B EA S-2B細胞增殖和凋亡的影響 與對照組比較，LPS組BEAS-2B細胞存活率顯著下降，隨著LIG濃度的上升，細胞存活率逐漸提高；分別加入自噬抑制劑3-MA或HCQ后，LIG的保護作用幾乎完全消失。見圖8。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，LIG+LPS組細胞凋亡率（約8.0%）顯著低于LPS組（約25.2%），與對照組（約6.5%）相當；進一步加入自噬抑制劑3-MA或HCQ后，部分逆轉(zhuǎn)了LIG緩解LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細胞凋亡作用（細胞凋亡率分別約為23.4%和17.8%）。見圖9和圖10。上述結(jié)果提示，LIG對LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細胞損傷的治療作用可能是通過誘導(dǎo)細胞保護性自噬實現(xiàn)的。

圖8 各組BEAS-2B細胞的增殖情況Fig.8 Proliferation of BEAS-2B cells in various groups

圖9 流式細胞術(shù)檢測各組BEAS-2B細胞的凋亡情況Fig.9 Flow cytometry of apoptosis of BEAS-2B cells in various groups

圖10 各組BEAS-2B細胞的凋亡率Fig.10 Apoptosis rates of BEAS-2B cells in various groups

3 討 論

本研究通過體外試驗進一步驗證LPS對BEAS-2B細胞的損傷作用，同時也首次報道了LIG對于LPS誘導(dǎo)的肺上皮細胞的保護作用。研究表明，大多數(shù)肺部感染導(dǎo)致急性肺損傷的起因是多方面的，可能存在多個并發(fā)機制［9］，同時，許多肺組織損害均會直接影響肺泡和支氣管上皮細胞。前期研究也發(fā)現(xiàn)，LPS會顯著抑制鼠腎小管上皮細胞TCMK-1的活性，且隨著濃度的增加，細胞活性顯著降低。加入UA后，細胞活性有所增加，表明UA可改善LPS對TCMK-1的損傷［10］。ZHENG等［11］觀察到LPS處理HK-2細胞后，HK-2細胞呈圓形或梭形，輪廓不清，細胞-細胞連接較弱，黏附減少，HK-2細胞數(shù)量減少，提示LPS抑制HK-2細胞的生長。CCK-8試驗顯示，LPS同樣會抑制HK-2的活性。除了細胞壞死，研究還發(fā)現(xiàn)，LPS導(dǎo)致的肺上皮細胞死亡還包括凋亡和可能的自噬性死亡［12］。本研究通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，LPS處理的BEAS-2B細胞線粒體結(jié)構(gòu)被破壞，經(jīng)LIG處理后的細胞中自噬空泡增加，并觀察到受損的線粒體與自噬空泡融合，表明LIG可能通過誘導(dǎo)保護性自噬發(fā)揮作用。自噬是一種通過自噬小體和溶酶體融合后，靶向降解胞內(nèi)細胞器、蛋白質(zhì)等大分子的多步驟過程，降解的細胞內(nèi)容物被重新用于合成新的大分子和細胞器［13］。自噬在生理過程和許多疾病發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。在正常生理條件下，自噬通過控制受損蛋白質(zhì)和細胞器的周轉(zhuǎn)來維持細胞穩(wěn)態(tài)。在病理條件下，廣泛的細胞應(yīng)激，包括細胞饑餓、缺氧和氧化損傷等均會誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［14］。已有研究發(fā)現(xiàn)，BEAS-2B細胞存在基礎(chǔ)水平的自噬，且抑制自噬會加重LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細胞損傷，而增強自噬會減輕損傷，表明自噬對于BEAS-2B細胞損傷同樣可能存在保護作用［15］，這與本文的觀察一致。因此，本研究通過轉(zhuǎn)染GFP-LC3融合蛋白質(zhì)粒后觀察細胞自噬情況，并檢測相關(guān)分子的蛋白水平。轉(zhuǎn)染GFP-LC3后，觀察到對照組BEAS-2B細胞中存在綠色熒光點，表明BEAS-2B細胞存在一定基礎(chǔ)水平的自噬。加入LPS后，熒光點顯著減少，且Western blot分析顯示，LC3-Ⅱ蛋白水平下降。同時，LPS+LIG組較對照組和LPS組熒光點顯著增加，呈顯著聚集趨勢。且LC3-Ⅱ蛋白水平明顯升高，表明LIG可有效誘導(dǎo)自噬。LC3家族是哺乳動物細胞中自噬相關(guān)基因（autophagy related gene 8，ATG8）的同源物，目前被認為是一種自噬相關(guān)蛋白，LC3定位于自噬膜表面，參與自噬體的形成，其表達強度與自噬活性密切相關(guān)。LC3分為Ⅰ型和Ⅱ型，自噬啟動前LC3主要形式為LC3-Ⅰ，自噬啟動后LC3-Ⅰ通過泛素化作用與自噬膜上的磷脂酰醇結(jié)合形成LC3-Ⅱ，因此，LC3-Ⅱ的水平與自噬水平相關(guān)，常用于監(jiān)測自噬活性。p62又稱SQSTM1，是一種重要的選擇性自噬接頭蛋白，其可與LC3-Ⅱ結(jié)合，并靶向介導(dǎo)自噬溶酶體降解［16］。p62在自噬過程中會與結(jié)合的蛋白一起被降解，因此，自噬活性的增強會導(dǎo)致p62水平的下降。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS組BEAS-2B細胞p62表達水平顯著升高，而加入LIG后，p62表達水平顯著下降，與LC3-Ⅱ表達水平顯著升高相符合，表明LIG可誘導(dǎo)自噬以減少BEAS-2B細胞損傷。自噬水平的差異可能與LPS處理時間、濃度以及研究對象有關(guān)。上述結(jié)果均提示，細胞自噬可能與LPS導(dǎo)致的急性肺損傷相關(guān)，且增強保護性自噬對肺損傷可能發(fā)揮保護作用。

線粒體是復(fù)雜的細胞器，存在于每個有核的真核細胞內(nèi)，提供關(guān)鍵的功能，使復(fù)雜的有機體生存。線粒體是三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成的主要部位，在細胞凋亡、壞死、自噬、應(yīng)激調(diào)節(jié)、脂質(zhì)和碳水化合物的產(chǎn)生、鈣儲存及先天免疫中也起著關(guān)鍵作用［17］。因此，線粒體功能障礙與凋亡、衰老、基因組不穩(wěn)定、炎癥和代謝紊亂密切相關(guān)。線粒體功能損傷和功能障礙與急性肺損傷的發(fā)展也密切相關(guān)。博來霉素誘導(dǎo)的肺損傷模型中同樣觀察到線粒體減少、嵴破裂和晚期線粒體廣泛腫脹［18］。在重癥監(jiān)護病房中獲得的組織活檢的生化和結(jié)構(gòu)研究證明，在膿毒血癥患者中，肺組織線粒體損傷也明顯存在［19］。本研究未進一步探討自噬清除受損線粒體的上下游調(diào)控機制，同時由于技術(shù)條件的限制，未進行動物實驗進一步驗證LIG介導(dǎo)的自噬對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的保護作用。后續(xù)希望能夠進一步深入開展相關(guān)研究，并最終實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。