秦榮浦，田石華，江筠，劉敏，何成，楊宇峰，樓覺人

上海生物制品研究所第二研究室，上海200051

2型糖尿病為一種慢性代謝病，主要病理表現(xiàn)為高血糖癥及微血管并發(fā)癥，是影響人類生活的重大疾病之一。我國為糖尿病大國，2013年對慢性病及其危險因素監(jiān)測顯示，18歲及以上人群糖尿病患病率為10.4%［1］。二甲雙胍是治療2型糖尿病的常用一線藥，單獨使用降糖效果不佳時，可采用聯(lián)合用藥治療。目前主要聯(lián)合用藥包括磺脲類藥物、噻唑烷二酮類藥物、二肽基肽酶抑制劑、基礎胰島素及胰高血糖素樣肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）受體激動劑［2］。GLP-1受體激動劑為一種新型降血糖藥物，在增強患者血糖調(diào)控能力的同時還可減輕患者體重，降低心臟收縮壓，且低血糖風險率較低。這些獨特優(yōu)勢使GLP-1受體激動劑降糖藥物開發(fā)成為熱點［3］。

GLP-1主要由回腸及結腸的L細胞分泌，以葡萄糖濃度依賴性方式促進胰島素分泌，參與機體血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)［4］。GLP-1由30個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量小（3 000），易被體內(nèi)二肽基肽酶4降解及腎小球過濾清除，因此半衰期短，限制了其臨床應用［5］。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾劑作為改良藥物特性的修飾劑，是實現(xiàn)蛋白藥物在體內(nèi)半衰期延長的重要途徑之一［6］。采用特定結構的PEG修飾劑對GLP-1進行修飾，在保留其與GLP-1受體結合并發(fā)揮生物學效應的同時使其不易被酶快速降解，從而延長半衰期，增加GLP-1活性水平以達到藥理濃度。本研究前期對GLP-1分子序列進行優(yōu)化，得到生物學活性較優(yōu)的GLP-1衍生物（GLP-1analogue，GLP-1a），通過篩選不同結構、不同相對分子質(zhì)量PEG修飾劑，最終確定馬來酰亞胺活化的相對分子質(zhì)量40 000的PEG（MAL-PEG40K）修飾GLP-1a的產(chǎn)物MAL-PEG40K-GLP-1a降血糖效果顯著，半衰期長，具有良好的藥物開發(fā)前景［7］。

本研究用MAL-PEG40K定點修飾GLP-1a，通過強陽離子交換層析分離純化修飾混合物，并對修改產(chǎn)物部分性質(zhì)進行分析，以期開發(fā)出安全、長效的新型GLP-1受體激動劑。

1 材料與方法

1.1 細胞株及質(zhì)粒 HEK-293細胞株由上海生物制品研究所第二研究室保存；GLP-1受體質(zhì)粒及分泌型堿性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase，SEAP）報告基因質(zhì)粒購自蘇州欣賽生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 GLP-1a氨基酸序列（HAib-EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGRGC-NH2）及GLP-1a干粉由浙江中肽生物公司化學合成和制備；MAL-PEG40K購自廈門賽諾邦格生物科技有限公司，結構式見圖1；堿性磷酸酶二乙醇胺活性檢測試劑盒購自德國Sigma-Aldrich公司；POROSTM50 HS強陽離子交換填料購自美國Thermofisher公司；XBridgeshield 5μm C18反相色譜柱（3 mm×150 mm，5μm，130?）購自美國Waters公司；1200 infinity series高效液相色譜系統(tǒng)購自美國安捷倫公司；SpectraMax i3多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司；魚躍悅準Ⅳ型血糖儀及配套血糖測試試紙條購自魚躍醫(yī)療。

圖1 聚乙二醇修飾劑分子結構式Fig.1 Molecular structure of PEG as modifier

1.3 實驗動物 SPF級健康昆明小鼠80只，雌性，6～8周齡，體量18～22 g，由上海生物制品研究所實驗動物中心提供，合格證號：20092009002001612。于18～25℃、相對濕度50%～60%、晝夜循環(huán)照明環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，可自由攝食及飲水。

1.4 M AL-P EG40K-GL P-1a的制備 精確稱取100 mg GLP-1a干粉及200 mg MAL-PEG40K干粉，溶于5 mL 200 mmol／L PBS（pH 7.4）中，4℃振蕩反應1 h后，用檸檬酸緩沖液（pH 3.5）稀釋10倍，POROSHS強陽離子交換層析柱經(jīng)檸檬酸緩沖液平衡后，產(chǎn)物上樣，流速1 mL／min，用含1 mol／L NaCl的檸檬酸緩沖液線性洗脫，收集洗脫峰，0.5 mol／L NaOH洗脫雜質(zhì)，4℃保存。

1.5 M AL-P EG40K-GL P-1a性質(zhì)分析

1.5.1 純度

1.5.1.1 SDS-PAGE 取GLP-1a單體、修飾混合物、流穿峰、洗脫峰各20μL，進行12%SDS-PAGE，采用凝膠成像系統(tǒng)配套軟件對凝膠圖譜進行掃描分析。計算多肽PEG修飾率（PEG修飾后多肽條帶的灰度值占該泳道總蛋白灰度值百分比）及修飾產(chǎn)物純度。

1.5.1.2 反相高壓液相色譜法（RP-HPLC） 采用XBridge shield 5μm C18色譜柱，流動相A為0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B為0.1%三氟乙酸乙腈溶液，梯度程序：0~5 min 10%B液；5~30 min 10%～60%B液；30～35 min 95%B液。流速為0.5 mL／min，檢測波長為210 nm，柱溫為25℃，進樣體積為20μL。

1.5.2 體外活性保留率 采用報告基因法。報告基因分析是利用藥物作用后報告基因表達的變化來反映藥物的活性。將GLP-1受體質(zhì)粒及SEAP報告基因質(zhì)粒瞬時共轉染HEK-293細胞，6 h后加入GLP-1a單體及MAL-PEG40K-GLP-1a；44 h后取細胞上清，置65℃烘箱內(nèi)加熱30 min；取80μL細胞上清液至96孔板中，加入堿性磷酸酶預混檢測工作液，120μL／孔。酶標儀波長405 nm處檢測樣品吸光度值，以測定的報告基因堿性磷酸酶活性表示MAL-PEG40K-GLP-1a及GLP-1a的體外活性，獲得半數(shù)有效濃度EC50。按下式計算MAL-PEG40K-GLP-1a活性保留率。

1.5.3 體內(nèi)生物學活性 采用急性降血糖試驗。昆明小鼠試驗前一晚禁食不禁水12 h，次日早測基礎血糖值，記為0 h時血糖值。將80只小鼠隨機分為5組：PBS對照組（免疫劑量與試驗組一致）、10 nmol／kg GLP-1a組及10、15、30 nmol／kg MAL-PEG40K-GLP-1a組，每組16只，腹腔注射給藥。分別于2、5、8、11、13及24 h后剪尾取血，測血糖值。每次測血糖前30 min補充37%葡萄糖200μL。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 7軟件處理數(shù)據(jù)，試驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 M AL-P EG40K-GL P-1a純度

2.1.1 SDS-PAGE 經(jīng)12%SDS-PAGE分析，MALPEG40K對GLP-1a的修飾率為88%。修飾混合物通過強陽離子交換層析柱后，出現(xiàn)1個較大流穿峰及2個鹽洗脫峰（修飾產(chǎn)物及未修飾GLP-1a），修飾產(chǎn)物純度達95%。見圖2和圖3。

圖2 修飾混合物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE profile of modified mixture

圖3 修飾混合物的強陽離子交換層析圖譜Fig.3 Strong cation exchange chromatographic profile of modified mixture

2.1.2 RP-HPLC 結果顯示，MAL-PEG40K修飾產(chǎn)物的保留時間為23.92 min，純度為98.1%，見圖4。

圖4 修飾產(chǎn)物的RP-HPLC圖譜Fig.4 RP-HPLCprofile of modified product

2.2 M AL-P EG40K-GL P-1a的體外活性保留率 經(jīng)報告基因法檢測，GLP-1a單體的EC50為0.027 nmol／L，MAL-PEG40K-GLP-1a的EC50為0.118 nmol／L，MALPEG40K-GLP-1a活性保留率為22.9%，見圖5。

圖5 不同濃度GLP-1a及MAL-PEG40k-GLP-1a對堿性磷酸酶活性的影響Fig.5 Effect of different concentrations of GLP-1a and MALPEG40K-GLP-1a on activity of alkaline phosphatase

2.3 M AL-P EG40K-GL P-1a體內(nèi)生物學活性 結果顯示，GLP-1a經(jīng)MAL-PEG40K修飾后，仍具有較好的降血糖活性（血糖濃度明顯降低，且持續(xù)一定時間）。與GLP-1a單體比較，修飾產(chǎn)物表現(xiàn)出明顯的體內(nèi)穩(wěn)定性，降血糖持續(xù)時間延長。同時，MAL-PEG40K-GLP-1a降血糖活性具有劑量依賴性，一定范圍內(nèi)，隨著藥物劑量增高，降血糖活性增強。見表1。

表1 各組小鼠不同時間的血糖濃度（mmol／L，±s，n=16）Tab.1 Blood sugar concentrations of mice in various groups at various time points after injection（mmol／L，±s，n=16）

表1 各組小鼠不同時間的血糖濃度（mmol／L，±s，n=16）Tab.1 Blood sugar concentrations of mice in various groups at various time points after injection（mmol／L，±s，n=16）

注：aa表示與PBS對照組比較，P＜0.01（F為3.925～12.770）。與10 nmol／kg GLP-1a組比較，b表示P＜0.05（F=2.61）；bb表示P＜0.01（F為2.94～7.40）。

組別 0 h 2 h 5 h 8 h 11 h 13 h 24 h PBS對照 5.05±0.5 23.42±3.8 20.73±2.6 16.77±2.5 16.88±5.4 16.18±3.6 18.65±4.5 10 nmol／kg GLP-1a 5.76±1.1 11.00±2.1aa 14.20±4.4aa 11.47±5.7aa 14.27±6.2 14.18±6.0 15.57±7.3 10 nmol／kg MAL- 5.48±0.6 8.51±1.9aa 6.26±2.1aa，bb 8.26±2.3aa 5.05±0.5aa，bb 5.35±2.9aa，bb 11.55±6.9aa，bb PEG40K-GLP-1a 15 nmol／kg MAL- 5.28±0.9 7.43±3.5aa，b 5.05±4.2aa，bb 5.90±3.0aa，bb 4.88±4.4aa，bb 5.17±4.4aa，bb 13.15±5.1 PEG40K-GLP-1a 30 nmol／kg MAL- 5.65±0.5 6.18±2.6aa，bb 4.52±0.9aa，bb 4.15±1.2aa，bb 4.20±1.1aa，bb 4.07±2.1aa，bb 11.25±6.1aa，bb PEG40K-GLP-1a

3 討論

PEG修飾需遵循一個基本原則是修飾蛋白的藥效要顯著優(yōu)于其前體蛋白。一般可用藥代動力學和藥效學兩種指標衡量［8］，前者用藥物在體內(nèi)的半衰期表示，后者用藥物與受體的親和力表示。PEG修飾能延長蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的半衰期，但PEG引起的位阻效應會導致其與受體的親和力下降，表現(xiàn)為活性下降。因此在進行PEG修飾時，應充分考慮蛋白質(zhì)藥物特征來選擇合適的修飾策略及位點，以期得到最適的修飾效果。

RUNGE等［9］用Ala逐一替代GLP-1多肽鏈中的氨基酸殘基，通過檢測胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶活力得到其受體激動活力保留率，發(fā)現(xiàn)GLP-1的N-端序列在激活配體產(chǎn)生效應應答方面具有十分重要作用。2010年，UNDERWOOD等［10］通過磁共振技術發(fā)現(xiàn)GLP-1與GLP-1受體通過雙結構域（即受體結合結構域和受體激活結構）機制發(fā)生相互作用。其中GLP-1 N-端為受體激活結構域，通過與受體的跨膜區(qū)相互作用，激活受體下游結合的激動型G蛋白，進而引發(fā)信號應答。因此，為最大程度保留GLP-1生物學活性，PEG修飾位點應盡可能遠離N-端。本研究將PEG修飾位點放在C-端，通過在C-末端引入1個游離半胱氨酸殘基來實現(xiàn)PEG的定點修飾。修飾用PEG分子的選擇主要從PEG修飾活性基團、PEG相對分子質(zhì)量及線型／分支型三方面考慮。相對分子質(zhì)量大的分支型PEG具有更大空間位阻，因而能有效屏蔽蛋白質(zhì)表面抗原位點及酶解位點，使修飾蛋白的活性保留率更高。通過大量前期篩選實驗，最終確定相對分子質(zhì)量40 000的分支型具有馬來酰亞胺活化基團的MAL-PEG40K作為PEG修飾劑。

在pH 6.5～7.5條件下，MAL-PEG40K分子中馬來酰亞胺活性基團可與蛋白質(zhì)中游離巰基發(fā)生親核加成［11］，形成穩(wěn)定共價鍵，獲得MAL-PEG40K-GLP-1a復合物。MAL-PEG40K-GLP-1a與GLP-1a單體比較，部分理化性質(zhì)發(fā)生了改變，如等電點、溶解度、沉降系數(shù)等，這些變化導致了其藥學性質(zhì)的改善，主要包括物理和熱穩(wěn)定性提升、體內(nèi)半衰期延長及免疫原性降低等。采用離子交換層析進行目標產(chǎn)物的分離純化，GLP-1a理論等電點為5.45，在pH為3.5上樣緩沖液中，GLP-1a及MAL-PEG40K-GLP-1a均帶有正電荷，吸附于柱上。用鹽梯度線性洗脫時，由于PEG側鏈的電荷屏蔽作用，MAL-PEG40K-GLP-1a先于GLP-1a被鹽梯度洗脫，從而實現(xiàn)目的產(chǎn)物分離。但在樣品上樣過程中發(fā)現(xiàn)有大量目標產(chǎn)物未能吸附在離子柱上而直接流穿，即使繼續(xù)降低上樣pH值，仍收效甚微。分析原因可能是GLP-1a相對分子質(zhì)量小，帶電荷數(shù)少，加上PEG覆蓋于多肽表面，阻礙了多肽與離子交換樹脂側鏈的結合，因而大量目的產(chǎn)物流穿，降低了目的產(chǎn)物的回收率。

PEG位阻效應引起的受體親和力下降也體現(xiàn)在報告基因體外細胞試驗中。相較GLP-1a單體，修飾產(chǎn)物的活性保留率僅為22.9%，這也是由于PEG側鏈遮蔽了GLP-1衍生物與受體結合的特定位點。由于修飾產(chǎn)物MAL-PEG40K-GLP-1a相對分子質(zhì)量大，降低了腎臟清除率，抗酶降解能力增強，因此，體內(nèi)降血糖時間明顯延長，活性明顯提高。小鼠體內(nèi)急性降血糖試驗中，MAL-PEG40K-GLP-1a的降血糖效果及體內(nèi)半衰期均明顯強于GLP-1a單體，初步提示經(jīng)PEG修飾的GLP-1a在體內(nèi)降血糖持續(xù)時間得到延長，具體半衰期研究有待進一步試驗探究。

綜上所述，MAL-PEG40K定點修飾GLP-1a的方法簡便可行，制備的修飾產(chǎn)物藥學性質(zhì)得到改善，下一步將對其進行更深入研究，以期開發(fā)出安全、長效的GLP-1受體激動劑。