王晰，文朝朝，魏艷，王海龍，郭睿，趙虹，張棟，弓韜，于保鋒

山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，山西太原030000

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）甲基化是mRNA最常見的內部修飾，有研究表明，m6A修飾異常參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［1］。YTH N6-甲基腺苷（m6A）RNA結合蛋白1［YTHN6-methyladenosine（m6A）RNA binding protein 1，YTHDF1］是一種可與轉錄后經m6A修飾的RNA結合，從而提高mRNA翻譯效率的蛋白質［2］。有研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制YTHDF1的表達可顯著抑制結直腸癌細胞的體外致瘤性和小鼠異種移植瘤的體內生長［3］。另外，HAN等［4］發(fā)現(xiàn)，YTHDF1蛋白缺失可減緩小鼠腫瘤的生長，這種抗癌機制是通過增強T細胞對腫瘤抗原提呈和CD8+T細胞反應來實現(xiàn)的。有研究顯示，YTHDF1蛋白缺失導致樹突細胞（dendritic cell，DC）中m6A無法被識別，使溶酶體組織蛋白酶合成減少，腫瘤抗原分解減少，腫瘤抗原呈遞增加，從而抑制腫瘤發(fā)生。因此，本研究對YTHDF1的理化性質、結構等方面進行分析，旨在為以YTHDF1作為靶點的腫瘤治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 YTH D F1蛋白序列獲取及其理化性質分析 通過美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的蛋白質數(shù)據庫（https:／／www.ncbi.nlm.nih.gov）／搜索獲得人YTHDF1蛋白氨基酸序列。應用ExPASy的ProtParam工具（https:／／web.expasy.org／protparam／）分析YTHDF1的相對分子質量、等電點、氨基酸組成、分子式及酸堿性。

1.2 YTH D F1的親疏水性分析 應用ExPASy的Protscale工具（https:／／web.expasy.org／protscale／）分析YTHDF1的親疏水性。

1.3 YTH D F1的信號肽及跨膜區(qū)域預測 應用SignalP 4.0 Serve（rhttp:／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP-4.0／）軟件分析YTHDF1蛋白是否含有信號肽。應用TMHMM Server v.2.0（http:／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）軟件對YTHDF1的跨膜區(qū)域進行預測。

1.4 YTH D F1組織表達特異性分析 應用NCBI的UniGene庫檢索YTHDF1，應用EST了解人YTHDF1在組織中的表達情況，以TPM（Transcripts Per Million）值進行評價。

1.5 YTH D F1的亞細胞定位分析 應用PSORTⅡ（https:／／psort.hgc.jp／form2.html）對YTHDF1的亞細胞定位進行分析。

1.6 YTH D F1的二級結構及高級結構預測 應用SOPMA（https:／／npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）軟件分析YTHDF1的二級結構。應用SWISS-MODEL（https:／／swissmodel.ex pasy.org／）軟件分析YTHDF1的高級結構。

1.7 與YTH D F1相互作用的蛋白質預測 應用STRING數(shù)據庫（https:／／string-db.org／），設置高置信度0.7，蛋白數(shù)量少于20個，可得到與YTHDF1相互作用的蛋白質。并通過GO分析YTHDF1的生物學過程、分子功能及Reactome通路。

1.8 YTH D F1蛋白進化樹的構建 將YTHDF1蛋白氨基酸序列的FASTA格式輸入至BLAST，通過BLAST比對，獲得不同物種的YTHDF1蛋白氨基酸序列比對，并應用MEGA 7軟件，通過Neighbor-joining統(tǒng)計方法及Bootstrap（自展法）檢測方法構建YTHDF1蛋白系統(tǒng)進化樹。

2 結果

2.1 YTH D F1的基本理化性質 YTHDF1的基因位于20號染色體（20q13.33），含有6個外顯子，在甲狀腺、骨髓等25個組織中普遍表達，人YTHDF1相對分子質量為60 873 610，分子式為C2687H411-0N758O837S14，原子總數(shù)為8 406，是由559個氨基酸組成的多肽，其中絲氨酸所占的比例最高（11.8%）。YTHDF1的等電點為8.86，在序列中帶負電荷的酸性氨基酸（Asp+Glu）總數(shù)為46，帶正電荷的堿性氨基酸（Arg+Lys）總數(shù)為52，可見YTHDF1為堿性蛋白質。YTHDF1在體外哺乳動物網織紅細胞中估計半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為54.56，為不穩(wěn)定蛋白質，脂肪族指數(shù)為55.80。

2.2 YTH D F1的親疏水性 YTHDF1的親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，親水性總平均值為-0.741，為親水蛋白。其中，第207位的纈氨酸疏水性最強，為1.756；第554位的谷氨酰胺親水性最強，為-3.622。見圖1。

圖1 YTHDF1的親疏水性分析Fig.1 Hydrophilic-hydrophobic analysis of YTHDF1

2.3 YTH D F1的信號肽及跨膜區(qū)域預測 YTHDF1蛋白不具有信號肽序列，第14位氨基酸處C值達最高，為0.111；第57位氨基酸處Y值達最高，為0.103；第51位氨基酸處信號肽S值達最高，為0.108；1~56位氨基酸的平均信號肽值為0.093，D值為0.097。按平均S值>0.5為信號肽的標準判斷，YTHDF1蛋白1~56位氨基酸平均S值為0.093，因此判斷YTHDF1無信號肽序列及信號肽切割位點。見圖2。YTHDF1蛋白位于膜外的概率幾乎為100%，位于跨膜區(qū)和膜內的概率基本為0，預測無跨膜結構，見圖3。

圖2 YTHDF1蛋白的信號肽分析Fig.2 Analysis of signal peptide of TYTHDF1

圖3 YTHDF1蛋白的跨膜區(qū)域分析Fig.3 Analysis of transmembrane domain of YTHDF1

2.4 YTH D F1組織表達特異性 YTHDF1在正常和腫瘤組織中均有表達。在正常組織中的TPM值分別為：胃135、淋巴135、心臟78、骨69、肺62、皮膚56、腦40、胸腺25、血管19；在腫瘤組織中的TPM值分別為：胃腸道腫瘤168、膠質瘤139、白血病137、淋巴瘤96、軟骨肉瘤72、食管癌57、結直腸腫瘤35、肝癌10。其中在胃腸道腫瘤TPM值最高。

2.5 YTH D F1的亞細胞定位 YTHDF1定位于細胞核的概率最高，為60.9%，定位于細胞質的概率為17.4%，定位于線粒體的概率均為17.4%，定位于液泡膜的概率為4.3%。

2.6 YTH D F1的二級及三級結構預測 YTHDF1蛋白的二級結構含12.88%的α-螺旋、3.58%的β-轉角、12.70%的延伸鏈、70.84%的無規(guī)卷曲，其中無規(guī)卷曲是主要結構，見圖4。YTHDF1蛋白的GMQE（Global Model Quality Estimation）為0.25，QMEAN（Qualitative Model Energy Analysis）為0.18，該三維結構是365~539位氨基酸的部分蛋白質結構，大部分為α-螺旋，與二級結構預測相符。YTHDF1蛋白無規(guī)卷曲所占比例較大，具體空間結構建模較困難，因此只構建了部分蛋白結構，見圖5。

圖4 YTHDF1的二級結構分析Fig.4 Analysis of secondary structure of YTHDF1

2.7 與YTH D F1相互作用的蛋白質分析 與YTHDF1相互作用的蛋白質包括WTAP、METTL3、FTO、METTL14、ALKBH5，見圖6。YTHDF1蛋白主要參與RNA的轉錄后修飾等生物學過程，促進mRNA甲基轉移酶活性等分子功能，Reactome通路顯示，涉及前體mRNA的加工修飾及互作蛋白基因參與細胞對DNA損傷刺激的反應和DNA損傷修復。且生物學過程也顯示，互作蛋白基因參與細胞對DNA損傷刺激的反應和DNA損傷修復，推測YTHDF1可能通過此種方式促進腫瘤生長。見表1。

表1 GO分析結果Tab.1 GObiological process

圖6 YTHDF1相互作用蛋白分析Fig.6 Protein-protein interaction network of YTHDF1

2.8 YTH D F1蛋白進化樹的構建 人與獼猴的YTHDF1之間差異最小，而與黑猩猩YTHDF1之間差異最大。除象外，其他物種之間自展值均大于50%。通過NCBI比對人與黑猩猩、獼猴、狨猴、馬、小鼠、河貍、象、刺猬的YTHDF1蛋白氨基酸序列，相似度分別為99.61%、98.39%、97.32%、94%、93.92%、92.82%、91.77%、90.52%，符合物種進化程度，證明YTHDF1蛋白在進化過程中高度保守，見圖7。

圖7 YTHDF1蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of YTHDF1

3 討論

RNA甲基化是轉錄產物表達的關鍵調節(jié)因子，最常見的RNA甲基化為m6A修飾，發(fā)生在約25%全基因組的轉錄過程中，且在終止密碼子、5′-和3′-非編碼區(qū)域及長內部外顯子內富集，可調節(jié)RNA剪接、易位、穩(wěn)定性和翻譯過程。m6A由RNA甲基轉移酶METTL3、METTL14和METTL16催化，被去甲基化酶FTO和ALKBH5降解，并與m6A結合蛋白（如YTHDF1和IGF2BP1）相互作用［5］。近年研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用，其中LIN等［6］發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞轉移的重要步驟上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程中，m6A修飾的mRNA在癌細胞中數(shù)量增加，而METTL3缺失降低了m6A的表達，影響癌細胞在體內外的遷移、侵襲和EMT。作為識別m6A的關鍵因子，YTHDF1促進腫瘤發(fā)生的一種機制是其能夠促進樹突狀細胞組織蛋白酶的翻譯，造成腫瘤抗原被降解，從而限制樹突狀細胞抗原呈遞［7］。

YTHDF1蛋白與腫瘤的高度相關性及其促進腫瘤發(fā)生的機制尚未明確。本研究對YTHDF1蛋白的理化性質、結構、表達模式、細胞定位、相互作用蛋白及分子功能進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)，YTHDF1蛋白是一種不穩(wěn)定的堿性親水蛋白質，無信號肽，無跨膜區(qū)；二級結構主要由無規(guī)卷曲構成；在多種腫瘤中高表達，在胃腸道腫瘤中表達最高。有研究表明，YTHDF1可在細胞質中促進蛋白翻譯［2］，與本研究結果一致。但通過細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，YTHDF1可能部分或更多定位在細胞核中，而預測YTHDF1的跨膜區(qū)域結果顯示，YTHDF1定位于膜外概率最大，推測YTHDF1能通過某種方式進入胞質與胞核。YTHDF1的功能分析發(fā)現(xiàn)，YTHDF1參與mRNA剪接，推斷YTHDF1在細胞質中可通過促進蛋白翻譯促進腫瘤發(fā)生，可能在細胞核中通過其他機制促進腫瘤發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF1可能參與DNA損傷修復反應，DNA修復能力降低可使腫瘤細胞對藥物產生超敏反應，增加化療藥物的療效［8］。目前化療仍是治療腫瘤的重要手段之一，大部分化療藥物通過阻斷腫瘤細胞的DNA復制，導致DNA損傷，誘導腫瘤細胞凋亡，達到殺死腫瘤細胞的目的。而腫瘤可進化出更高效的DNA復制和DNA損傷修復系統(tǒng)，能夠修復化療藥物造成的損害，導致耐藥性的產生［9-10］，推測YTHDF1可通過促進DNA損傷修復來減小化療藥物的作用。用STRING數(shù)據庫找到的YTHDF1的相互作用蛋白，在BioGRID數(shù)據庫中找不到，通過STRING數(shù)據庫更多找到的是與YTHDF功能上的相互關聯(lián)，且可能相互結合的蛋白，而BioGRID數(shù)據庫中列出的是已有相關實驗證實的相互作用蛋白。因此認為基于功能的預測更有意義。

本研究表明，YTHDF1蛋白參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但本研究并未通過過表達或敲除YTHDF1確認其對某種腫瘤發(fā)生的影響，YTHDF1是如何促進蛋白的翻譯，如何調節(jié)mRNA的剪切及DNA損傷修復，均需今后進一步深入研究。