馬瑞琳，鄧燕，孫愛軍

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，國家婦產(chǎn)疾病臨床研究中心，北京 100730)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女常見的內(nèi)分泌和代謝紊亂性疾病。肥胖和胰島素抵抗(IR)是PCOS患者的常見特征，同時也是PCOS發(fā)生發(fā)展以及PCOS遠期并發(fā)癥(2型糖尿病和心血管疾病)的危險因素，因此，調(diào)整生活方式和二甲雙胍被廣泛應(yīng)用于PCOS患者的治療[1]。腸道菌群失調(diào)與肥胖和IR的發(fā)生密切相關(guān)，將正常體重人群的腸道菌群移植至代謝綜合征患者腸道可以改善患者IR也間接證明了這一結(jié)論[2]。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動劑是一種新型抗糖尿病藥物，近年來也應(yīng)用于PCOS的治療，它可以改善IR和糖耐量異常，還可通過延緩胃排空，增加飽腹感達到減重的效果[3]。已有研究表明GLP-1受體激動劑利拉魯肽減重的作用與其調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)[4]。然而，對于超重或肥胖的PCOS患者，GLP-1受體激動劑和二甲雙胍對腸道菌群的影響仍需要進一步闡明。

艾塞那肽微球是一種長效GLP-1受體激動劑，在本研究中，我們假設(shè)艾塞那肽和二甲雙胍在改善超重/肥胖PCOS患者體重和血糖的同時優(yōu)化了PCOS患者腸道菌群的結(jié)構(gòu)，因此，我們通過收集超重/肥胖PCOS患者接受艾塞那肽聯(lián)合二甲雙胍或單用二甲雙胍干預(yù)治療3個月前后的糞便樣本，利用16S rRNA高通量基因測序技術(shù)描述和量化樣本中的微生物α和β多樣性，并研究其物種差異，以期為PCOS患者的治療提供新思路。

材料與方法

一、研究對象與設(shè)計

本研究中的34例PCOS患者(符合鹿特丹標準[5]；BMI≥25 kg/m2)為一項隨機單中心對照試驗(ClinicalTrials.gov，NCT04029272)的患者亞群，該試驗于2019年7月至2020年12月在北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科進行。

根據(jù)計算機生成的隨機數(shù)表，按照1∶1的比例將患者隨機分為2個治療組：聯(lián)合組(17例)和單藥組(17例)。聯(lián)合組患者給予二甲雙胍(中美上海施貴寶)500 mg口服，每日3次，聯(lián)合艾塞那肽(阿斯利康，美國)2 mg皮下注射，每周1次；單藥組患者單用二甲雙胍500 mg，每日3次。

比較二甲雙胍聯(lián)合艾塞那肽對比單用二甲雙胍治療12周對超重/肥胖PCOS患者體重的影響；腸道菌群組成分析為次要終點。本研究按照“赫爾辛基宣言”進行，并經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會批準。所有參與者在研究開始前都簽署了知情同意書。

34例患者在基線及治療12周后分別留取新鮮糞便標本。所有患者均自月經(jīng)或黃體酮撤退出血的第1天起給予達英-35治療，連續(xù)21 d，停藥7 d后開始下一周期。所有患者在留取糞便標本前1個月內(nèi)未使用抗生素，前7 d內(nèi)未飲用酸奶。

二、人體測量學(xué)、內(nèi)分泌、代謝指標評估

兩組患者在12周治療前后均測量腰圍、體重，計算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)；在基線和治療12周后，隔夜禁食12 h后于早上進行標準的75 g口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)，分別于0、30、60、120 min測定血糖和胰島素水平?？崭寡獦舆€用于測量糖化血紅蛋白(HbA1c)、性激素、血脂、全血計數(shù)、C反應(yīng)蛋白以及肝腎功能標志物。

采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法(Beckman Coulter DXI 800免疫分析系統(tǒng))檢測總睪酮(TT)和硫酸脫氫表雄酮(DS)。采用標準自動化檢測方法(Beckman AU系列全自動化學(xué)分析儀)檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、高敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)和血糖濃度。采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法(Siemens Centaur XP免疫分析系統(tǒng))測定血清胰島素濃度。胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)模型(HOMA-IR)=空腹血清胰島素(mIU/L)×空腹血糖(FBG，mmol/L)/22.5；定量胰島素敏感性檢查指數(shù)(QUICKI)=1/(Log[空腹胰島素(FINS，mIU/L)]+Log[FBG(mg/dl)])。

三、糞便DNA提取和16S rRNA基因測序

在藥品分發(fā)當日及試驗結(jié)束后的早上留取新鮮糞便標本，并立即保存在-80℃用于分析。使用E.Z.N.A.soil DNA Kit(Omega Bio-tek，美國)抽提微生物總DNA，使用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增。每個樣本重復(fù)3次。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，美國)進行純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTMFluorometer(Promega，美國)對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組治療前后的臨床指標變化

1.體重相關(guān)指標變化：兩組患者在治療12周后體重、BMI和腰圍均顯著下降(P<0.05)，聯(lián)合組較單藥組減輕更多體重，但組間無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

2.雄激素變化：兩組患者治療后的TT水平均顯著下降(P<0.05)，DS水平無顯著變化(P>0.05)。兩組藥物降低TT的療效無顯著差異(P>0.05)(表1)。

3.糖代謝、hsCRP變化：聯(lián)合組患者治療12周后FBG、OGTT-2 h血糖(OGTT-2 h BG)、OGTT-2 h胰島素(OGTT-2 h INS)和HbA1c水平均顯著下降(P<0.05)，單藥組患者僅HbA1c水平顯著下降(P<0.05)。聯(lián)合組治療降低FBG、OGTT-2 h BG和OGTT-2 h INS水平的療效優(yōu)于單藥組(P<0.05)。兩種治療方法對FINS水平、HOMA-IR、QUICKI指數(shù)值及hsCRP均無顯著影響(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者治療前后的各指標比較[(-±s)，M(IQR)]

二、兩組治療前后腸道菌群的變化

68份糞便標本共獲得3 287 785個有效序列，按照97%相似性對非重復(fù)序列進行OTU聚類，共劃分為846個OTU。

1. α多樣性分析：Shannon曲線(圖1A)趨于平坦，表明測序深度足夠獲取我們樣本中的大部分OTU。Chao指數(shù)(圖1B)在兩組患者中組間及組內(nèi)均無顯著性差異(P>0.05)；Shannon指數(shù)(圖1C)在單藥組無顯著變化(P>0.05)，在聯(lián)合組呈下降趨勢但變化不顯著(P>0.05)。兩組患者治療前的Shannon指數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，但治療后聯(lián)合組顯著低于單藥組(P<0.05)，提示艾塞那肽聯(lián)合二甲雙胍治療可導(dǎo)致腸道菌群多樣性的降低。

2. PCoA分析：PCoA分析表明艾塞那肽聯(lián)合二甲雙胍治療與單獨二甲雙胍治療對超重/肥胖PCOS患者腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響不同(圖2A)。聯(lián)合組治療顯著改變了超重/肥胖PCOS患者腸道菌群的結(jié)構(gòu)(圖2B，P=0.02)，PC1和PC2軸對差異的解釋度分別為14.93%和11.71%；而單藥組對腸道菌群結(jié)構(gòu)無顯著影響(圖2C，P=0.10)，PC1和PC2軸對結(jié)果的解釋度分別為16.04%和12.68%。

A：利用Shannon指數(shù)構(gòu)建稀疏曲線；B：Chao指數(shù)比較；C：Shannon指數(shù)比較;相互比較，*P<0.05圖1 不同方案治療前后的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)——α多樣性分析

A：主坐標分析(PCoA)所有患者治療前后的群落相似性；B：PCoA 分析聯(lián)合組治療前后的群落相似性；C：PCoA分析單藥組治療前后的群落相似性圖2 不同方案治療前后的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)——PCoA分析

3.群落組成與物種差異分析：兩組患者治療前后的腸道菌群在門、綱、科、屬水平的群落Bar圖見圖3A～D。在門水平上，4組菌群組成以厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門為主(圖3A)。

兩組患者治療前后腸道菌群門、屬水平群落豐度比較見圖4A～D。聯(lián)合組治療后厚壁菌門、擬桿菌門和綠彎菌門豐度顯著降低，變形菌門豐度顯著增加(P<0.05)(圖4A)。單藥組治療后糞桿菌屬豐度顯著增加(P<0.05)(圖2D)。聯(lián)合組擬桿菌門/厚壁菌門比值在治療后顯著低于治療前[(0.01±0.02)vs.(0.05±0.07)，P=0.01]，單藥組擬桿菌門/厚壁菌門比值在治療前后無顯著變化[(0.04±0.06)vs.(0.05±0.06)，P=0.26]。

A：門水平；B：綱水平；C：科水平；D：屬水平圖3 不同方案治療前后的腸道菌群群落豐度Bar圖

A：聯(lián)合組門水平；B：聯(lián)合組屬水平；C:單藥組門水平；D：單藥組屬水平；*P<0.05,**P<0.01圖4 不同方案治療前后的腸道菌群群落豐度比較

討 論

本研究首次探討了艾塞那肽聯(lián)合二甲雙胍對比單用二甲雙胍對超重或肥胖PCOS患者腸道菌群的影響，我們發(fā)現(xiàn)艾塞那肽干預(yù)可降低超重或肥胖PCOS患者腸道菌群的多樣性，改變菌群物種組成。

腸道菌群結(jié)構(gòu)和活性的變化與多種代謝紊亂疾病有關(guān)，包括肥胖、糖尿病和心血管疾病等[6-7]。已有研究表明，肥胖患者的腸道菌群表現(xiàn)為微生物多樣性減少，厚壁菌門增多和擬桿菌門減少[8]。一些益生菌及其混合物被報道可通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)來改善疾病代謝狀態(tài)。例如，動物雙歧桿菌乳亞種GCL2505可以改善代謝綜合征患者糖耐量異常，抑制內(nèi)臟脂肪積累，且該類益生菌顯著增加了放線菌門的豐度，但不影響擬桿菌門/厚壁菌門比值[9]。此外，Graessler等[10]發(fā)現(xiàn)Roux-en-Y胃旁路術(shù)后的2型糖尿病肥胖患者體重明顯減輕，代謝狀態(tài)明顯改善，同時糞便菌群中厚壁菌門和擬桿菌門減少，變形菌門增加。這些都表明，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)被認為是改善代謝紊亂的一種新興的治療策略。

肥胖是PCOS患者的普遍特征，腸道菌群失調(diào)與PCOS密切相關(guān)。腸道菌群失調(diào)可引起IR、高雄激素血癥和慢性炎癥等，并可能通過影響能量吸收、短鏈脂肪酸(SCFA)途徑、脂多糖釋放、腸黏膜通透性和腦-腸軸促進PCOS的發(fā)生[11]。GLP-1受體激動劑是一種新型抗糖尿病藥物，作用于腸道L細胞GLP-1受體，發(fā)揮“腸促胰素效應(yīng)”，可有效改善IR和糖耐量異常，還可通過延緩胃排空、增加飽腹感減輕體重[3]。大鼠試驗研究發(fā)現(xiàn)GLP-1受體激動劑利拉魯肽可通過調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加擬桿菌門物種豐度及擬桿菌門/厚壁菌門比值減輕肥胖者體重[4]。而在本研究中，盡管艾塞那肽干預(yù)后超重或肥胖PCOS患者體重下降明顯，但腸道菌群中厚壁桿菌門與擬桿菌門豐度均下降，擬桿菌門與厚壁菌門的比值較治療前亦下降。既往有研究表明厚壁菌門/擬桿菌門比值與肥胖呈正相關(guān)，但研究對象多是排除飲食、運動等混雜變量后的轉(zhuǎn)基因動物或嚴格控制的人類受試者[7，12]。當研究對象為不受限制的人類受試者時，反而得出相反的結(jié)論，雖然DNA提取方案和引物設(shè)計的方法差異也會導(dǎo)致微小的差異[13]。在我們的研究中，研究對象為飲食運動不受限制的人類受試者，這可能是我們研究中獲得的結(jié)果不同于上述結(jié)果的最可能解釋。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍治療沒有改變超重/肥胖PCOS患者腸道菌群的豐富度和多樣性，但顯著增加了菌群中糞桿菌屬的豐度。有研究報道糞桿菌屬豐度的升高與2型糖尿病病情緩解有關(guān)[14]。我們的結(jié)果與既往二甲雙胍對PCOS模型小鼠腸道菌群影響的結(jié)果不同，Xue等[15]報道二甲雙胍治療顯著降低了PCOS模型小鼠腸道螺桿菌屬的豐度。研究對象和腸道菌群檢測方法的不同可能是造成差異的原因。

綜上所述，我們的研究初步證明艾塞那肽可以調(diào)節(jié)超重或肥胖PCOS患者腸道菌群的結(jié)構(gòu)，包括抑制菌群豐度和多樣性，提高厚壁菌門/擬桿菌門比值，且不同于二甲雙胍對腸道菌群的影響。然而，需要更嚴謹?shù)难芯吭O(shè)計和更深入的分析來闡明艾塞那肽如何通過調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮對超重/肥胖PCOS患者的療效。