楊金軒，羅榮華，陳 歡，鄭永唐△

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2.中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223）

他汀類藥物是羥甲戊二酰輔酶A還原酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，自美國(guó)FDA于1987年批準(zhǔn)洛伐他汀上市以來(lái)，先后出現(xiàn)了辛伐他汀、氟伐他汀、瑞舒伐他汀、普伐他汀及阿托伐他汀等（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1），其具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)一氧化氮合成、改善內(nèi)皮功能等多種藥理作用，主要用于心血管疾病的治療[1-2]。

圖1 他汀類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）主要攻擊宿主的CD4+T細(xì)胞，引起細(xì)胞耗竭、免疫缺陷，最后出現(xiàn)威脅生命的機(jī)會(huì)性感染。當(dāng)前治療艾滋病最為有效的方法仍然是聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（combined antiretroviral therapy，cART），可以將病毒載量控制在檢測(cè)限水平以下、恢復(fù)和穩(wěn)定CD+T細(xì)胞的數(shù)量、降低炎癥及免疫激活標(biāo)志物水平，但有研究顯示HIV感染者經(jīng)cART治療后產(chǎn)生的相關(guān)代謝疾病會(huì)使心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加[3-6]。HIV相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病涉及的機(jī)制是復(fù)雜的，不僅與血脂異常、胰島素抵抗及高血壓等傳統(tǒng)因素相關(guān)，也和HIV感染產(chǎn)生的慢性炎癥及免疫激活與抑制有關(guān)[7-9]。

隨著“發(fā)現(xiàn)即治療”策略的出現(xiàn)，使艾滋病從致死性疾病轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢灾委煹y以治愈的慢性疾病，延長(zhǎng)了患者的存活期，HIV感染者老齡化和長(zhǎng)期cART治療也勢(shì)必增加心血管疾病的患病率。他汀類藥物具有廣泛的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，這對(duì)HIV感染人群是十分有益的。目前他汀藥物如何調(diào)節(jié)HIV患者免疫功能的機(jī)制尚未完全闡明，有研究顯示他汀類藥物可能具有抗HIV活性[10]。本研究想探尋他汀類藥物的抗HIV活性機(jī)制并在體外評(píng)價(jià)匹伐他汀與其它抗HIV藥物聯(lián)合用藥時(shí)的聯(lián)合抗病毒效應(yīng)，旨在尋求適宜的聯(lián)合用藥方案。

1 材料與方法

1.1 試劑 噻唑藍(lán)（3，（4，5-dimethylthiazol-2-yl，噻唑藍(lán)）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、Triton X-100、青霉素、Tween 20和抗IgG Fc抗體（Sigma公司產(chǎn)品）；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（KPL公司）；十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）（BioFR0XX 公司）；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）（VWR Life Science AMRESCO 公司）；硫酸鏈霉素（Solarbio公司）；N，N-二甲基甲酰胺DMF（N，N-dimethylformamine，DMF）（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；30%過(guò)氧化氫（西隴科學(xué)股份有限公司）；RPMI-1640和胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco公司）；脫脂奶粉（內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司）；抗HIV p24單克隆抗體和兔抗HIV-1 p24多克隆抗體（本實(shí)驗(yàn)室）。

1.2 儀器 離心機(jī)（Allegra X-30，Beckman），二級(jí)生物安全柜（1287，Thermo），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（3111，Thermo），2～8 ℃冰箱（HYC-360，Haier），-20 ℃冰箱（BCD-196E/D，Haier），-80 ℃冰箱 （386L，－86 ℃，Thermo），酶標(biāo)儀（800TS，Bioteck），倒置顯微鏡（TS-100F，Nikon）。

1.3 待測(cè)化合物及陽(yáng)性對(duì)照藥物 依曲韋林（E－travirine，ETR）（山東大學(xué)劉新泳教授饋贈(zèng)）；雷特格韋（Raltegravir，RAL）（默沙東制藥有限公司）；拉米夫定（Lamivudine，3TC）、齊多夫定（Zidovudine，AZT）、茚地那韋（Indinavir，IDV） 和達(dá)蘆那韋（Darunavir，DRV）（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；恩曲他濱（Emtricitabine，F(xiàn)TC）（北京中碩醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司）；替諾福韋（Tenofovir，TDF）（黃石福爾泰醫(yī)藥科技有限公司）；普伐他汀鈉（Pravastatin sodium）、洛伐他?。↙ovastatin）、辛伐他?。⊿imvastatin）、瑞舒伐他?。≧osuvastatin）、阿托伐他?。ˋtorvastatin）、匹伐他汀 （Pitavastatin） 和度魯 特韋（Dolutegravir，DTG）（Macklin公司）。

1.4 細(xì)胞與病毒 人T淋巴細(xì)胞C8166細(xì)胞系、實(shí)驗(yàn)株HIV-1IIIB由NIH AIDS Reagent Progrom惠贈(zèng)。根據(jù)常規(guī)方法培養(yǎng)制備HIV-1病毒并進(jìn)行感染性滴度測(cè)定，將病毒小量分裝，-80℃保存。C8166細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)前1天進(jìn)行傳代使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.5 他汀類藥物對(duì)C8166細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn) 96孔板內(nèi)將藥物進(jìn)行5倍梯度稀釋，共設(shè)置6個(gè)藥物濃度，每個(gè)藥物濃度設(shè) 3個(gè)復(fù)孔（100 μL/孔），同時(shí)設(shè)置無(wú)藥物的陰性對(duì)照孔（NC）和空白對(duì)照孔（BC）。除BC孔外，每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液。在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，采用MTT法測(cè)定化合物對(duì)不同細(xì)胞的毒性。800TS酶標(biāo)儀在570/630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，計(jì)算半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（The 50% cytotoxicity concentration，CC50）。

1.6 他汀類藥物對(duì)HIV-1IIIB致C8166細(xì)胞病變的抑制作用 96孔板內(nèi)將藥物進(jìn)行5倍梯度稀釋，共設(shè)置6個(gè)藥物濃度，每個(gè)藥物濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔（100 μL/孔）。每孔加 50 μL C8166 細(xì)胞懸液與 50 μL HIV-1IIIB病毒稀釋液（1300 TCID50），同時(shí)設(shè)置含C8166細(xì)胞與病毒的陽(yáng)性對(duì)照孔（PC），置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第3天在倒置顯微鏡下（100×）觀察合胞體的形成并計(jì)數(shù)，計(jì)算半數(shù)有效濃度（The 50% effective concentration，EC50）[11]。

1.7 他汀類藥物對(duì)HIV-1IIIB急性感染C8166細(xì)胞中病毒復(fù)制的抑制作用 將C8166細(xì)胞懸液與HIV-1IIIB病毒液（2000 TCID50）混勻，置 37 ℃感染4 h后加入適量1×PBS緩沖液離心洗滌以便去除游離的病毒，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞備用。

96孔板內(nèi)將藥物進(jìn)行5倍梯度稀釋，共設(shè)置6個(gè)藥物濃度，每個(gè)藥物濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔（100 μL/孔），同時(shí)設(shè)置無(wú)藥物的陽(yáng)性對(duì)照孔（PC）和空白對(duì)照孔（BC）。除BC孔外，每孔加入100 μL上述細(xì)胞，輕輕振動(dòng)混勻，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第3天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用終濃度為5% Triton X-100裂解滅活。采用ELISA測(cè)定HIV-1 p24蛋白檢測(cè)藥物對(duì)HIV-1復(fù)制的抑制作用，計(jì)算EC50[12-13]。

1.8 匹伐他汀與ETR等9個(gè)藥聯(lián)合用藥對(duì)HIV-1IIIB急性感染C8166細(xì)胞中病毒復(fù)制的抑制作用 96孔板內(nèi)，按匹伐他汀、ETR、FTC、AZT、3TC、TDF、DTG、RAL、IDV和DRV單藥對(duì)急性感染C8166細(xì)胞中抑制 HIV-1IIIB復(fù)制的 EC50值，設(shè)置 8× EC50、4 × EC50、2 × EC50、EC50、0.5 × EC50、0.25 × EC50、0.125 × EC50、0.0625×EC50共8個(gè)藥物梯度，分別設(shè)置單藥組和聯(lián)合用藥組。將C8166細(xì)胞懸液與HIV-1IIIB（2000 TCID50）混勻，在 37 ℃下感染 4 h，1×PBS緩沖液洗滌2次以便去除游離的病毒，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞備用。

取上述100 μL細(xì)胞接種到含有100 μL不同濃度梯度稀釋化合物的96孔板上，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第3天收集培養(yǎng)上清，用終濃度為5% Triton X-100裂解滅活。ELISA測(cè)定HIV-1 p24蛋白檢測(cè)藥物對(duì)HIV-1復(fù)制的抑制作用，計(jì)算EC50。用CompuSyn 軟件計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）和劑量降低系數(shù)（dose reduction index，DRI）[14-15]。

2 結(jié)果

2.1 他汀類藥物對(duì)C8166細(xì)胞的毒性 本研究采用MTT法檢測(cè)了他汀類藥物對(duì)C8166細(xì)胞的毒性，發(fā)現(xiàn)普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀對(duì)C8166 細(xì)胞無(wú)毒性作用，CC50＞200 μmol·L-1；匹伐他汀和阿托伐他汀對(duì)C8166細(xì)胞有一定的毒性作用，CC50分別為105.67±1.68、99.49±2.08 μmol·L-1（圖2，表 1）。

圖2 他汀類藥物對(duì)C8166細(xì)胞的毒性作用

2.2 他汀類藥物的體外抗HIV-1活性 采用合胞體計(jì)數(shù)和ELISA檢測(cè)p24抗原的方法評(píng)估了他汀類藥物的體外抗HIV-1活性。研究發(fā)現(xiàn)普伐他汀、瑞舒伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀的治療指數(shù)未超過(guò)10，無(wú)抗HIV活性。匹伐他汀經(jīng)2種方法檢測(cè)均有一定的抗病毒效應(yīng)，EC50分別為5.12±1.44、9.88 ±4.55 μmol·L-1，因此，我們選擇匹伐他汀進(jìn)行進(jìn)一步研究（表1）。

表1 他汀類藥物體外抗HIV-1活性（±s，n=2）

表1 他汀類藥物體外抗HIV-1活性（±s，n=2）

注：CC50，半數(shù)細(xì)胞毒性濃度；EC50，半數(shù)有效濃度；TI，治療指數(shù)。

E C 50（μ m o l·L-1） T I s y n c y t i u m p 2 4 s y n c y t i u m p 2 4 P r a v a s t a t i n ＞2 0 0 ＞2 0 0 ＞2 0 0 i n a c t i v e i n a c t i v e R o s u v a s t a t i n ＞2 0 0 1 0 5.5 6±3 2.6 1 9 2.3 1±1 7.8 1 ＞1.8 9 ＞2.1 6 P i t a v a s t a t i n 1 0 5.6 7±1.6 8 5.1 2±1.4 4 9.8 8±4.5 5 2 0.6 3 1 0.6 9 A t o r v a s t a t i n 9 9.4 9±2.0 8 2 1.3 3±2.4 2 1 8.6 6±1.4 7 4.6 6 5.3 3 S i m v a s t a t i n ＞2 0 0 1 2.5 1±2.1 4 9 2.4 9±9.2 2 ＞1 5.9 8 ＞2.1 6藥物 C C 50（μ m o l·L-1）L o v a s t a t i n ＞2 0 0 5 9.0 5±0.0 4 9 2.7 7±8.6 8 ＞3.3 8 ＞2.1 6

2.3 匹伐他汀與其它抗HIV藥物的聯(lián)合用藥 HIV與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，心血管并發(fā)性嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和預(yù)期壽命，可能需服用他汀類藥物的治療。我們發(fā)現(xiàn)匹伐他汀除了降血脂外，還有一定的抗HIV-1活性，因此，進(jìn)一步研究匹伐他汀與其它抗HIV藥物聯(lián)合的抗病毒效應(yīng)。采用周氏中效模型原理設(shè)計(jì)聯(lián)合用藥的實(shí)驗(yàn)方案和數(shù)據(jù)處理[16-18]，主要評(píng)價(jià)參數(shù)為CI值和DRI值。當(dāng)CI值＞1.1時(shí)，藥物間呈現(xiàn)拮抗作用；0.9≤CI值≤1.1時(shí)，藥物間呈現(xiàn)相加作用；CI值＜0.9，藥物間呈現(xiàn)協(xié)同作用[19]。DRI值是指達(dá)到同一效應(yīng)時(shí)藥物聯(lián)用的劑量比藥物單用劑量降低的倍數(shù)。DRI值越大，則表明藥物聯(lián)合時(shí)劑量降低得越多，可降低藥物毒副作用的發(fā)生和減緩耐藥病毒株的出現(xiàn)。

結(jié)果如表2所示，匹伐他汀與核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NRTIs）TDF、FTC、3TC、AZT 聯(lián)合用藥時(shí)的聯(lián)合指數(shù)分別為 0.56±0.14、0.67±0.15、0.69±0.11、0.80±0.12，藥物間呈現(xiàn)協(xié)同作用；匹伐他汀與蛋白酶抑制劑（protease inhibitor，PI）IDV和DRV聯(lián)合用藥時(shí)聯(lián)合指數(shù)分別為0.76±0.17、0.58±0.15，藥物間呈現(xiàn)協(xié)同作用；匹伐他汀與非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs）ETR聯(lián)合用藥時(shí)的聯(lián)合指數(shù)為1.18±0.05，藥物間呈現(xiàn)拮抗作用；匹伐他汀與整合酶鏈轉(zhuǎn)移抑制劑（Integrase strand transfer inhibitors，INSTIs）RAL 和 DTG 聯(lián)合用藥時(shí)的聯(lián)合指數(shù)分別為1.03±0.04、1.03±0.02，藥物間呈現(xiàn)相加作用。匹伐他汀與其他抗HIV藥物聯(lián)用時(shí)，每組單藥的DRI值均＞1，兩藥聯(lián)用時(shí)劑量比藥物單用劑量降低1.10～14.50倍。

表2 匹伐他汀與不同抗HIV藥物聯(lián)合用藥（±s，n=2）

表2 匹伐他汀與不同抗HIV藥物聯(lián)合用藥（±s，n=2）

注：CI值，聯(lián)合用藥指數(shù)；DRI值，劑量降低指數(shù)。

E D 50 E D 75 E D 90 E D 95 P i t a v a s t a t i n+T D F P i t a v a s t a t i n 2.9 9±0.9 1 3.3 4±0.5 8 3.7 8±0.1 5 4.1 2±0.2 2 0.5 6±0.1 4 協(xié)同T D F 2.3 2±1.0 4 3.1 0±1.3 2 4.1 4±1.6 6 5.0 4±1.9 4 P i t a v a s t a t i n+F T C P i t a v a s t a t i n 9.4 3±7.0 7 9.8 7±3.5 4 1 1.4 4±1.1 6 1 3.4 5±5.4 9 0.6 7±0.1 5 協(xié)同F(xiàn) T C 1.5 7±0.3 7 1.6 9±0.4 4 1.8 3±0.5 1 1.9 3±0.5 6 P i t a v a s t a t i n+3 T C P i t a v a s t a t i n 5.1 4±0.5 2 5.7 7±1.9 4 7.0 9±5.0 7 8.5 2±7.8 0 0.6 9±0.1 1 協(xié)同3 T C 1.5 6±0.0 4 1.7 9±0.0 5 2.0 6±0.0 7 2.2 6±0.0 8 P i t a v a s t a t i n+A Z T P i t a v a s t a t i n 1 4.3 4±1 2.9 9 8.0 5±3.9 3 5.1 9±0.2 9 4.2 1±1.8 0 0.8 0±0.1 2 協(xié)同A Z T 1.1 2±0.1 7 1.4 3±0.3 0 1.8 2±0.4 8 2.1 5±0.6 4 P i t a v a s t a t i n+I D V P i t a v a s t a t i n 2.6 8±0.2 0 4.0 9±0.1 7 6.2 6±0.9 7 8.4 0±1.9 5 0.7 6±0.1 7 協(xié)同I D V 1.3 7±0.2 9 1.6 0±0.3 9 1.8 7±0.5 1 2.0 7±0.6 1 P i t a v a s t a t i n+D R V P i t a v a s t a t i n 5.7 5±0.6 3 5.5 6±1.1 8 5.4 1±1.6 9 5.3 3±2.0 2 0.5 8±0.1 5 協(xié)同D R V 2.8 8±0.3 1 2.7 4±0.2 0 2.6 5±0.6 6 2.6 2±0.9 6 P i t a v a s t a t i n+E T R P i t a v a s t a t i n 3.1 8±0.0 8 3.8 9±0.2 8 4.7 7±0.5 6 5.4 7±0.8 1 1.1 8±0.0 5 拮抗E T R 1.0 4±0.1 1 1.0 4±0.0 3 1.0 4±0.0 4 1.0 5±0.0 9 P i t a v a s t a t i n+R A L P i t a v a s t a t i n 4.0 5±2.1 4 3.2 7±1.0 0 2.7 2±0.1 8 2.4 5±0.2 5 1.0 3±0.0 4 相加R A L 1.5 2±0.5 6 1.5 1±0.2 9 1.5 3±0.0 0 1.5 6±0.2 0 P i t a v a s t a t i n+D T G P i t a v a s t a t i n 2.0 5±0.4 1 2.1 1±0.6 3 2.1 9±0.8 7 2.2 4±1.0 4 1.0 3±0.0 2 相加藥物 單藥 D R I值 C I值 聯(lián)合效果D T G 1.6 0±0.2 3 1.5 7±0.1 3 1.5 5±0.0 3 1.5 4±0.0 4

3 討論

HIV相關(guān)的血脂異常和HIV感染者的心血管疾病通常使用他汀類藥物作為初始治療，然而他汀類藥物與PIs、可比西他、依法韋侖會(huì)存在藥物相互作用，并且藥物劑量的高低也會(huì)影響治療效果，在某種程度上限制了臨床應(yīng)用[20-21]。HIV相關(guān)的心血管疾病日益受到關(guān)注，他汀類藥物具有諸多優(yōu)勢(shì)且顯現(xiàn)出越來(lái)越多“老藥新用”的功效，如預(yù)防淋巴瘤的形成、增強(qiáng)生物或放化療制劑的效果、降低阿爾茲海默癥風(fēng)險(xiǎn)、降低心衰患者的癌癥風(fēng)險(xiǎn)及相關(guān)死亡率等[22-24]，需根據(jù)藥物間相互作用調(diào)整劑量選擇合適的用藥方案充分利用他汀類藥物。

Elahi等[25]研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀通過(guò)甲戊二羥酸途徑上調(diào)p21，從而抑制HIV-1的復(fù)制。本文對(duì)幾種他汀類藥物初步篩選之后發(fā)現(xiàn)只有匹伐他汀在體外具有抗HIV-1活性作用，但相關(guān)的作用機(jī)制研究目前尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究。阿托伐他汀無(wú)體外抗病毒活性，與先前報(bào)道的結(jié)果不一致，可能是由于所選用的細(xì)胞系、HIV-1病毒株以及檢測(cè)方法不同所導(dǎo)致的。

此外，我們進(jìn)一步評(píng)估了匹伐他汀與其他類抗HIV藥物聯(lián)合時(shí)所呈現(xiàn)的藥物間相互作用是協(xié)同、相加或拮抗。本研究中匹伐他汀是一種羥甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，與其它抗HIV藥物作用機(jī)制不同，同時(shí)鑒于藥物聯(lián)合模型應(yīng)用的簡(jiǎn)便高效性，采用周氏中效模型原理設(shè)計(jì)聯(lián)合用藥方案并用相關(guān)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。當(dāng)前的cART治療是由2種NRTIs+1種NNRTI或PI或INSTI組成[26]，本研究對(duì)臨床治療中常用的9種抗艾滋病藥物與匹伐他汀進(jìn)行聯(lián)合抗HIV-1藥效分析，研究結(jié)果顯示匹伐他汀除了與NNRTI-ETR聯(lián)用呈現(xiàn)拮抗作用外，與NRTIs、INSTIs、PIs均呈現(xiàn)相加或協(xié)同作用。目前他汀類藥物與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物相互作用研究中關(guān)于匹伐他汀的支持證據(jù)有限，本研究為臨床治療方案的選擇提供了一定的參考價(jià)值。