樊銳鋒 王若凡 杜艷秋 劉艷 黃慶陽(yáng)

摘 要： ?為尋找促進(jìn)藥用植物活性代謝產(chǎn)物合成的微生物，該文以黃精為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)和生態(tài)功能預(yù)測(cè)平臺(tái)，測(cè)定根際土真菌、根莖和根內(nèi)生真菌的ITS序列，分析其真菌多樣性和群落組成，并預(yù)測(cè)根莖內(nèi)生真菌的生態(tài)功能。結(jié)果表明：（1）測(cè)序得到1 023個(gè)可操作分類單元（OTUs），根際、根莖和根真菌OTU數(shù)分別為703、128和141，三種部位真菌群落組成差異顯著，根際土存在特有的真菌類群，即壺菌門。（2）根際土、根莖及根共有OTU 41個(gè)，子囊菌門占共有真菌的58.15%，豐度最大。（3）根莖內(nèi)生真菌被劃分6個(gè)生態(tài)功能群，包括未定義腐生菌、菌寄生真菌、動(dòng)物病原菌、植物病原菌、叢枝菌根真菌和地衣共生真菌，37個(gè)undefined種類（34.91%）在FUNGuild數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有參考信息。研究認(rèn)為根莖中優(yōu)勢(shì)菌屬Setophoma、新赤殼屬等內(nèi)生真菌可能與活性代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，可為黃精藥用功能菌群的發(fā)掘提供數(shù)據(jù)參考。

關(guān)鍵詞： 黃精， 內(nèi)生真菌， 根莖， 群落組成， FUNGuild

中圖分類號(hào)： ?Q948.12

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ?A

文章編號(hào)： ?1000-3142（2021）05-0799-09

Abstract： ?To find microbes promoting the biosynthesis of active metabolites in medicinal plants， with Polygonatum sibiricum as materials， the ITS region of fungi form rhizosphere， rhizome and root was sequenced by Illumina MiSeq to analyze the diversity and community composition， and FUNGuild was used to analyze the ecological function categories of endophytes fungi in rhizome. The results were as follows： （1） A total of 1 023 operational taxonomic units （OTUs） were obtained from all samples of P. sibiricum. The numbers of OTU from rhizosphere， rhizome and root fungi were 703， 128 and 141， respectively. The composition of fungal community in three samples was significantly different， and there was specific fungi Chytridiomycota in root. （2） There was 41 OTU in common of three samples， and Ascomycota accounted for the highest proportion （58.15%）. （3） In ecological functional， endophytic fungi of rhizome in P. sibiricum contained six functions groups， undefined saprotroph， mycoparasites， plant pathogen， animal pathogen， arbuscular mycorrhizal fungi， lichenized fungi， and 37 undefined species （34.91%） had no reference information in the FUNGuild database. It is suggested that the dominant endophytic fungi like Setophoma and Neocosmospora in rhizome may be important microbial communities affecting the biosynthesis of the active products， which provides data reference for the exploration of medicinal functional microorganisms in P. sibiricum.

Key words： Polygonatum sibiricum， endophytic fungi， rhizome， community composition， FUNGuild

黃精（Polygonatum sibiricum）為百合科多年生草本植物，在我國(guó)以黑龍江、遼寧、河北、內(nèi)蒙古等地為主產(chǎn)區(qū)（李亞霖等，2019）。黃精以干燥后的根莖入藥，其主要化學(xué)成分包括多糖、皂苷、生物堿、氨基酸、揮發(fā)油等（Zhou et al.， 2019）。黃精是中國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一，也是重要的藥食同源性植物，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景（Debnath et al.， 2013;國(guó)家藥典委員會(huì)，2015）。

內(nèi)生菌廣泛存在于不同種類植物組織或器官內(nèi)部，與寄主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化，并不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出外在病害癥（姚領(lǐng)愛(ài)等，2010），主要包括真菌、細(xì)菌和放線菌。內(nèi)生菌可以影響藥用植物的生長(zhǎng)和發(fā)育（Tan et al.， 2014;郭鳳仙等，2017），并產(chǎn)生與藥用植物活性成分相近的次生代謝產(chǎn)物，如在杜仲中合成抗氧化活性的黃酮類化合物、在刺五加中合成抗氧化的皂苷類物質(zhì)等（郭順星，2018;楊娟等，2019）。目前，有關(guān)藥用植物內(nèi)生真菌的研究主要集中在丹參（周麗思等，2018）、重樓（王艷等，2019）、虎杖（馬云桐等，2009）、三七（Wu et al.， 2015）等根和根莖入藥的藥用植物。學(xué)者對(duì)黃精內(nèi)生菌和活性代謝產(chǎn)物的研究甚少，僅見(jiàn)于黃精和多花黃精中三種芽孢桿屬內(nèi)生細(xì)菌（HJ-1、HJ-2和ZJU-3）具有抗菌活性（柏曉輝等，2018;遲惠榮等，2019;翟大才等，2019），內(nèi)生真菌的研究見(jiàn)于黃精中鐮刀菌屬、鏈格孢屬和曲霉屬等對(duì)多種植物病原菌具有抑制活性（汪瀅等，2010;李艷玲等，2019）。

植物內(nèi)生菌的研究手段主要是應(yīng)用傳統(tǒng)的人工培養(yǎng)法，但自然界中90%以上的微生物是不可培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的（Amann et al.， 1995），現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)可以快速和正確地分析樣品中微生物群落組成和豐度，并借助生態(tài)功能分析方法從分類學(xué)上解析真菌OTUs的生態(tài)功能，從而分析潛在的或可能起功能性作用的非培養(yǎng)類微生物（劉蓬蓬等，2018）。因此，本研究分析黃精根際真菌和藥用部位內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)，探討藥用部位根莖內(nèi)生真菌的生態(tài)功能，為黃精藥用功能菌群的發(fā)掘和代謝活性產(chǎn)物的研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品前處理

2019年8月，黃精根際土、根莖和根采自黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)本校藥學(xué)院蘇連杰教授鑒定為黃精（Polygonatum sibiricum）。

采集新鮮、無(wú)傷病黃精植株3株，將根部土壤抖落后，留存剩余在根部的根際土壤于無(wú)菌袋中;所有樣品迅速帶回實(shí)驗(yàn)室后，用流水沖洗掉根莖和根表面多余的根際土后，無(wú)菌條件下，將根莖和根切成2 cm小段，置于培養(yǎng)皿中消毒，75%乙醇2 min，5%次氯酸3 min，無(wú)菌去離子水沖洗3次，最終獲得根際土、根莖和根的無(wú)菌樣品共計(jì)9份（王艷等，2019）。

1.2 真菌分子生物學(xué)鑒定

利用試劑盒（FastDNA spin kit）提取黃精根際、根莖和根真菌總DNA，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。選擇真菌ITS測(cè)序通用引物 ITS1/ITS2 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（付亞娟等，2019）。PCR產(chǎn)物回收純化后，利用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)上機(jī)測(cè)序（美吉生物公司，上海）。

1.3 序列分析和數(shù)據(jù)處理

使用FLASH軟件、QIIME軟件、RDP classifier軟件、Mothur軟件等，對(duì)原始下機(jī)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析（周家喜等，2019），在相似性97%的水平上，進(jìn)行可操作分類單元（OTU）劃分。利用 FUNGuild 軟件預(yù)測(cè)黃精根莖內(nèi)生真菌的生態(tài)功能（Nguyen et al.， 2016），為保證預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，置信水平僅選用highly probable和probable，并刪除序列數(shù)小于10的OTUs。

黃精根際、根莖和根的真菌多樣性指數(shù)和群落組成差異利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，用RStudio v3.5.2的程序包Grid、Venn Diagram、Vegan、ggrepel、ggplot等實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化：韋恩圖（Venn）、主成分分析圖（PCA）、熱圖（Heatmap）和多級(jí)物種Sunburst圖等。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精根際及內(nèi)生真菌群落多樣性

黃精根際土、根莖和根共計(jì)9個(gè)樣品，共獲得623 708條有效序列數(shù)。Coverage指數(shù)接近于1，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可以準(zhǔn)確地反映供試樣品的真實(shí)情況（表1）。相似度為0.97條件下，黃精根際真菌的Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)分別為3.77±0.15、460.1±12.1和465.6±10.1，顯著高于根莖和根內(nèi)生真菌（P<0.05），說(shuō)明黃精根際土中真菌群落多樣性和物種豐富度最高。黃精根莖和根內(nèi)生真菌Simpson指數(shù)顯著高于根際土，說(shuō)明根莖和根中內(nèi)生真菌群落多樣性較低。

第一和第二主軸解釋了OTU水平真菌群落變化的91.86%，來(lái)自相同部位的樣品相對(duì)聚集，不同部位樣品中真菌有較高程度的分離，表明黃精根際、根莖和根真菌群落組成差異顯著（圖1）。

2.2 黃精根際及內(nèi)生真菌群落組成

根際土中真菌OTU數(shù)目遠(yuǎn)大于根和根莖真菌OTU數(shù)目，分別為703、141、128（圖2）。根際土、根莖和根中共有的OTU數(shù)目為41個(gè)，包括真菌類群Setophoma（OTU1332）、籃狀菌屬（Talaromyces）（OTU1449、OTU261）、肉座菌目（Hypocreales）（OTU978、OTU1379）、新赤殼屬（Neocosmospora）（OTU411、OTU1370）等，說(shuō)明黃精根際土、根莖及根樣品間微生物既存在一定的交集，又相互獨(dú)立。根際土與植物中真菌的OTU數(shù)為128，僅占總數(shù)的15.94%，交叉性較小。

黃精根際土、根莖和根中共14門36綱77目158科286屬398種真菌，在門水平主要分布在子囊菌門（Ascomycota）（27.85%～83.98%）、未知菌門（unclassified_k_Fungi）（1.17%～62.58%）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）（2.64%～29.06%）、球囊菌門（Glomeromycota）（1.57%～6.68%）、Mortierellomycota（0.19～4.40%）、壺菌門（Chytridiomycota）（1.28%）等6個(gè)門中（圖3：a）。藥用部位根莖內(nèi)生真菌中主要分布于子囊菌門（83.98%）和擔(dān)子菌門（10.82%）;根莖內(nèi)生真菌子囊菌門的含量顯著高于根際土和根中，根際土中擔(dān)子菌門和Mortierellomycota的含量顯著高于根莖和根中，且存在特有的門，即壺菌門（圖3：b）。

從屬水平的分類看（圖4），黃精根際土真菌263屬，顯著高于根莖（72屬）和根（67屬）中內(nèi)生真菌數(shù)量，但在根際土、根莖和根中缺少共有優(yōu)勢(shì)菌屬（相對(duì)豐度≥10%）。多級(jí)物種Sunburst圖顯示：藥用部位根莖內(nèi)生真菌中相對(duì)百分含量前5的有Setophoma（23.71%）、肉座菌目的未鑒定屬（19.36%）、新赤殼屬（8.48%）、棘殼孢屬（Pyrenochaeta）（5.17%）和Cutaneotrichosporon（4.03%），前4屬均屬于優(yōu)勢(shì)菌門，即子囊菌門（圖5）。

2.3 共有的類群組成與比較分析

黃精根際土、根莖及根樣品間共有OTU 41個(gè)，歸屬于6門12綱24目31科35屬，在門水平上，子囊菌門具有最大相對(duì)豐度，占共有真菌的58.15%，其次是未鑒定真菌（22.14%）、擔(dān)子菌門（14.24%）、球囊菌門（3.74%）和Mortierellomycota（1.95%）等。

在屬水平上，相對(duì)豐度較大的是Setophoma，占共有真菌的13.02%，其次分別是籃狀菌屬（11.34%）、肉座菌目的未鑒定屬（11.12%）、新赤殼屬（5.65%）、角擔(dān)菌科（Ceratobasidiaceae）的未鑒定屬（4.23%）、鐮刀菌屬（Fusarium）（2.84%）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）的未鑒定屬（2.78%）、球囊霉屬（Glomus）（2.59%）、棘殼孢屬（2.29%）、Cutaneotrichosporon（2.00%）等35屬。

2.4 FUNGuild功能類群預(yù)測(cè)

除未鑒定菌群外，黃精藥用部位根莖內(nèi)生真菌（刪除OTU<10）共有106個(gè)OTU，劃分為6個(gè)生態(tài)功能群（圖6），分別是（1）未定義腐生菌（undefined saprotroph）和未定義腐生菌-木腐生菌（undefined saprotroph-wood saprotroph）：共27個(gè)OTU，占總OTU數(shù)量的25.47%，相對(duì)豐度高達(dá)44.85%，是黃精根莖中最主要的功能類群，在屬水平上包括曲霉屬（Aspergillus）（3 OTU）、新赤殼屬（2 OTU）、籃狀菌屬（2 OTU）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（2 OTU）、Dactylonectria（1 OTU）和青霉屬（Penicillium）（1 OTU）等。（2）寄生真菌-植物病原菌-木腐生菌（fungal parasite-plant pathogen-wood saprotroph）：3個(gè)OTU，在屬水平上是Setophoma（2 OTU）、Paraphoma（1 OTU），占總OTU數(shù)量的2.83%，但其相對(duì)豐度高達(dá)24.32%。（3）動(dòng)物病原菌（animal pathogen）：僅有2個(gè)OTU，在科水平均屬于油壺菌科（Olpidiaceae）。（4）植物病原菌（plant pathogen）：6個(gè)OTU，在屬水平上分別是小球腔菌屬（Leptosphaeria）（1 OTU）、螺旋聚孢霉屬（Clonostachys）（1 OTU）和赤霉屬（Gibberella）（2 OTU）等。（5）叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）：11個(gè)OTU，均屬于球囊菌門（Glomeromycota）。（6）地衣共生真菌（lichenized fungi）：僅有1個(gè)OTU被認(rèn)為是地衣共生真菌，屬于擬星衣科（Arthopyreniaceae）。另外，19個(gè)OTU在FUNGuild數(shù)據(jù)庫(kù)的置信水平為possible，故不進(jìn)行功能統(tǒng)計(jì)，并且有37個(gè)OTU（占比34.91%）中沒(méi)有參考信息。

3 討論與結(jié)論

內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與藥用植物相同或相似的活性成分（Tian et al.， 2014; Sunil et al.， 2018），研究者已從黃精中分離出可合成具有抗菌活性的三萜皂苷的內(nèi)生真菌（汪瀅等，2010;姜程曦等，2017），我們利用高通量測(cè)序手段從黃精根際土、根莖和根中測(cè)序得到豐富的內(nèi)生真菌群，其中鏈格孢屬（Alternaria）、鐮刀菌屬、曲霉屬和青霉屬已經(jīng)在泰山黃精中通過(guò)傳統(tǒng)的平板分離的方法獲得（李艷玲等，2013），但相對(duì)豐度較低，除此之外，我們發(fā)現(xiàn)黃精中大量的內(nèi)生真菌還未見(jiàn)報(bào)道有待深入發(fā)掘，可見(jiàn)高通量測(cè)序手段較傳統(tǒng)的菌落分離，更能全面反映樣品內(nèi)生真菌群落的結(jié)構(gòu)組成，與Siddique et al.（2017）意見(jiàn)一致。

土壤真菌以植物根系作為中間體，并以菌絲或者孢子的形式，通過(guò)植物側(cè)根的裂縫、氣孔或者根部的破損等處進(jìn)入植物的根和根莖中，參與藥用植物活性成分的合成（周家喜等，2019）。黃精根際土真菌與植物內(nèi)生真菌共有128個(gè)OTU，占植物總OTU的56.64%，說(shuō)明土壤和植物中的真菌存在一定的相似性，根際真菌有機(jī)會(huì)選擇性地進(jìn)入到植物體內(nèi)，并成為內(nèi)生真菌，與周婕等（2019）對(duì)紫莖澤蘭根部與根際真菌的研究結(jié)果一致。同時(shí)，共有OTU僅占根和根莖內(nèi)生真菌的29.07%和32.03%，說(shuō)明除了共有成分外，在黃精根和根莖中擁有更多獨(dú)立的真菌類群，這與王艷等（2019）對(duì)重樓內(nèi)生真菌的研究結(jié)果一致，認(rèn)為植物內(nèi)部有其自身特殊的生境，是植物與微生物間協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。

FUNGuild預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，黃精根莖中未定義腐生菌類群（相對(duì)豐度44.85%）占比最高，與周家喜等（2019）、熊丹等（2020）的研究結(jié)果一致，認(rèn)為未定義腐生菌是地下部分根和根莖中的主要功能類群，并且很多研究發(fā)現(xiàn)腐生菌類群能夠參與有機(jī)物降解（Yan et al.， 2018;Chen et al.， 2019）。植物內(nèi)生真菌在發(fā)育學(xué)上不穩(wěn)定，在植物的不同生活周期中扮演不同的角色，一些具有復(fù)雜生活史的真菌有多種功能營(yíng)養(yǎng)型可以相互轉(zhuǎn)化，采取不同的生存策略來(lái)適應(yīng)環(huán)境的改變（Arnold & Lutzoni， 2007），在FUNGuild分類上可以被劃分多種營(yíng)養(yǎng)方式（熊丹等，2020）。在本研究中，優(yōu)勢(shì)菌屬Setophoma（相對(duì)豐度23.71%）被認(rèn)定是寄生真菌-植物病原菌-木腐生菌，推測(cè)其在植物組織健康生長(zhǎng)的時(shí)候是寄生真菌，有增加植物生長(zhǎng)量的能力，但也可以產(chǎn)生植物毒性成分導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受到抑制， 但當(dāng)組織衰老或死亡時(shí)可能作為腐生真菌，參與有機(jī)物降解，與丁常宏等（2013）的意見(jiàn)一致。

黃精根莖內(nèi)生真菌中3個(gè)OTU屬于新赤殼屬（相對(duì)豐度8.48%），被劃分為未定義腐生菌，Matsuo et al.（2019）發(fā)現(xiàn)新赤殼屬真菌具有抗腫瘤和抗瘧疾的活性，以及清除或淬滅活性氧（ROS）的能力;黃精根莖中球囊菌門的11個(gè)OTU，均被劃分為叢枝菌根真菌，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)叢枝菌根真菌與植物互惠共生，提高萜類、生物堿等藥用植物活性成分的產(chǎn)量（于洋等，2013;謝偉等，2020），尤其曹冠華等（2019）發(fā)現(xiàn)滇黃精根莖中多糖、薯蕷皂苷元含量與叢枝菌根真菌呈顯著正相關(guān)，這說(shuō)明黃精入藥部位根莖中的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌可能與活性代謝產(chǎn)物合成有關(guān)。我們今后還需進(jìn)一步加強(qiáng)菌株分離和功能試驗(yàn)，對(duì)黃精有效部位根莖中微生物的有效成分合成代謝進(jìn)行更加深入的研究。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）