惲雪丹,張 艷,黃時海,曹麗華,楊 婷,石德順,李湘萍
亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室 廣西大學(xué),南寧 530004
1997年,Wilmut等[1]通過利用體細胞核移植技術(shù)成功地克隆出了世界上第一只體細胞克隆綿羊多利(Doly),它的誕生證明了高度分化的體細胞仍然具有全能性. 自此以來,許多哺乳動物物種已經(jīng)被成功克隆[2]. 目前,體細胞核移植技術(shù)雖然已取得了明顯進展,但還存在克隆效率比較低、克隆動物體型偏大、出生的克隆動物體不易存活等問題.
豬作為一種良好的經(jīng)濟動物,也是最接近人的模式生物,其SCNT(Somatic Cell Nuclear Transfer)的低效率和后代異常限制了其在實踐中的應(yīng)用[3]. 這些問題是由許多原因造成的,目前人們主要的關(guān)注點是體細胞重編程不完全對體細胞核移植胚胎發(fā)育的影響[4]. 為了提高SCNT的效率,包括使用不同類型的供體細胞[5]改善去核程序[6],延長從融合到激活的間隔[7-8]等多種方法被用來調(diào)節(jié)供體細胞或克隆胚胎的表觀遺傳修飾.
包含SET和MYND域的蛋白質(zhì)3(SMYD3)是一種組蛋白H3賴氨酸4甲基轉(zhuǎn)移酶,在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用. 多年來研究者在某些癌細胞系中研究了SMYD3的表達,在卵母細胞[9]和胚胎中的作用也逐漸被揭示. Bai等[10]發(fā)現(xiàn)SMYD3基因能夠提高牛成纖維細胞iPSCs誘導(dǎo)效率,具有體細胞重編程作用. 而在早期胚胎發(fā)育中,SMYD3也具有重要的作用[10-12]. 本研究采用RNA干擾(RNAi)和過表達等技術(shù)方法,通過調(diào)控德保豬耳成纖維細胞SMYD3基因的表達,探討其在豬體細胞核移植過程中的重編程作用,為提高豬體細胞克隆效率奠定基礎(chǔ).
細胞:德保豬耳緣成纖維細胞來自廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所,293T細胞和豬顆粒細胞來自于本實驗室,卵母細胞抽取自南寧屠宰場提供的豬卵巢.
質(zhì)粒:pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA來自南京金斯瑞生物科技有限公司,其他所用質(zhì)粒均來自本實驗室. 豬SMYD3基因shRNA序列為(5′-CTCGAGCCGGCCACAAGCGAGAATGCAAATTCAAGAGATTTGCATTCTCGCTTGTGGTTTTTTGGCGGCCGC-3′).
試劑:X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent(Roche公司);Trizol Reagent(Invitrogen公司);DNA聚合酶、qRT-PCR試劑盒(Takara公司);普通質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Markers(天根生化科技有限公司);TransIntreTM EL Transfection(全式金生物技術(shù)有限公司). 無特殊說明的其余實驗試劑均來源于SIGMA公司.
引物:克隆及定量引物由上海生工公司合成(表1).
表1 實時熒光定量qRT-PCR引物
在前期實驗中我們已分別將pSicoR-GFP-1864和pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA表達載體轉(zhuǎn)染細胞,轉(zhuǎn)染48 h后觀察發(fā)現(xiàn)空白組細胞無綠色熒光蛋白表達,pSicoR-GFP-1864陰性對照組和pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA處理組細胞均有綠色熒光表達. 72 h后收集細胞,提取總RNA,qRT-PCR結(jié)果顯示與空白組和陰性對照組相比,SMYD3基因在處理組細胞中表達顯著降低(p<0.05),SMYD3基因shRNA干擾效率為54%.
利用轉(zhuǎn)染試劑將本實驗室預(yù)先構(gòu)建好并經(jīng)酶切鑒定的過表達重組質(zhì)粒pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3以及干擾重組質(zhì)粒SMYD3-GFP-shRNA分別與包裝質(zhì)粒NRF、包膜質(zhì)粒VSVG以5∶3∶2的比例轉(zhuǎn)染293T細胞,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)72 h后收集病毒.
將豬成纖維細胞以相同的細胞數(shù)接種到24孔板中,當(dāng)24孔板內(nèi)的細胞匯合度達到70%時,向每孔DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基里加入病毒以及終質(zhì)量濃度為8 μg/mL的助感染試劑polybrene. 加入MOI(Multiplicity of Infection)值為5的過表達SMYD3基因病毒細胞作為上調(diào)SMYD3組,加入MOI值為0.8的shRNA病毒作為下調(diào)SMYD3組,未處理的細胞作為空白對照組.
用75%酒精對保溫取回的卵巢進行消毒,再用33 ℃生理鹽水清洗2~3遍,用10 mL無菌注射器抽取直徑為3~6 mm的卵泡,在體式顯微鏡下用撿卵針撿出有3層以上卵丘細胞的卵丘—卵母細胞復(fù)合物(Cumulus oocyte complexes,COCs). 把撿出的COCs轉(zhuǎn)移到提前預(yù)熱的PM(Pericyte Medium)成熟培養(yǎng)盤,放入38 ℃,5% CO2,100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).
將培養(yǎng)44 h的COCs吸出,放到提前預(yù)熱含0.1%透明質(zhì)酸酶的CCM(Cell Culture Medium)中輕輕吹打,挑選出含極體的成熟裸卵,將裸卵放入電融合槽融合和激活,激活參數(shù)為100 V(以每1 mm電激槽寬計)、80 μs、3次電脈沖. 激活后的裸卵移到胚胎培養(yǎng)液PZM-3中,在38 ℃,5% CO2,100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),收集2細胞、4細胞、8細胞、16細胞和囊胚.
分別培養(yǎng)未處理、過表達SMYD3基因和抑制SMYD3基因表達的5~7代豬成纖維細胞作為供體. 成熟的卵母細胞如1.3相同方法去除顆粒細胞后,在鏡下采用盲吸法去核. 吸取表面圓滑、形態(tài)規(guī)則的供體,然后注入卵母細胞卵周隙內(nèi)(對于上調(diào)和下調(diào)SMYD3基因表達的成纖維細胞需在熒光顯微鏡下挑選綠色熒光蛋白表達的細胞作為供體). 將重構(gòu)卵進行電激活,融合/激活參數(shù)為83 V(以每1 mm電激槽寬計),100 μs,1次直流脈沖. 將融合/激活完的重構(gòu)卵轉(zhuǎn)移到PZM-3(Porcine Zygote Medium-3)中,放到38 ℃,5% CO2,100%濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng). 以不同供體進行的核移植,分為對照組、過表達SMYD3組、抑制SMYD3組.
按試劑盒說明提取各組細胞RNA后,在PCR儀中進行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄條件為25 ℃ 10 min,42 ℃ 90 min,95 ℃ 10 min. 以微量反轉(zhuǎn)的cDNA為模板進行qRT-PCR試驗,定量引物序列見表1,反應(yīng)體系見表2,反應(yīng)條件參照說明書. 內(nèi)參基因是18S,依據(jù)2-ΔΔCT方法計算SMYD3,Nanog和Oct4基因的表達情況.
表2 qRT-PCR反應(yīng)體系
qRT-PCR結(jié)果顯示,SMYD3基因在豬卵母細胞體外成熟過程中表達較低,顯著低于孤雌激活(囊胚除外)和核移植早期胚胎表達水平(p<0.05).SMYD3基因在MII期和GV(Germinal Vesicle)期表達水平差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05);在孤雌激活早期胚胎中,SMYD3基因表達從2細胞期開始升高,4細胞期最高,隨后降低,呈現(xiàn)出先升高再降低的表達趨勢(圖1).SMYD3基因在豬核移植早期胚胎中也呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢,4細胞期表達量低于2細胞期,但差異不顯著(p>0.05),隨后在8細胞期達到最高,然后降低(圖2).
上標(biāo)不同字母表示相同時期各組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05).圖1 SMYD3基因在豬卵母細胞成熟和孤雌早期胚胎發(fā)育中的表達
上標(biāo)不同字母表示相同時期各組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05).圖2 SMYD3基因在體細胞核移植早期胚胎發(fā)育中的表達
統(tǒng)計結(jié)果顯示,核移植胚胎的2細胞分裂率在各實驗中差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05). 上調(diào)SMYD3組核移植胚胎的4細胞率顯著高于對照組[(45.6%±1.65%) vs (42%±0.56%),p<0.05],下調(diào)組4細胞率與對照組差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05). 與對照組相比,上調(diào)SMYD3組核移植胚胎的囊胚率顯著提高[(14.6%±0.96%) vs (9.6%±0.19%),p<0.05],下調(diào)組囊胚率顯著降低[(6.7%±0.71%) vs (9.6%±0.19%),p<0.05](表3).
表3 調(diào)控SMYD3基因表達對豬體細胞核移植胚胎發(fā)育的影響
qRT-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,上調(diào)組SMYD3基因表達水平在2細胞和4細胞期胚胎中顯著提高(p<0.05),下調(diào)組SMYD3基因檢測不出. 上調(diào)組2細胞期胚胎的SMYD3基因表達顯著高于4細胞期(p<0.05)(圖3).
圖3 SMYD3基因在體細胞核移植2細胞和4細胞期中的表達水平
與對照組相比,上調(diào)SMYD3組囊胚的Nanog和Oct4基因表達水平顯著提高(p<0.05). 下調(diào)組囊胚中Nanog基因檢測不出,Oct4基因表達低于對照組,但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)(圖4).
圖4 豬體細胞核移植囊胚Oct4和Nanog基因表達水平
近年來,體細胞核移植產(chǎn)生的動物克隆效率低,胚胎表型異常和生存能力低被認為是供體核的重編程不完全所致. 起初Bourc’his 等[13]通過免疫熒光來跟蹤染色體上的整體基因組甲基化變化,結(jié)果顯示在受精的牛體細胞核移植胚胎中植入前甲基化具有與自然繁殖的哺乳動物胚胎相似的模式,但其甲基化動力學(xué)過程有著不同程度的紊亂. 而Dean等[14]對小鼠、豬和牛的比較研究中進一步印證了哺乳動物中甲基化的保守性與體細胞移植胚胎甲基化的異常. 之后研究者利用亞硫酸氫鹽分析法對這種異常的甲基化進一步分析表明,在牛核移植桑葚胚和囊胚與牛體外受精胚胎相比DNA甲基化水平較高,水平與供體細胞DNA甲基化類似[15]. 同樣在身為大動物的豬中,研究者也發(fā)現(xiàn)與IVF(In Vitro Fertilization)早期胚胎相比,發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化水平在核移植早期胚胎中異常[16],H3K36me3在豬體細胞核移植早期,即胚胎1細胞時期不能被完全去甲基化[17]. 在核移植早期胚胎中DNA和組蛋白甲基化水平異常,而體細胞重編程不完全造成了這些異常的甲基化水平.
多年研究表明,SMYD3能通過使染色體組蛋白H3K4發(fā)生二甲基化、三甲基化或抑制H4K5/H4K20的甲基化,來改變?nèi)旧|(zhì)的可及性以及影響下游多種功能基因,從而參與抑制腫瘤細胞凋亡、促進細胞增殖等生命活動過程. Bai等[10]發(fā)現(xiàn)過表達SMYD3基因可提高牛胎兒成纖維細胞iPSCs誘導(dǎo)效率,證實其具有促進牛體細胞重編程的作用. 而下調(diào)SMYD3基因表達對斑馬魚、小鼠和牛胚胎發(fā)育具有不利影響,證明SMYD3基因?qū)ε咛グl(fā)育有重要作用[9-12]. 因此,本文先分析了SMYD3基因在豬卵母細胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育過程中的表達模式,發(fā)現(xiàn)在豬卵母細胞體外成熟過程中SMYD3基因表達無顯著性差異,這與前人對多數(shù)哺乳動物的研究相符合. 而體外成熟過程中SMYD3基因表達低于孤雌激活(囊胚除外)和核移植早期胚胎發(fā)育過程,這種表達模式不同于牛來源細胞中的研究,本文推測這種差異性來自于獲得早期胚胎的方式不同,或存在物種差異.SMYD3基因在孤雌激活和核移植早期胚胎發(fā)育中均呈現(xiàn)出先升高后降低的表達趨勢,卻分別在4細胞期和8細胞期達到峰值,說明SMYD3基因參與兩者發(fā)育過程中的時間存在差異. 早期胚胎發(fā)育到4細胞至8細胞期,正處于大批合子型基因轉(zhuǎn)錄時期,這種狀態(tài)將一直持續(xù)到早期囊胚;而8細胞期階段胚胎正處于母型調(diào)控向合子型調(diào)控轉(zhuǎn)變的時期,也是在離體培養(yǎng)過程中需要克服發(fā)育阻斷現(xiàn)象的時期,涉及早期胚胎發(fā)育基因的適時激活,瞬時表達、定位或消失等基因調(diào)控機制. Li等[18]對豬孤雌胚胎與體外受精胚胎發(fā)育過程中的染色質(zhì)重編程進行比較,發(fā)現(xiàn)孤雌胚胎在合子基因組激活的4細胞時期存在特殊的染色質(zhì)區(qū)室解體過程.SMYD3在上述階段的表達差異,提示其在調(diào)控胚胎重編程的過程中應(yīng)有重要作用.
Oct4基因在4~8細胞期被激活,被認為是在早期發(fā)育過程中參與第1次細胞命運決定,使細胞發(fā)育為滋養(yǎng)層或保留一部分全能細胞的關(guān)鍵因子. 第2次命運決定出現(xiàn)在囊胚期,內(nèi)細胞團部分保持亞全能性,部分分化為原始胚層,Nanog在這時期起決定作用[19]. 兩者作為多能性標(biāo)志因子,其表達水平對早期胚胎重編程具有重要作用. 前人研究表明,下調(diào)SMYD3基因表達在小鼠IVF囊胚中抑制Nanog和Oct4等多能性基因表達[9]. Bai等[10]在牛IVF胚胎中下調(diào)SMYD3基因表達會出現(xiàn)發(fā)育阻滯的現(xiàn)象,能顯著促進8細胞期胚胎Nanog基因表達,對OCT4基因無顯著影響. 本實驗檢測了豬核移植囊胚Nanog和Oct4基因表達情況,其中下調(diào)SMYD3組囊胚Nanog基因檢測不出,證明下調(diào)SMYD3基因可以抑制Nanog基因表達.Nanog基因表達水平較低難以檢出,與小鼠研究結(jié)果相符,與牛研究結(jié)果不同,推測原因可能是胚胎時期或來源不同所造成的結(jié)果差異;與對照組相比,下調(diào)SMYD3組囊胚OCT4基因無顯著差異,與小鼠研究結(jié)果不同,推測存在物種差異. 上調(diào)SMYD3基因表達促進囊胚中Nanog和Oct4基因表達,初步說明SMYD3基因促進了豬核移植早期胚胎的重編程,具有促進豬體細胞重編程的作用.
1)SMYD3基因在豬卵母細胞體外成熟過程中表達較低,在孤雌激活和核移植早期胚胎發(fā)育過程中均呈現(xiàn)出先升高后降低的表達模式.
2) 上調(diào)SMYD3基因表達可提高豬體細胞克隆的囊胚發(fā)育率,促進Nanog和Oct4基因表達提高核移植胚胎體外發(fā)育能力.