曾毅仁，張彩玉，侯晗琦，惲雪丹，李湘萍

亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西大學(xué)，南寧 530004

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育過程中經(jīng)歷了大量的表觀遺傳修飾． 其中，組蛋白修飾確保了卵子發(fā)生過程中基因的正確表達(dá)，平衡了合子基因組的轉(zhuǎn)錄激活． H3K4me3精確地調(diào)控了卵子發(fā)生的起始，動(dòng)態(tài)地控制著早期胚胎的發(fā)育． 組蛋白H3K4me3對調(diào)控基因活化和發(fā)育功能有重要作用，在胚胎干細(xì)胞中調(diào)控重要的多能性相關(guān)基因的表達(dá)．

我們的前期研究[1]表明，H3K4me3在豬卵母細(xì)胞成熟過程中均有表達(dá)，說明H3K4me3在豬卵母細(xì)胞成熟階段起到了重要的調(diào)控作用． 通過敲除Cxxc1基因降低H3K4me3的表達(dá)，不利于組蛋白變體的交換，降低了基因組的可接近性和卵母細(xì)胞中整體的轉(zhuǎn)錄活性[2]． 敲除卵母細(xì)胞中編碼H3K4甲基化酶或去甲基化酶的基因，會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂進(jìn)程受損，包括生發(fā)泡破裂延遲，紡錘體組裝和染色體分離錯(cuò)誤，極體排出率降低． 很多研究都表明環(huán)境的改變會(huì)影響表觀遺傳修飾． Wu等[3]研究表明，小鼠IVF(體外受精)早期胚胎中H3K4me3的表達(dá)模式與體內(nèi)受精胚胎的十分相似，但體內(nèi)受精胚胎中H3K4me3的表達(dá)顯著高于IVF 胚胎，采用TSA(曲古抑菌素A)處理之后，IVF胚胎中的H3K4me3表達(dá)顯著上調(diào)，說明培養(yǎng)條件和環(huán)境不同會(huì)改變組蛋白修飾． 因此，豬卵母細(xì)胞體外成熟效率和質(zhì)量低于體內(nèi)，可能是由于表觀遺傳修飾的改變所致． Sha等[4]研究表明，SN(環(huán)繞核仁)染色質(zhì)構(gòu)型的卵母細(xì)胞比NSN(非環(huán)繞核仁)構(gòu)型的卵母細(xì)胞具有更好的發(fā)育潛能，H3K4me3表達(dá)水平在SN染色質(zhì)構(gòu)型的卵母細(xì)胞中高于NSN構(gòu)型[4]． 因此，適當(dāng)提高H3K4me3的表達(dá)有利于卵母細(xì)胞的體外成熟和早期胚胎的發(fā)育．

本試驗(yàn)通過在豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加CPI-455，調(diào)控卵母細(xì)胞組蛋白甲基化及其相關(guān)基因的表達(dá)，以探討組蛋白H3K4me3在卵母細(xì)胞體外成熟及胚胎發(fā)育過程中的重要作用．

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用卵巢均來源于廣西南寧本地屠宰場． 試驗(yàn)所用胚胎為孤雌胚胎．

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬GV(生發(fā)泡)期卵母細(xì)胞的獲取與體外成熟

用預(yù)熱好的生理鹽水將卵巢清洗干凈后，用10 mL注射器抽取3～8 mm的卵泡液，靜置15 min后，在顯微鏡下挑選3層以上卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體． 將COCs(卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體)清洗干凈后，移入成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)． 0～22 h將卵母細(xì)胞放入含有激素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，(22～44] h將卵母細(xì)胞移入另一個(gè)不含激素的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)． 試驗(yàn)組添加不同濃度的CPI-455處理．

1.2.2 豬卵母細(xì)胞的孤雌激活

試驗(yàn)前將融合儀的參數(shù)設(shè)置為80 μs，50 V/mm和3次脈沖，并在培養(yǎng)箱中平衡電激活液和胚胎培養(yǎng)液． 清洗融合槽，將卵母細(xì)胞在激活液中清洗3遍后在激活槽中進(jìn)行電激活． 激活過的卵母細(xì)胞移入平衡好的胚胎培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱平衡15 min，然后移入覆蓋有礦物油的胚胎培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)． 24 h統(tǒng)計(jì)胚胎分裂率，48 h統(tǒng)計(jì)4-細(xì)胞率，7 d統(tǒng)計(jì)囊胚率．

1.2.3 囊胚細(xì)胞總數(shù)的鑒定

將囊胚細(xì)胞放入4%的多聚甲醛中固定12 h，然后移入10 μg/mL Hoechst33342染色液中，避光室溫染色10 min． 用PBS(磷酸緩沖鹽溶液)將囊胚細(xì)胞清洗干凈后，移入載玻片的抗淬滅劑中，用凡士林封片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并做好試驗(yàn)記錄．

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光

收集不同時(shí)期的卵母細(xì)胞和孤雌囊胚，用4%多聚甲醛固定后在室溫下用1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)透化30 min，之后用1% BSA(牛血清蛋白)進(jìn)行非特異性位點(diǎn)封閉1～2 h，封閉后用T-BSA-PBS(吐溫20-BSA-PBS)洗3次，之后放入H3K4me3的一抗中4 ℃ 12 h． 然后將樣品放入培養(yǎng)箱孵育30 min，再用T-BSA-PBS清洗3遍，放入裝有二抗的EP(Eppendorf)管中，避光孵育1.5 h，然后用清洗液清洗3遍，最后用10 μg/mL Hoechst33342復(fù)染10 min，放入滴有抗淬滅劑的玻片上，凡士林封片鏡檢．

1.2.5 樣品的微量反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR(實(shí)對熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測

收集不同時(shí)期的豬卵母細(xì)胞和孤雌囊胚，清洗干凈后移入裝有細(xì)胞裂解液的EP管中并于-80 ℃冰箱保存． 微量反轉(zhuǎn)錄按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄得到的樣品存放于-20 ℃?zhèn)溆茫?將反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行qRT-PCR檢測，觀察不同處理組基因的表達(dá)情況(表1)． 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃進(jìn)行5 min，95 ℃進(jìn)行30 s，60 ℃進(jìn)行1 min，共40個(gè)循環(huán)． 豬的18S作為內(nèi)參基因，目的基因的相對表達(dá)量用2-ΔΔCT法計(jì)算，引物設(shè)計(jì)和試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[1]和文獻(xiàn)[5]．

表1 qRT-PCR反應(yīng)引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)結(jié)果均使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，早期胚胎發(fā)育率先通過反正弦變化后再進(jìn)行分析． 每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)至少3次，每次重復(fù)試驗(yàn)中至少隨機(jī)挑選10個(gè)以上卵母細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)．p<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p>0.05表示差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 0～22 h CPI-455處理對豬卵母細(xì)胞體外成熟及早期胚胎發(fā)育的影響

如表2所示，在豬卵母細(xì)胞體外成熟0～22 h過程中添加不同濃度的CPI-455處理，發(fā)現(xiàn)5 μmol/L處理組的第一極體排出率顯著高于未處理組、1 μmol/L組和10 μmol/L組(88.80% vs 78.88%，79.23%，78.91%，p<0.05)． 各組之間的胚胎分裂率、4-細(xì)胞率均無顯著差異(p>0.05)． 5 μmol/L處理組的囊胚率顯著高于未處理組(41.44% vs 28.35%，p<0.05)，與1 μmol/L和10 μmol/L組之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)． 各組之間囊胚細(xì)胞總數(shù)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)．

表2 體外成熟0～22 h過程中添加CPI-455對豬卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎發(fā)育的影響

2.2 (22～44] h與0～44 h采用CPI-455處理對豬卵母細(xì)胞體外成熟和早期胚胎發(fā)育的影響

如表3所示，在豬卵母細(xì)胞體外成熟(22～44] h過程中添加不同濃度的CPI-455處理，發(fā)現(xiàn)各組之間第一極體排出率、4-細(xì)胞率和囊胚細(xì)胞總數(shù)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)． 5 μmol/L處理組的胚胎分裂率顯著低于未處理組和1 μmol/L處理組(74.51% vs 84.62%，85.87%，p<0.05)． 如表4所示，豬卵母細(xì)胞體外成熟0～44 h添加不同濃度的CPI-455處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)各組之間的第一極體排出率、胚胎分裂率、4-細(xì)胞率、囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)．

表3 體外成熟(22～44] h中添加CPI-455對豬卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎發(fā)育的影響

表4 體外成熟0～44 h中添加CPI-455對豬卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎發(fā)育的影響

基于以上結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)均采用體外成熟0～22 h 添加5 μmol/L處理的方法．

2.3 CPI-455處理對豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中組蛋白H3K4me3表達(dá)的影響

采用免疫熒光技術(shù)檢測未處理組和5 μmol/L處理組的GV期、22 h和MⅡ期(成熟)卵母細(xì)胞及囊胚中H3K4me3的表達(dá)情況． 如圖1、圖2所示，GV期卵母細(xì)胞中H3K4me3有表達(dá)，兩組中22 h和MⅡ期卵母細(xì)胞中未檢測到H3K4me3表達(dá)信號． 與未處理組相比，5 μmol/L CPI-455處理組的囊胚中H3K4me3表達(dá)顯著提高(p<0.05)．

圖1 CPI-455處理對不同時(shí)期豬卵母細(xì)胞和囊胚中H3K4me3表達(dá)的影響

在相同時(shí)期各組之間*表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)． 試驗(yàn)重復(fù)數(shù)n=3．圖2 GV期卵母細(xì)胞和囊胚中H3K4me3的相對熒光水平

2.4 CPI-455處理對豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中重要基因表達(dá)的影響

采用qRT-PCR方法，檢測CPI-455處理對豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果如圖3所示． 與未處理組相比，5 μmol/L處理組的22 h卵母細(xì)胞中KDM5A和KDM5B的表達(dá)均顯著降低(p<0.05)；5 μmol/L處理組的MⅡ期卵母細(xì)胞中KDM5A的表達(dá)顯著降低(p<0.05)，KDM5B的表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；5 μmol/L處理組囊胚中多能性基因Nanog，Oct4，CDX2的表達(dá)均顯著提高(p<0.05)．

在相同時(shí)期各組之間*表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義． 試驗(yàn)重復(fù)數(shù)n=3．圖3 CPI-455處理對豬卵母細(xì)胞和囊胚中重要基因表達(dá)的影響

3 討論與分析

組蛋白修飾是最重要的表觀遺傳修飾之一，在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[6-7]． 組蛋白修飾主要包括乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化等，其中組蛋白甲基化在基因表達(dá)調(diào)控和卵母細(xì)胞生長中起重要作用[8]． 組蛋白甲基化受組蛋白甲基化酶和去甲基化酶共同調(diào)節(jié)，研究表明小鼠卵母細(xì)胞中MLL2(H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶)的缺乏會(huì)直接導(dǎo)致排卵停止和卵母細(xì)胞死亡；在MLL2不足的卵母細(xì)胞中，H3K4me2/3的表達(dá)降低，導(dǎo)致非正常卵母細(xì)胞成熟和異常的基因表達(dá)，表明了H3K4me2/3水平對小鼠卵母細(xì)胞成熟的重要性[9]． 在小鼠和人類干細(xì)胞中，大多數(shù)H3K4me3對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是維持基本生物學(xué)活性和干細(xì)胞多能性的關(guān)鍵因素[10]． H3K4me3在囊胚中存在大量表達(dá)，說明H3K4me3對胚胎發(fā)育和囊胚形成具有重要的調(diào)控作用． 尚明保[11]的研究表明，小鼠體內(nèi)受精胚胎從受精卵到囊胚期的H3K4me3表達(dá)水平均高于其在體外受精各期胚胎的表達(dá)． 眾多研究結(jié)果都表明，H3K4me3對卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育具有重要的調(diào)控作用．

在人卵母細(xì)胞中H3K4me3呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)表達(dá)，從GV期到MII期呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，合子期到4-細(xì)胞期表達(dá)升高，8-細(xì)胞期表達(dá)最低，囊胚期急劇上升[12]． 在豬胚胎中，H3K4me3表達(dá)水平從受精卵時(shí)期開始下降，到桑椹胚期至最低水平，隨后在囊胚中表達(dá)上升[13]． 我們的研究也表明H3K4me3在豬卵母細(xì)胞和早期胚胎中呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)表達(dá)，但本次試驗(yàn)在豬卵母細(xì)胞成熟22 h和MII期并未檢測到H3K4me3的表達(dá)，與沈開元[1]對豬卵母細(xì)胞的研究結(jié)果不同，究其原因可能是由于成熟培養(yǎng)液成分不同，從而影響了H3K4me3的表達(dá)模式．

CPI-455是一種組蛋白去甲基化酶抑制劑，可特異性抑制KDM5A/B的活性，從而提高H3K4me3的整體表達(dá)水平． 本試驗(yàn)在卵母細(xì)胞成熟過程中添加CPI-455，抑制了卵母細(xì)胞中組蛋白去甲基化酶KDM5A和KDM5B的表達(dá)，提高了囊胚中H3K4me3以及相關(guān)多能性基因的表達(dá)，從而提高了豬卵母細(xì)胞體外成熟率和囊胚形成率． 以往的研究也表明，在果蠅卵母細(xì)胞中，組蛋白甲基化酶KDM5可調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)第一次分裂時(shí)期中的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，KDM5缺失會(huì)引起H3K4me3表達(dá)增加[14]． 通過表達(dá)一個(gè)顯性失活的組蛋白H3突變體抑制H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，會(huì)使合子基因組激活失敗，損害胚胎的發(fā)育[15]，這表明動(dòng)態(tài)的組蛋白甲基化修飾H3K4me3對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要．