孫秀敏， 龐 卯， 馮 豐， 劉 斌， 戎利民， 何留民

（中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院脊柱外科，廣東省微創(chuàng)脊柱外科工程技術(shù)研究中心，廣東省微創(chuàng)脊柱外科質(zhì)量控制中心，廣州 5 1 0630）

1 脊髓損傷

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全球每年約有25～50萬人患病。脊髓損傷發(fā)生于機動車事故、跌倒、暴力和運動損傷等，而道路交通事故是最常見的原因[1]。在美國/中國每年約有1.7/10萬新增病例，男性占4/5，發(fā)病率最高年齡組是16～30歲[2]。然而，只有不到1%的SCI病人通過治療可以恢復(fù)，大多數(shù)患者存在不同程度的殘疾，不僅為患者的身心健康帶來傷害，而且給家庭、社會經(jīng)濟帶來沉重的負擔(dān)[3]，是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。

急性脊髓損傷通常是由于脊柱的突然損傷致骨折或椎體脫位而引起[4]。脊髓損傷分為兩個階段，即原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷（圖1）。原發(fā)性損傷包括神經(jīng)實質(zhì)破壞、軸突網(wǎng)絡(luò)破壞、出血和膠質(zhì)膜破壞，脊髓損傷嚴(yán)重程度主要決定于初始破壞程度和脊髓受壓的持續(xù)時間[1]。繼發(fā)性損傷分為急性期、亞急性期和慢性期。原發(fā)性損傷期之后，急性繼發(fā)性損傷期表現(xiàn)為血管損傷、離子失衡、興奮性毒性、自由基產(chǎn)生、鈣內(nèi)流增加、脂質(zhì)過氧化、炎癥、水腫、壞死等病理生理特征[1]。亞急性繼發(fā)損傷期表現(xiàn)為神經(jīng)元凋亡、軸突脫髓鞘、沃勒變性、軸突重塑、膠質(zhì)瘢痕形成等特征。慢性繼發(fā)損傷期的特征是囊腔形成、軸突回縮、纖維及膠質(zhì)瘢痕成熟等[5]。

圖 1 脊髓損傷后的病理生理示意圖，細胞和細胞外基質(zhì)在損傷區(qū)域沉積的過程：（a）脊髓損傷后急性期（0～72 h）損傷導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡和大量炎性細胞遷移到損傷區(qū)域；（b）脊髓損傷后慢性期（損傷72 h之后），慢性空洞形成，星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生和細胞外基質(zhì)的沉積Fig. 1 The schematic of SCI pathophysiology, cellular and extracellular composition of the spinal injury scar:（a）In the acute post-injury phase（0—72 h）, neural cell death and the release of a number of inflammatory cell in the injury site;（b）In the chronic post-injury phase（after 72 h）, a chronic cystic cavity develops, reactive astrocytes hypertrophy and extracellular deposition

2 治療策略

目前臨床上對脊髓損傷修復(fù)的早期治療主要采用手術(shù)和激素治療。對于急性創(chuàng)傷、慢性壓迫性和嵌頓性損傷，在損傷后24 h內(nèi)進行脊髓減壓手術(shù)，有利于改善神經(jīng)系統(tǒng)紊亂及后續(xù)運動功能的恢復(fù)[6]。另外，針對脊髓損傷急性階段，臨床上還采用皮質(zhì)類固醇藥物如甲基強的松龍來控制早期急性炎癥。但是研究也顯示，高劑量用藥超過48 h會引起消化道出血、感染等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至造成多器官的損害，而且激素類藥物對脊髓損傷的治療效果目前還不確定[7]。

在急性期之后，脊髓損傷患者會進入相對穩(wěn)定的慢性階段，在此階段，臨床上主要以護理和康復(fù)訓(xùn)練為主。與此同時，圍繞促進脊髓組織神經(jīng)再生的治療措施也在持續(xù)探索中，這也是脊髓損傷治療和修復(fù)研究領(lǐng)域中的熱點和難點。國內(nèi)外已經(jīng)開展了大量研究，主要采用細胞移植，分子藥物或（和）生物材料支架等治療策略和方法。

細胞移植和分子藥物治療可以為損傷區(qū)域提供細胞和營養(yǎng)支持，同時也可以改善損傷區(qū)域微環(huán)境，主要表現(xiàn)為調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，分泌促再生因子，促進損傷區(qū)域神經(jīng)再生和軸突髓鞘化等作用[8-11]。但是，由于損傷區(qū)域缺乏橋接物的支撐，移植的細胞或營養(yǎng)因子等因腦脊液循環(huán)難以定植，導(dǎo)致細胞和生物活性因子不能有效發(fā)揮作用[12,13]。

近幾年研究發(fā)現(xiàn)，生物支架材料在治療脊髓損傷的過程起著重要作用。支架材料本身的結(jié)構(gòu)性能可以調(diào)控損傷區(qū)域微環(huán)境，促進軸突再生和動物行為學(xué)功能恢復(fù)[14]。另外，可以與細胞和生物活性分子一起以一種綜合的方式來達到恢復(fù)、維持或提高組織功能恢復(fù)的目的。而生物支架材料的引入不僅能夠填充損傷區(qū)域的缺損，為再生的組織提供引導(dǎo)，同時可以為種子細胞提供支撐和引導(dǎo)，加載多種活性物質(zhì)和營養(yǎng)因子等[15,16]。因此生物材料支架是神經(jīng)組織工程修復(fù)的關(guān)鍵。

3 脊髓損傷修復(fù)生物材料支架的研究進展

組織再生支架設(shè)計的主要功能是仿生天然細胞外基質(zhì)（ECM）組織結(jié)構(gòu)填充損傷區(qū)域空洞，并且能夠引導(dǎo)組織再生，同時可以作為細胞或生物活性因子的載體[17]。理想的支架具有如下屬性和特征：（1）良好的生物相容性、與宿主能夠很好地整合、不引起免疫反應(yīng)、較好的生物活性和理想的電荷密度；（2）隨著組織的再生逐漸降解，且降解產(chǎn)物無毒性，易于被機體清除；（3）理想的物理機械特性，與周圍組織具有相適應(yīng)的彈性模量，能夠與周圍組織更好地融合；（4）完全相互連通的幾何結(jié)構(gòu)，有利于交換；（5）理想的表面特性，可以調(diào)控細胞的行為，對軸突具有物理導(dǎo)向作用；（6）易功能化，能夠根據(jù)需要負載細胞或因子。理想的神經(jīng)支架應(yīng)具有包括力學(xué)性能、生物化學(xué)特征、拓撲結(jié)構(gòu)和電子信號等在內(nèi)的多種優(yōu)勢[18-28]。這些優(yōu)勢可以幫助支架模擬體內(nèi)組織的原生細胞外基質(zhì)，通過提供更好的接觸導(dǎo)向來促進神經(jīng)軸突生長和細胞的黏附、增殖、遷移和生存。

3.1 生物材料種類

生物材料可以從天然或合成聚合物中獲得，不管是天然生物材料或者是合成生物材料在應(yīng)用中各有優(yōu)缺點。

3.1.1 天然來源生物材料 天然材料相比合成材料所具有的優(yōu)勢：一些材料本身是ECM組分，存在原生的配體環(huán)境，固有的生物活性，并經(jīng)歷過自然重構(gòu)。因此，移植后能夠與宿主組織良好地整合，更容易實現(xiàn)從實驗到臨床的轉(zhuǎn)化。在神經(jīng)組織工程中用于支架設(shè)計的天然高分子材料常用的細胞外基質(zhì)成分有膠原蛋白、明膠、透明質(zhì)酸（HA）、脫細胞基質(zhì)等，以及非細胞外基質(zhì)成分殼聚糖和海藻酸鹽等。

（1）膠原蛋白：膠原蛋白是人體中含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)，也是研究最廣泛的ECM成分之一。目前已有28種不同亞型被鑒定出來，它們的特征都是三螺旋狀結(jié)構(gòu)[29,30]。由于膠原蛋白抗原性低、生物相容性和生物降解性好，已成為脊髓損傷修復(fù)中研究最多的天然高分子材料。

首先，膠原具有大量的結(jié)合位點，可以負載生物活性因子或細胞等，適合細胞的黏附、增殖和分化等特點[31-33]。例如，中科院戴建武團隊長期采用同軸排列的膠原纖維束功能性結(jié)合NT3, BDNF, bFGF,LDN193189, SB431542, CHIR99021, P7C3-A20, EphA4LBD和PlexinB1LBD等因子和藥物，并負載神經(jīng)干細胞（Neural stem cell, NSC）進行脊髓損傷再生修復(fù)，能明顯減小損傷區(qū)域的空洞、減弱膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生、促進神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元、促進軸突再生和髓鞘化，最終促進動物行為學(xué)功能的恢復(fù)[34-38]。采用蜂窩狀膠原蛋白海綿結(jié)構(gòu)支架[39]或膠原纖維膜[40]負載間充質(zhì)干細胞（MSC）或NSC也可以促進干細胞分化為神經(jīng)元，改善再生微環(huán)境，促進動物行為學(xué)功能的恢復(fù)。

另外，由于膠原蛋白模量與人體軟組織強度相似，纖維可以吸水膨脹，因此可以制成可注射水凝膠支架原位注射到脊髓損傷區(qū)域。Marchand等[41]將膠原水凝膠注射到損傷區(qū)域形成膠原纖維網(wǎng)絡(luò)，可以促進細胞遷移到損傷區(qū)域和軸突再生。膠原蛋白可制備成與神經(jīng)組織更加相似的納米纖維結(jié)構(gòu)，因此也是促進神經(jīng)再生比較理想的支架[42]。有研究將膠原制成納米纖維結(jié)構(gòu)支架，發(fā)現(xiàn)可以促進干細胞分化為神經(jīng)元并表達神經(jīng)元相關(guān)蛋白[43]。

然而，膠原如果處理不好，也會成為神經(jīng)再生的障礙[44,45]。Brook課題組[46,47]制備Ⅰ型膠原支架，在脊髓修復(fù)中發(fā)現(xiàn)支架周圍會形成纖維和膠質(zhì)瘢痕，不利于與宿主組織進行整合。支架內(nèi)微血管不夠成熟，血-脊髓屏障改造不良。

（2）HA：HA是一種線性的、無分支的非硫化糖胺（GAG），是由重復(fù)的二糖（β-1,4-D-葡糖醛酸（稱為尿酸）和β-1,3-N-乙酰葡萄糖胺）組成的一種長鏈多糖，是細胞外基質(zhì)HA的重要組成部分[48-50]，在體內(nèi)可酶解成不同分子量的HA[51]。研究發(fā)現(xiàn)，高分子量HA可提高神經(jīng)再生修復(fù)功能[52,53]。低分子量HA可促進血管生成。另外還有研究顯示，HA能夠刺激生物活性因子如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的分泌，促進脊髓損傷后的神經(jīng)元存活和軸突再生髓鞘化等[54]。

HA水凝膠相互連接的多孔結(jié)構(gòu)可以輸送營養(yǎng)，促進細胞、血管和神經(jīng)的滲透。因此被用來作為藥物、因子和細胞的理想載體[55]。He等[56]制備的透明質(zhì)酸-甲基纖維素（HAMC）水凝膠負載BDNF和抗炎因子KAFAK，能夠減少促炎因子釋放和空洞膠質(zhì)瘢痕的形成，促進神經(jīng)元存活和軸突再生。而HA水凝膠負載人NSC，可促進人NSC存活、分化為神經(jīng)譜系細胞，促進動物行為學(xué)功能恢復(fù)[57]。

但HA黏附性較差，需要對其進行修飾。同時，因HA的水溶性較強，可通過交聯(lián)劑將其轉(zhuǎn)化為可注射的形式[58]。Zaviskova等[55]使用精氨酸、甘氨酸和天門冬氨酸序列（RGD）修飾HA的可注射水凝膠支架負載MSC，可以減少星形膠質(zhì)細胞增生，促進血管組織再生。Sakiyama-Elbert課題組[53]利用透明質(zhì)酸水凝膠混合星形膠質(zhì)細胞來源的脫細胞基質(zhì)與V2a中間神經(jīng)元，可減少巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞聚集和膠質(zhì)瘢痕的形成，促進軸突長入損傷區(qū)域。

（3）組織來源脫細胞基質(zhì)材料：脫細胞基質(zhì)生物材料由原生動物組織脫細胞制備而成。其優(yōu)勢是可以較好地保留原組織或器官的細胞外基質(zhì)蛋白成分、活性因子和天然的3D結(jié)構(gòu)，具有良好的生物相容性和非免疫原性，力學(xué)性質(zhì)、降解模式與組織一致[51]。脊髓損傷修復(fù)所用的的ECM主要來于腦、脊髓和外周神經(jīng)組織[59]。來源于脊髓的脫細胞基質(zhì)主要由糖氨基葡聚糖（透明質(zhì)酸）和蛋白聚糖組成，另外還包括：層黏連蛋白、軸突導(dǎo)向因子-1、巢蛋白、絡(luò)絲蛋白、腱糖蛋白以及生長因子，如FGF-2和EGF等[60]。

目前關(guān)于脫細胞基質(zhì)的研究雖不夠充分，但它卻是一種非常有潛力的修復(fù)材料，也是近期研究的熱點。Guo等[61]移植脊髓來源的脫細胞基質(zhì)支架，可使損傷區(qū)域滲透的T-細胞數(shù)量明顯減少。Crapo等[62]比較了豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)3個不同部位（腦源性、脊髓源性和視神經(jīng)源性）來源的脫細胞基質(zhì)支架，證實支架中均殘留有NGF、bFGF和VEGF等神經(jīng)營養(yǎng)因子，并能促進PC12細胞的增殖、遷移和分化。Hong等[63]移植豬源性腦脫細胞基質(zhì)水凝膠，可以促進巨噬細胞向M2型極化和動物行為學(xué)功能的恢復(fù)。Cerqueira等[64]移植大鼠周圍神經(jīng)脫細胞基質(zhì)水凝膠負載雪旺細胞（SC），可提高其在損傷區(qū)域的存活率，并促進軸突再生和髓鞘化。全大萍課題組[65]制備外周神經(jīng)來源的脫細胞基質(zhì)、鼠尾膠原Ⅰ型水凝膠和脊髓來源的脫細胞基質(zhì)水凝膠（圖2），研究表明脊髓來源的水凝膠能夠為脊髓損傷區(qū)域提供更有利的微環(huán)境，促進損傷區(qū)域神經(jīng)干細胞的募集和向神經(jīng)元方向分化，促進軸突再生。

圖 2 （a）脫細胞基質(zhì)周圍神經(jīng)基質(zhì)（DNM）和脫細胞脊髓基質(zhì)（DSCM）；（b）天然或脫細胞周圍神經(jīng)/脊髓組織學(xué)切片的 H&E 染色（箭頭指示細胞核）；（c）消化和離子平衡后的DSCM預(yù)凝膠；（d）DSCM水凝膠；（e）COLI, DNM 和 DSCM水凝膠納米纖維結(jié)構(gòu)的 SEM圖像[65]Fig. 2 （a）Decellularized peripheral nerve matrix and decellularized spinal cord matrix; （b） Histological sections with H&E staining of the native or decellularized peripheral nerve/spinal cord, respectively (The arrows indicate cell nucleus); （c） Pre-gel solution obtained after digestion and ionic balance of DSCM in a tilted vial; （d）The appearance of DSCM-gel after sol-gel transition;（e）SEM images of the nanofibrous structure in the COLI, DNM, and DSCM hydrogels [65]

（4）殼聚糖：殼聚糖主要存在于甲殼類動物如昆蟲、螃蟹、蝦以及細菌和真菌的細胞壁中，它具有與糖胺聚糖相似的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，是細胞外基質(zhì)的主要成分[66]和構(gòu)建神經(jīng)再生支架的理想選擇[67,68]。Yao課題組[69]移植殼聚糖支架，海藻酸鹽支架、殼聚糖-海藻酸鹽復(fù)合支架，其中與另兩種支架相比，殼聚糖支架獲得較多的再生軸突纖維，并且膠質(zhì)細胞較少。Cheng等[69]在脊髓損傷部位移植內(nèi)部填充層黏連蛋白（LN）的殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管，可降低炎癥細胞反應(yīng)，促進軸突再生和動物行為學(xué)功能恢復(fù)。李曉光課題組[70]移植殼聚糖多孔支架負載NT3，可促進神經(jīng)干細胞分化為成熟神經(jīng)元并促進動物行為學(xué)功能恢復(fù)。Ji等[71]移植負載BDNF和NT3絲素蛋白-殼聚糖支架，可促進GAP-43神經(jīng)纖維的再生，減少GFAP的反應(yīng)性增生和Caspase-3的表達。Zhang等[72]移植負載MSC的殼聚糖水凝膠支架，可減少膠質(zhì)瘢痕的形成和細胞死亡，起到抗炎抗氧化作用。（5）海藻酸鹽：海藻酸是一種天然的、由棕色藻類和細菌獲得的線性多糖。它由（1-4）-連接β-D-曼紐酸（M）和α-l-磺酸單體（G）組成，具有較好的生物相容性、生物降解性、非抗原性和螯合性等優(yōu)點[73]，并且具有增強干細胞向神經(jīng)元分化并表達神經(jīng)元相關(guān)標(biāo)記物的潛能，是神經(jīng)干細胞移植的理想載體[74-76]。Sun等[77]研究證實高G含量的海藻酸鹽珠能促進NSC神經(jīng)保護因子的分泌。Sitoci-Ficici等[78]將海藻酸鹽水凝膠移植入2 mm脊髓損傷動物模型中，可改善大鼠行為學(xué)功能。文獻[79, 80]制備的海藻酸鹽各向異性毛細管水凝膠支架，負載BDNF和BMSC后，通道內(nèi)仍有大量BMSC存活，軸突再生并沿毛細管定向生長。

3.1.2 合成生物材料 與天然材料相比合成生物材料的優(yōu)勢是：含有的雜質(zhì)、病原體或污染物相對較少，對批量處理的可變性更低，具有生物可降解性、非炎癥性、非毒性等特點。另外，還具有可改變的機械和物理特性。被廣泛用于制造支架的合成聚合物主要包括聚己內(nèi)酯（PCL）、聚乳酸（PLLA）、聚乙醇酸-乳酸共聚物（PLGA）等。（1）PCL：PCL是一種玻璃化溫度較低、室溫下較柔軟、呈橡膠態(tài)的半結(jié)晶性聚合物。具有高彈性、低毒性、良好的力學(xué)性能、可生物降解和生物相容性較好的特點[81]。另外，PCL能夠促進神經(jīng)干細胞向少突膠質(zhì)細胞方向分化和軸突髓鞘的形成，是脊髓損傷組織工程修復(fù)中較理想的材料[82,83]。

Wong等[84]利用PCL模仿灰質(zhì)或白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計了幾種不同微結(jié)構(gòu)的支架（圖3），將其移植入全橫斷脊髓損傷動物模型中，其開放式的微通道結(jié)構(gòu)更有利于軸突的再生和髓鞘化并在軸向引導(dǎo)的作用下生長。Silva等[85]制備的淀粉-PCL的3D復(fù)合支架可以保護損傷區(qū)域并促進動物行為學(xué)功能的恢復(fù)。Flynn等[86]移植的PCL/pHEMA復(fù)合支架，其中的pHEMA凝膠縱向通道可以定向引導(dǎo)脊髓損傷軸突再生。

圖 3 （a）：ⅰ—實心的圓柱體，ⅱ—單通道管，?！?通道管，ⅳ—有核開放性結(jié)構(gòu)，ⅴ—無核開放性結(jié)構(gòu)；（b）通道管模具設(shè)計線框圖；（c）無核開放性結(jié)構(gòu)設(shè)計模具；（d）有核開放性結(jié)構(gòu)設(shè)計模具[84]Fig. 3 （a）ⅰ—Solid cylinder, ⅱ—Tube, ⅲ—Channel, ⅳ—Open-path without core, ⅴ—Open-path without core; （b） Wireframe view of a mold for the channel design; （c） Open-path without a core mold blueprint; （d） Open-path with core blueprint[84]

PCL支架作為因子和細胞的理想載體在治療脊髓損傷中也被廣泛應(yīng)用。Hwang等[87]制備的PCL支架負載NT3和NSC，能促進軸突再生和動物行為學(xué)功能恢復(fù)。Li等[88]利用PCL/PLGA支架負載人牙囊細胞（hDFCs），可促進移植細胞的存活。Gomez等[89]將PCL制備成微球，并封裝反式維甲酸（RA），然后與人誘導(dǎo)多能干細胞（hiPSCs）共培養(yǎng)，可使神經(jīng)元標(biāo)記相關(guān)蛋白TUJ1表達增加。采用電紡絲制備RA/PCL支架并負載hiPSCs后，可促進干細胞向神經(jīng)元分化。

PCL常被用于電紡絲制備各種膜纖維結(jié)構(gòu)。Gelain等[90]利用電紡絲制備PCL/PLGA復(fù)合微管支架，用RADA16修飾負載生長因子，不僅促進了軸突沿著電紡絲纖維方向定向再生，而且促進了血管再生和動物行為學(xué)功能恢復(fù)。Lam等[91]利用電紡絲制備的3D納米纖維水凝膠支架負載小非編碼RNA和蛋白質(zhì)后，未引發(fā)過度炎癥反應(yīng)和瘢痕組織形成，并可促進軸突再生。

（2）PLLA：PLLA無毒、在體內(nèi)可以被代謝吸收、機械加工性能良好[92,93]，而且獲得各國食品和藥品管理局（FDA）的批準(zhǔn)[94, 95]。

PLLA支架不僅能填充空洞起到橋接作用，而且能夠促進細胞遷移、軸突再生并與周圍宿主組織整合，最終促進動物行為學(xué)功能恢復(fù)[96]。移植PLLA多孔多通道支架，可以促進細胞的黏附，減少損傷區(qū)域空洞的形成和軸突的再生[97,98]。

由于納米纖維結(jié)構(gòu)的PLLA支架與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的ECM結(jié)構(gòu)相似，因此它在神經(jīng)組織工程中得到了廣泛應(yīng)用。PLLA納米纖維結(jié)構(gòu)支架比表面積大、孔隙率高、孔徑分布寬（50～350 nm）[99,100]，可以促進神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元[101]。全大萍課題組[102,103]利用低溫相分離-模具注射技術(shù)制備出微納米纖維結(jié)構(gòu)的PLLA多通道神經(jīng)導(dǎo)管（圖4），體外細胞種植NSC后，納米纖維結(jié)構(gòu)的支架更有利于NSC分化為神經(jīng)元，將其移植入脊髓損傷動物模型中，可以減少炎癥細胞聚集、星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性增生和膠原纖維的沉積，促進神經(jīng)再生，并沿通道定向生長，最終促進動物行為學(xué)功能恢復(fù)。

圖 4 PLLA多通道導(dǎo)管制備裝置示意圖和不同結(jié)構(gòu)多通道導(dǎo)管橫截面的SEM照片[102]Fig. 4 Scheme of the systematized device for fabrication of multi-channel conduits and SEM images of the multi-channel conduits cross section[102]

納米纖維結(jié)構(gòu)支架是細胞和因子移植的理想載體。Patist等[104]移植負載BDNF的PLLA支架，促進了軸突和血管的再生。Binan等[105]采用電紡絲技術(shù)，制備出以PLLA為核，明膠負載視黃酸小分子為殼的雙層結(jié)構(gòu)纖維支架，它可以促進NSC增殖并定向分化為運動神經(jīng)元。Hurtado等[106]利用PLLA負載SC促進了軸突再生和動物行為學(xué)功能恢復(fù)。Sun等[107]采用PLLA納米纖維多通道支架導(dǎo)管內(nèi)填充負載NT3的明膠海綿，移植入全橫斷脊髓損傷模型中，可以減少炎癥細胞的激活和膠原纖維的沉積，促進神經(jīng)干細胞募集并分化為神經(jīng)元，促進動物行為學(xué)功能恢復(fù)。

（3）PLGA：PLGA是乙交酯和丙交酯的無規(guī)共聚物，可生物降解、無毒性且易成膜，用于制作神經(jīng)組織工程中的支架時，可調(diào)控其滲透率、變形、柔韌性等[108-110]。目前，PLGA不僅可以制備成導(dǎo)管和水凝膠支架，而且可以制備成微球作為因子或藥物的載體[111]。

全大萍課題組[112,113]采用模具灌注的方法，制備了PLGA多縱向通道支架負載NT3，經(jīng)體外NSC和SC共培養(yǎng)后，可以將NSC分化為成熟神經(jīng)元，并表達突觸小泡蛋白[114]。移植入脊髓損傷動物模型中，支架內(nèi)有神經(jīng)突觸形成并表達突出小泡蛋白。Teng課題組[115]利用由PLGA與多聚賴氨酸制備的多通道支架負載NSC治療脊髓損傷，可使軸突再生標(biāo)志蛋白GAP-43表達上調(diào)。

Langer課題組[116]研制的PLGA多孔結(jié)構(gòu)支架，可減少炎性細胞聚集，減少星形膠質(zhì)細胞增生，促進軸突再生。Shea課題組[117-120]采用發(fā)泡-微粒過濾-模具成型的方法制備出不同通道和孔隙率的PLGA微孔支架，隨著通道數(shù)目的增多，再生軸突密度增加，孔隙率較高的支架能促進更多細胞遷移到損傷區(qū)域。Yaszemski課題組[121]研究證實，22通道較7通道支架中的再生軸突提高了7倍，450 μm通道內(nèi)的軸突數(shù)量是660 μm通道內(nèi)的2倍，纖維組織環(huán)的面積則減少了1/2。

（4）PEG ：水溶性聚醚類聚合物PEG是一種表面活性劑，它可以促進細胞膜的流動和融合，降低細胞膜的通透性[122]。在急性脊髓損傷階段，PEG可以封閉細胞膜，對神經(jīng)細胞產(chǎn)生保護作用[123,124]。Kim[125]和Ren[126]等分別將PEG600直接移植于急性和慢性脊髓損傷動物模型中，減少了炎性細胞遷移到損傷區(qū)域并促進了軸突再生。

另外，PEG也可與其他材料復(fù)合作為細胞或因子的載體，實現(xiàn)因子的持續(xù)緩慢釋放。Lampe等[127]將PEG水凝膠與PLGA微球復(fù)合并負載BDNF和GDNF后，可以明顯減少膠質(zhì)瘢痕的形成。Grous等[128]將聚異丙基丙烯酰胺（PNIPAAm）與PEG水凝膠復(fù)合并負載BDNF后，可促進軸突生長和動物行為學(xué)功能恢復(fù)。Li等[129]將PEG交聯(lián)HA和明膠制備的復(fù)合水凝膠支架負載少突膠質(zhì)細胞后，可促進細胞的存活和再生軸突的髓鞘化。Piantino等[130]制備的PEG水凝膠支架偶聯(lián)NT3后，可以促進軸突再生和改善動物行為學(xué)功能。

（5）自組裝多肽（SAP）：SAP是通過設(shè)計氨基酸序列，依據(jù)溫度和pH變化自組裝而成的納米纖維水凝膠支架[131]。SAP孔隙率高、比表面積大，有利于細胞的黏附和增殖，同時其生物相容性好，可降解吸收，易功能化等特性[132-134]，使其在脊髓損傷組織工程修復(fù)中應(yīng)用比較廣泛。SAP的主要缺點是成本高，水凝膠的力學(xué)性能不足[135,136]。

研究證實K2（QL）6K2自組裝水凝膠可以減少損傷區(qū)域炎癥反應(yīng)和膠質(zhì)瘢痕的形成，促進軸突再生和動物行為學(xué)功能恢復(fù)[137,138]。本課題組[139]利用RADA16-IKVAV負載CNTF, aFGF, EGF, PDGF-AA和RADA16-RGD負載BDNF, NT3, IGF, bFGF, GDNF,β-NGF，制備的功能自組裝多肽（F/S）水凝膠（圖5）植入脊髓損傷動物模型中，可以促進損傷區(qū)域內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的募集、增殖，并向神經(jīng)元方向分化，促進髓鞘化軸突再生和最終動物行為學(xué)功能的恢復(fù)。

圖 5 含生長因子的F/S水凝膠的形態(tài)特征：（a）含有生長因子的RADA16-IKVAV溶液與RADA16-RGD溶液混合形成的穩(wěn)定水凝膠；（b）F/S水凝膠纖維和（c～e）不同生長因子的水凝膠纖維的AFM照片[139]Fig. 5 Morphological characteristics of the F/S hydrogel containing growth factors:（a）Stable hydrogel was formed by combining RADA16-IKVAV solution containing growth factors and RADA16-RGD solution; (b) AFM images of F/S hydrogel fiber and（c—e）those with different growth factors[139]

3.2 生物材料支架的類型

在脊髓損傷組織工程修復(fù)中，生物材料支架移植的主要作用是提供物理橋接和引導(dǎo)作用，以及作為種子細胞或生物活性因子的載體。目前，常見的支架類型主要有可注射用水凝膠支架以及預(yù)制成型植入型支架兩種。

3.2.1 可注射水凝膠支架 水凝膠具有如下優(yōu)點：（1）很好的生物相容性；（2）伴隨著組織再生可通過水解和酶的方式降解；（3）物理結(jié)構(gòu)可調(diào)控、孔隙率高、滲透性強，有利于細胞的黏附、遷移和生長；（4）較高的含水量和微納多孔結(jié)構(gòu)，是因子和細胞的理想載體，也可為細胞提供營養(yǎng)代謝和物質(zhì)交換場所；（5）可注射，適合于擠壓傷、挫傷、全/半橫斷模型，特別是在擠壓傷模型中，通過微創(chuàng)的方式注射到損傷區(qū)域，可以根據(jù)損傷區(qū)域的結(jié)構(gòu)特點自行形成與損傷結(jié)構(gòu)契合的支架形態(tài)[140,141]。主要缺點是強度較低、降解速率過快，不能夠滿足移植細胞的長期存活和組織再生需要，這也是限制可注射水凝膠應(yīng)用的關(guān)鍵因素。根據(jù)水凝膠的材料來源，可注射水凝膠可以分為人工合成材料水凝膠（聚乙烯醇類、聚丙烯酸及其衍生物等）[142,143]和天然材料來源水凝膠（蛋白質(zhì)類、多糖類等）[144,145]。

3.2.2 預(yù)制成型支架預(yù)制成型支架制備工藝主要有：相分離、注射成型、氣體發(fā)泡、熔融鑄造和3D打印等技術(shù)。制備的支架主要類型為：多孔海綿、導(dǎo)管和3D設(shè)計模型。預(yù)制成型支架是一種在體外制備成型，需要開放性手術(shù)植入損傷區(qū)域的一種支架。這種支架的特點是：（1）可根據(jù)研究目的制備具有特定宏觀和微/納米結(jié)構(gòu)的支架；（2）降解速率慢，可長期為軸突生長和組織再生提供支撐和引導(dǎo)作用；（3）主要適用于規(guī)整的半橫斷或全橫斷的損傷模型中；（4）作為細胞或因子的載體，可以實現(xiàn)對細胞或因子的長時間負載和緩慢釋放[146]。

研究顯示，預(yù)制成型支架在脊髓損傷修復(fù)中具有重要作用，并且支架的宏觀結(jié)構(gòu)形態(tài)、微/納結(jié)構(gòu)、機械強度、表面性能、降解速率和化學(xué)生物活性分子組成等相關(guān)參數(shù)對細胞的命運、損傷微環(huán)境的改善和軸突再生等均有不同程度的影響，但目前仍然有很多問題需要深入探索。多孔海綿結(jié)構(gòu)和3D打印技術(shù)（圖6）在脊髓損傷中的主要作用體現(xiàn)在支架的橋接、負載細胞和生長因子等方向，對支架的內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)并沒有詳細的探討[147]。另外，3D打印技術(shù)還處于探索階段，后續(xù)的細胞和動物學(xué)研究相對較少。本節(jié)主要介紹神經(jīng)導(dǎo)管在脊髓損傷中的研究進展[148,149]。

圖6 模擬脊髓結(jié)構(gòu)的3D打印支架：（a）3D打印機系統(tǒng)裝置；（b）3D打印機打印的連續(xù)層結(jié)構(gòu)；（c）正常大鼠脊髓軸突NF200染色結(jié)果（上方白質(zhì)中軸突高度排列成平行陣列，下方灰質(zhì)中軸突為無序結(jié)構(gòu)）；（d）脊髓中相關(guān)功能軸突線狀排列區(qū)域（束）（運動系統(tǒng)用綠色表示，感覺系統(tǒng)用藍色表示）[147]Fig.6 3D-printed scaffold mimics the spinal cord architecture:（a）3D-printer setup;（b）3D printing creates a structure with one continuous layer;（c）Heavy chain neurofilament （NF200）labeling of axons in rat spinal cord （The axons in the white matter （top of the panel）are highly organized into parallel arrays traveling from rostral to caudal.The axons in the gray matter （bottom of the panel）are not linear）；（d）Axonal projections in the spinal cord are linearly organized into regions（fascicles）containing axons of related function （Motor systems are shown in green and sensory systems are shown in blue）[147]

神經(jīng)導(dǎo)管（NGC）是由生物材料制成的一種用于神經(jīng)修復(fù)的支架。神經(jīng)導(dǎo)管的幾何管狀結(jié)構(gòu)是由神經(jīng)內(nèi)膜、神經(jīng)束膜和神經(jīng)外膜演化而來，可以設(shè)計成不同的形狀，如管狀、纖維狀和矩陣型[150]。設(shè)計最初目的是為了替代神經(jīng)移植。在神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)過程中，通道對軸突生長的引導(dǎo)機制被稱為接觸導(dǎo)向機制，并且可以結(jié)合功能需要對形貌、纖維走向，表面光滑度等進行設(shè)計以改善其性能[151]。另外，神經(jīng)導(dǎo)管與細胞、ECM和神經(jīng)營養(yǎng)因子的結(jié)合，可以有效模擬有利于軸突再生的微環(huán)境，這一支架結(jié)構(gòu)特點被稱為人工細胞外基質(zhì)或信號龕。研究表明這種修復(fù)適用于短距離（4 cm）內(nèi)的神經(jīng)損傷，可以引導(dǎo)神經(jīng)再生，并防止神經(jīng)的異常再生[152-154]。

影響神經(jīng)導(dǎo)管性能的主要因素有：（1）滲透性，決定了導(dǎo)管內(nèi)外營養(yǎng)成分的交換，調(diào)控不同種類細胞的滲入；（2）彈性，確保損傷界面周圍組織不被壓迫損傷；（3）膨脹和降解，降解產(chǎn)物的積累會導(dǎo)致導(dǎo)管的膨脹壓迫周圍組織，因此需要通過調(diào)控通道數(shù)目、大小和共聚物等來控制導(dǎo)管的膨脹程度[155]。另外，在神經(jīng)再生過程中，導(dǎo)管降解性應(yīng)遵循一定的趨勢，確保對軸突的引導(dǎo)作用，并根據(jù)軸突生長的需要降解退出；（4）表面彎曲，可為軸突的生長提供引導(dǎo)信息；（5）合并微絲，可為軸突生長提供形貌引導(dǎo)[21]。

近幾年來，神經(jīng)導(dǎo)管的研究相對較多的是通道的引導(dǎo)作用，但到目前為止研究仍然不夠充分，一些參數(shù)仍需要優(yōu)化，如通道壁的結(jié)構(gòu)仍是值得關(guān)注的問題，通道壁及通道之間不同纖維/超微結(jié)構(gòu)對軸突的接觸導(dǎo)向及損傷微環(huán)境的調(diào)節(jié)亦是亟待解決的問題。

3.3 再生微環(huán)境的構(gòu)筑

3.3.1 微/納米拓撲結(jié)構(gòu)在神經(jīng)組織再生中的應(yīng)用天然ECM是由多種蛋白質(zhì)、蛋白聚糖、糖蛋白、氨基聚糖和纖維等構(gòu)成的3D微/納米纖維結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，纖維直徑50～500 nm。組織工程支架修復(fù)脊髓損傷的另一個重要策略就是模仿天然ECM結(jié)構(gòu)，并負載生物活性物質(zhì)，調(diào)控細胞行為和組織再生微環(huán)境[156]。支架在宏觀結(jié)構(gòu)上的合適孔徑，有利于營養(yǎng)交換和細胞的遷移和長入；在微觀結(jié)構(gòu)上其特定的微/納米纖維結(jié)構(gòu)可調(diào)控細胞的行為[157]。

組織工程支架材料的種類、硬度及材料的結(jié)構(gòu)（孔隙、溝槽、多通道及纖維尺寸等）性能可以調(diào)節(jié)脊髓損傷處的微環(huán)境。另外，支架材料的微納拓撲結(jié)構(gòu)可以影響細胞的黏附、增殖、遷移和分化等命運，而且可以影響細胞-基質(zhì)之間的相互作用[15,158]。

納米纖維結(jié)構(gòu)比表面積較大，有利于促進蛋白的吸附，進而有利于細胞的黏附、增殖和神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化。納米纖維結(jié)構(gòu)支架較多孔結(jié)構(gòu)支架可更明顯地調(diào)控不同種類細胞滲入損傷區(qū)域，減少炎癥細胞的滲入、星形膠質(zhì)細胞增生和膠原纖維沉積在損傷區(qū)域，促進損傷區(qū)域神經(jīng)干細胞的募集和軸突再生，促進巨噬細胞向M2型極化[158]。而微納米纖維結(jié)構(gòu)如何調(diào)控細胞行為，以及其調(diào)控微環(huán)境的機制均不清楚，仍需要探索和研究。

3.3.2 生物活性因子的負載和釋放在神經(jīng)組織再生中的應(yīng)用目前，靜脈注射、腹腔注射和鞘內(nèi)注射等主要給藥方式存在局部易感染、二次損傷、藥物流失，半衰期短等特點。因此，迫切需要一種穩(wěn)定長效的給藥方法。生物支架材料作為藥物或因子的負載和遞送系統(tǒng)，不僅對藥物起一定的保護作用，同時可以為損傷區(qū)域提供穩(wěn)定持續(xù)的給藥微環(huán)境，最大限度地發(fā)揮藥物對微環(huán)境改善和對軸突再生的促進作用。

目前，在中樞神經(jīng)再生中關(guān)于生物支架材料相關(guān)負載因子并控制釋放的研究主要集中在以下幾個方面（詳見表（1））。

（1）聚合物微/納顆粒，主要用于親水性和疏水性分子藥物的控制釋放，如PLGA、PCL等微/納米顆粒。

（2）化學(xué)交聯(lián)，主要是采用交聯(lián)劑將生物活性因子與材料以化學(xué)鍵的方式結(jié)合，主要應(yīng)用在合成材料。

（3）物理共混，一種是直接將生物活性因子與生物材料混合，隨著材料的降解逐步釋放因子；另一種是根據(jù)物質(zhì)帶電荷和親疏水等性能的不同，使材料與因子相互吸附，從而將因子固定在材料表面和內(nèi)部，常見于水凝膠（SAP、透明質(zhì)酸等）、聚合物支架（PCL等）和電紡絲纖維內(nèi)部等負載因子。

表 1生物材料支架負載生物活性因子的研究Table 1 Investigations of biomaterial scaffolds loaded with neurotrophic factors

（4）復(fù)合材料緩釋系統(tǒng)，主要是聚合物或水凝膠支架與微/納米顆粒復(fù)合，這種方法能為因子的釋放提供更好的定位，并實現(xiàn)順序釋放；另外一種常見的支架材料復(fù)合釋放系統(tǒng)，即生物活性材料負載因子修飾聚合物支架，在生物活性材料降解的過程中，實現(xiàn)因子的釋放。復(fù)合材料釋放系統(tǒng)，通過設(shè)計既可以實現(xiàn)生物活性因子的持續(xù)穩(wěn)定釋放，而且可以根據(jù)材料的特點，特定設(shè)計生物活性因子的釋放空間、地點和順序，不同的損傷修復(fù)階段釋放不同的有效因子，將會為神經(jīng)修復(fù)提供最有效的幫助[12,159,160]。

4 討論和展望

生物材料支架在脊髓損傷修復(fù)研究中已經(jīng)取得了較大進展，但仍然存在諸多問題，生物材料支架如何再現(xiàn)天然細胞外基質(zhì)的功能，在材料的制備過程中，其生物力學(xué)、模量、多孔結(jié)構(gòu)、微納米結(jié)構(gòu)等性能的調(diào)控以及對細胞行為的影響仍然是未來需要研究的重點。

目前，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)已經(jīng)成為衡量一個國家生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)發(fā)展水平的重要標(biāo)志之一，生物材料作為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的重要組成部分，在包括脊髓損傷在內(nèi)的多種疾病治療中有著巨大的應(yīng)用潛力及市場需求。然而，生物材料支架移植在脊髓損傷中的臨床應(yīng)用還有很長的路要走。生物材料支架本身性能對細胞行為和微環(huán)境調(diào)控的機制仍不清楚，需進一步闡明神經(jīng)調(diào)控及修復(fù)等機制，為生物材料在脊髓損傷臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用奠定堅實的基礎(chǔ)。

生物材料同時又是組織工程再生修復(fù)的核心，更好地利用生物材料這個載體，結(jié)合細胞、生物活性因子、藥物等調(diào)控脊髓損傷再生微環(huán)境，重建神經(jīng)功能環(huán)路，是未來脊髓損傷修復(fù)研究中的核心內(nèi)容。