范軍朝 宋俊杰 陳勇

肺移植手術過程中，由肺部供血不足、恢復灌注時引起的急性肺損傷是臨床上常見的問題，也是導致肺移植術后受者病死率高的主要因素之一[1]。肺缺血 -再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是一個復雜的病理生理過程，可能與氧化應激、炎癥反應導致的中性粒細胞浸潤，內皮細胞損傷、凋亡壞死等密切相關[2-3]。研究表明，手術中使用的麻醉藥物，尤其是一些吸入型麻醉藥對IRI有保護作用[4]。七氟醚作為全身麻醉中常用的吸入型麻醉藥，具有麻醉誘導迅速、對病人呼吸道刺激小、蘇醒快速完全等優(yōu)勢，同時對多種IRI的器官均具有一定的保護作用[5-7]。研究表明七氟醚對肺IRI也具有一定的保護作用[8]，但具體的分子機制尚不完全清楚。本研究應用大鼠肺IRI模型，探討七氟醚預處理對肺IRI的保護作用及其分子機制，旨在為七氟醚在肺移植中的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

40只健康雄性成年SD大鼠，6～8周齡，體質量220～320 g，由鄭州大學醫(yī)學院動物實驗中心提供。將SD大鼠隨機分成對照組（Sham組）、模型組（LIRI組）、七氟醚預處理組（Sev組）和Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抑制劑 TAK-242 聯(lián)合七氟醚預處理組（TAK+Sev組），每組各10只。Sham組大鼠進行假手術處理。LIRI組大鼠建立肺IRI模型。Sev組大鼠建立肺IRI模型前1 h進行七氟醚干預。TAK+Sev組大鼠尾靜脈注射TAK-242（10 mg/kg），1 min后進行七氟醚干預，1 h后建立肺IRI模型。本研究經河南大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 主要試劑和儀器

七氟醚購自武漢艾美捷科技有限公司；10%水合氯醛購自上海國藥集團化學試劑有限公司；TAK-242、脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick- end labeling，TUNEL）染色試劑盒和酶聯(lián)免疫吸 附 試 驗（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；TLR4 抗體、髓樣分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88） 抗 體、 核 因 子（nuclear factor，NF）-κB 抑 制 蛋 白 α（NF-κB inhibitor protein α，IκBα）抗體、NF-κB p65 抗體、β-actin 抗體及二抗均購自英國Abcam公司；全自動生化分析儀購自美國Berkam公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 動物建模及標本取材

假手術處理：打開胸腔后，動脈夾僅穿過左肺門，不進行阻斷。建立肺IRI模型：術前禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛5 mL/kg進行麻醉，氣管插管后接小動物呼吸機，呼吸頻率70 次/分，吸入氧濃度21%，吸呼比為1:2，潮氣量 10～12 mL/kg。將麻醉后的大鼠固定在手術臺上，剪開頸部皮膚，經右頸靜脈注入肝素鈉500 U/kg，于左側胸骨第5肋間開胸，用無損傷血管鉗夾阻斷左肺門，造成左肺缺血。觀察左肺組織，通氣時不再膨脹，顏色變深，表明阻斷成功。阻斷左肺門1 h后松開動脈夾，再灌注2 h。當松開動脈夾，肺組織迅速膨脹，顏色變回缺血前表示再灌注成功。七氟醚干預：將大鼠置于自制密閉的實驗艙里，調節(jié)七氟醚濃度為2.1%，氧氣濃度為21%，預處理30 min后恢復正常通氣 30 min。

建立肺IRI模型24 h后，經大鼠尾靜脈取血，靜置 1～2 h 后，1 200×g 離心 10 min，分離血清，置于-80℃凍存，用于后續(xù)檢測。而后腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg/kg對大鼠進行麻醉，處死大鼠后取出左肺組織。部分新鮮的肺組織進行濕重/干重（wet-to-dry，W/D）比值測定；部分置于4%多聚甲醛溶液中固定；其余部分肺組織置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實驗方法

1.4.1 病理學檢查 取 4% 多聚甲醛溶液固定 24 h 的肺組織制作石蠟切片，進行蘇木素-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色。將切片烘干后，經二甲苯脫蠟，乙醇梯度洗滌后，蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化后，伊紅染色1 min，自來水沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。采用光學顯微鏡觀察肺組織病理學變化并進行病理損傷評分[9]。

1.4.2 TUNEL 法檢測肺組織細胞凋亡 采用 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測肺組織細胞凋亡，計算細胞凋亡率。將肺組織石蠟切片進行脫蠟復水，蛋白酶K消化，加入TUNEL反應緩沖液后避光孵育，4＇, 6-二脒基 -2-苯 基 吲 哚（4＇, 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復染細胞核，抗熒光猝滅劑封片。熒光顯微鏡下觀察各組細胞凋亡情況，陽性細胞呈紅色熒光。每組選取5張片子，每張片子隨機選取5個視野（×200），細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.4.3 肺組織濕重/干重比值檢測 將新鮮的肺組織用生理鹽水清洗，濾紙吸干表面多余水分后稱重即肺濕重（W），放入65 ℃恒溫干燥箱中干燥48 h，至重量不再減少后稱重即肺干重（D），計算W/D比值。

1.4.4 肺組織中氧化應激相關指標的檢測 取凍存的部分肺組織，加入9倍的生理鹽水勻漿處理，離心后取上清液進行檢測。采用硫代巴比妥酸比色法檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）的水平，WST-8法測定總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的水平。

1.4.5 肺組織和血清中炎癥因子的檢測 采用ELISA檢測肺組織中單核細胞趨化蛋白（monocyte chemotactic protein，MCP）-1、巨噬細胞炎癥蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）-2 和血清中白細胞介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、可溶性細胞間黏附分子（soluble intercellular adhesion molecule，sICAM）-1的水平。采用聯(lián)茴香胺比色法測定肺組織中髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的水平。

1.4.6 蛋白質印跡法檢測相關蛋白的表達 取部分凍存的肺組織，液氮研磨后，加入RIPA 蛋白裂解液充分裂解，提取總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品通過聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，轉膜后采用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，加入一抗[TLR4抗體（1:1 000）、MyD88 抗體（1:1 000）、IκBα 抗體（1:1 000）、NF-κB p65 抗體（1:500），β-actin抗體（1:2 000）]4 ℃孵育過夜，二抗（1:1 000）室溫孵育1 h，滴加ECL底物發(fā)光顯色。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測條帶灰度，計算目的蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 七氟醚對肺組織病理損傷的影響

各組大鼠的肺組織切片HE染色結果見圖1。Sham組肺泡結構清晰，間質和肺泡腔內未見明顯液體滲出和炎癥細胞浸潤。LIRI組大鼠肺組織結構嚴重受損，肺泡壁斷裂，結構紊亂、變形，間質水腫，肺泡內有大量液體滲出和炎癥細胞浸潤，可見較多紅細胞。Sev組和TAK+Sev組肺泡結構相對完整，間質輕度水腫，肺泡內的液體滲出、炎癥細胞浸潤及紅細胞明顯減少，病理損傷減輕。LIRI組和Sev組大鼠肺組織的病理損傷評分分別為（5.41±0.74）分和（3.37±0.57）分，較Sham組[（0.42±0.18）分]均升高（均為P＜0.05）。Sev組大鼠肺組織病理損傷評分較LIRI組降低，而TAK+Sev組大鼠肺組織病理損傷評分[（2.45±0.39）分]較Sev組和LIRI組均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均為P＜0.05）。

圖1 各組大鼠肺組織的病理學表現(xiàn)（HE，×200）Figure 1 Pathological findings in lung tissues of rats among each group

2.2 七氟醚對肺組織濕干重比及細胞凋亡的影響

各組大鼠肺組織TUNEL染色結果見圖2 A、B。與Sham組比較，LIRI組和Sev組大鼠肺組織的細胞凋亡率、W/D比值均升高（圖2B、C，均為P＜0.05）。Sev組和TAK+Sev組大鼠肺組織的細胞凋亡率、W/D比值較LIRI組均降低，TAK+Sev組大鼠肺組織的細胞凋亡率、W/D比值較Sev組降低，差異均有統(tǒng)計學意義（圖2 B、C，均為P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肺組織W/D比值和細胞凋亡率的比較Figure 2 Comparison of W/D ratio and cell apoptosis rate in lung tissues of rats among each group

2.3 七氟醚對肺組織氧化應激相關指標的影響

各組大鼠肺組織MDA和SOD水平比較見圖3。與Sham組比較，LIRI組和Sev組大鼠肺組織中MDA水平均升高，SOD水平均降低（均為P＜0.05）。Sev組和TAK+Sev組的MDA水平較LIRI組均降低，而SOD水平較LIRI組均升高（均為P＜0.05）。與Sev組比較，TAK+Sev組大鼠肺組織的MDA水平降低（P＜0.05），而SOD水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠肺組織MDA和SOD水平的比較Figure 3 Comparison of levels of MDA and SOD in lung tissues of rats among each group

2.4 七氟醚對肺組織和血清中炎癥因子水平的影響

各組大鼠肺組織及血清中炎癥因子水平比較見圖4。與Sham組比較，LIRI組和Sev組IL-6、TNF-α、MCP-1、MIP-2、sICAM-1和 MPO 水 平均升高（均為P＜0.05），Sev組和TAK+Sev組上述炎癥因子水平較LIRI組均降低（均為P＜0.05），TAK+Sev組上述炎癥因子水平較Sev組均降低（均為 P＜0.05）。

圖4 各組大鼠肺組織和血清炎癥因子水平的比較Figure 4 Comparison of levels of inflammatory factors in lung tissues and serum of rats among each group

2.5 七氟醚對肺組織中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

各組大鼠肺組織中相關蛋白表達情況見圖5。與Sham組比較，LIRI組和Sev組大鼠肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65 蛋白相對表達量均升高，IκBα相對表達量降低（均為P＜0.05）。Sev組和TAK+Sev組大鼠肺組織中 TLR4、MyD88、NF-κB p65 蛋白相對表達量較LIRI組均降低，IκBα相對表達量較LIRI組升高（均為P＜0.05）。與Sev組比較，TAK+Sev組中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量均降低，IκBα相對表達量升高（均為P＜0.05）。

圖5 各組大鼠肺組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關蛋白表達的比較Figure 5 Comparison of related proteins of TLR4/MyD88/NF-κB signal pathway in lung tissues of rats among each group

3 討 論

本研究探討七氟醚預處理對SD大鼠肺IRI的保護作用及可能的機制，結果發(fā)現(xiàn)七氟醚預處理能夠減輕肺IRI，而TLR4抑制劑聯(lián)合七氟醚預處理能夠進一步減輕肺IRI過程中的組織損傷，與呂帥國等[10]和Li等[11]的研究結果較為一致。當機體發(fā)生IRI時，損傷部位可產生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），從而引發(fā)體內脂質過氧化，產生MDA，破壞細胞膜和線粒體膜結構，使機體內的一些酶和蛋白質發(fā)生變性而失活，造成機體功能破壞，誘導細胞凋亡[12-14]。而研究表明，七氟醚可以抑制ROS的產生，從而對發(fā)生IRI的器官具有一定的保護作用[15-16]。本研究結果也顯示，IRI時肺組織中MDA水平明顯升高，SOD水平明顯降低，而七氟醚預處理能夠降低MDA水平和升高SOD水平，減輕大鼠肺組織的氧化應激。

炎癥反應是發(fā)生IRI的關鍵因素。發(fā)生肺IRI時往往伴隨著大量中性粒細胞的聚集，而炎癥反應產生的炎癥因子、趨化因子和黏附分子能進一步激活中性粒細胞，并趨化使其發(fā)生浸潤聚集[17]。MPO作為中性粒細胞中的特異性酶，其活性的高低可以間接反映中性粒細胞的聚集程度和炎癥反應程度。而內皮細胞產生的細胞間黏附分子和血管細胞黏附分子能夠促進其與炎癥細胞發(fā)生黏附，導致內皮細胞損傷[18]。炎癥因子如TNF-α能夠激活免疫細胞，促進IL-6等的分泌，啟動級聯(lián)放大反應，促進血管內皮細胞和中性粒細胞的黏附，導致血管通透性受阻，加劇炎癥反應，進一步加重肺損傷[19-20]。楊國慶等[21]研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚預處理可以改善心肌組織損傷，降低NF-κB、TNF-α、IL-6水平。本研究結果顯示七氟醚預處理能夠減輕肺IRI過程中的炎癥反應，抑制氧化應激，減輕肺組織損傷，而七氟醚聯(lián)合TLR4抑制劑處理能夠進一步減輕肺IRI過程的炎癥反應。

肺IRI過程的炎癥反應調節(jié)機制較為復雜，而TLR4作為炎癥開關，可通過調節(jié)MyD88介導的NF-κB信號通路激活機體免疫炎癥反應。NF-κB作為TLR4中重要的信號傳導因子，正常生理條件下以無活性的NF-κB p65、p50/52等形成的四聚體與抑制性蛋白IκBα結合，但在IRI的作用下，IκBα被降解，NF-κB p65分離后單獨轉移到細胞核中，誘導機體釋放大量炎癥因子，引發(fā)瀑布式炎癥反應[22-24]。有研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB信號通路介導的炎癥反應在心肌、腦等器官IRI中發(fā)揮重要的作用[25-27]。呂帥國等[10]研究提示七氟醚能夠通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路，減輕大鼠肺IRI。本研究結果同樣發(fā)現(xiàn)，TLR4抑制劑聯(lián)合七氟醚預處理可下調 TLR4、MyD88和 NF-κB p65蛋白表達，而上調IκBα表達，提示七氟醚預處理能夠抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活，進而減輕肺IRI。

綜上所述，七氟醚預處理能夠抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活，抑制炎癥反應和氧化應激，從而減輕大鼠肺IRI。