陳英倫 衛(wèi)棟 王梓濤 楊修成 劉明昭 戴振航 陳靜瑜

對于藥物或傳統(tǒng)外科手術(shù)無法治療的終末期肺病，肺移植已經(jīng)成為唯一有效的治療方式[1-2]。但目前我國符合標(biāo)準(zhǔn)的供肺數(shù)量無法滿足移植需求，導(dǎo)致部分病人等待肺移植的時間過長而死亡[3]。供者一般來源分為心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after cardiac death，DCD）和腦死亡器官捐獻(xiàn)（donation after brain death，DBD）。與DBD和標(biāo)準(zhǔn)供者肺移植相比，DCD肺移植的缺血損傷更嚴(yán)重，受者圍手術(shù)期病死率更高且長期生存率更低[4]，DCD供肺的利用一直是肺移植領(lǐng)域的難點。離體肺灌注（ex vivo lung perfusion，EVLP）是應(yīng)用于肺移植領(lǐng)域的一種評估供肺功能、延長供肺保存時間和修復(fù)供肺損傷的技術(shù)[5-6]。EVLP可以即時評估供肺功能，為治療（包括基因治療）提供參考[7]，從而改善供肺功能，增加符合肺移植條件供肺的數(shù)量，在一定程度上緩解了供肺短缺的現(xiàn)狀[8-9]。

細(xì)胞因子是免疫系統(tǒng)中最重要的效應(yīng)分子和信使分子之一，在感染和炎癥期間參與免疫反應(yīng)，抑制或促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。因此，控制細(xì)胞因子通路是治療感染和炎癥最有效的策略之一[10]。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10家族細(xì)胞因子在感染和炎癥過程中，可通過抑制過度炎癥反應(yīng)、上調(diào)先天性免疫和促進(jìn)組織修復(fù)維持組織穩(wěn)態(tài)。它們在疾病中的重要作用被許多動物模型、遺傳學(xué)研究和臨床檢測數(shù)據(jù)證實。之前的研究表明在豬肺中過表達(dá)IL-10可減輕移植后炎癥反應(yīng)[11-12]。本實驗通過在EVLP過程中向灌注液加入IL-10，探討IL-10在心臟死亡大鼠供肺功能維護(hù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

成年健康清潔級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量200～300 g，飼養(yǎng)溫度 22～25 ℃，相對濕度 55%～60%，自由飲水?dāng)z食。隨機分成A、B兩組，每組10只，A組為對照組，采用A灌注液，B組為實驗組，采用B灌注液。

1.2 灌注液配方

A灌注液：每100 mL灌注液含右旋糖酐0.24 g，葡萄糖 0.4 g，氯化鈉 0.378 g，白蛋白 7 g，天冬氨酸鉀鎂 0.082 5 g，磷酸氫鉀 0.053 7 g，碳酸氫鈉 0.125 g，谷氨酰胺0.04 g，復(fù)方氨基酸0.067 4 g，氯化鈣0.05 g，注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉0.05 g[13]。

B灌注液：在A灌注液基礎(chǔ)上每100 mL加入1 μg 大鼠 IL-10。

1.3 大鼠EVLP系統(tǒng)構(gòu)建

灌注液循環(huán)回路注入100 mL自制的灌注液。將含有8% CO2、6% O2和84% N2的低氧混合氣通入膜氧合器，利用離心泵提供循環(huán)動力，使灌注液通過膜氧合器去氧后進(jìn)入肺循環(huán)，肺動脈插管前連接壓力監(jiān)測儀記錄動脈灌注壓力。將恒溫水箱與灌注罐加熱層連通。氣管插管使用16號金屬灌胃針，肺動脈插管使用14號金屬灌胃針（圖1）。

圖1 大鼠EVLP系統(tǒng)Figure 1 EVLP system for rat

1.4 動物模型制備

1.4.1 DCD模型建立 腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液100 mg/kg，尾靜脈注射肝素鈉 1 200 U/kg。經(jīng)口氣管內(nèi)插管，機械通氣。前正中開腹，剪斷腹主動脈，室溫放置 1 h。

1.4.2 供肺獲取 前正中切口開胸后，分離主肺動脈干，套線，暫不結(jié)扎，剪開左心耳、右心室，經(jīng)右心室向肺動脈干插入插管，結(jié)扎固定，向肺動脈灌注低鉀右旋糖酐液（low potassium dextran solution，LPD 液）15 mL。迅速游離肺組織，稱量心肺重量備用[14]。

1.4.3 EVLP 程序性復(fù)溫并予以機械通氣及動脈灌注。30 min達(dá)目標(biāo)溫度（40 ℃）、通氣量（7 mL/kg，35次/分）及灌注量 [10 mL/（kg·min）]后維持溫度、通氣及灌注 4 h。

1.5 實驗方法

1.5.1 供肺組織干重/濕重比值計算 灌注結(jié)束后取右肺中葉組織，連續(xù)稱重3次，取平均值，即為濕重（W）。60 ℃過夜烘干后連續(xù)稱重3次，取平均值，即為干重（D），計算供肺組織干重/濕重（dry-to- wet，D/W）比值。

1.5.2 供肺功能及代謝狀態(tài)分析 以復(fù)溫結(jié)束為起始時間，每小時取靜脈端灌注液測量肺靜脈血氧分壓、乳酸水平，同時記錄壓力傳感器峰值讀數(shù)為肺動脈壓。

1.5.3 供肺形態(tài)學(xué)分析 采用10%多聚甲醛溶液固定右肺上葉，常規(guī)行石蠟包埋，切片。蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察[15]。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）染色后于顯微鏡下觀察并拍攝，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染色呈棕褐色為陽性反應(yīng)。

1.5.4 供肺炎癥標(biāo)志物水平檢測 以復(fù)溫結(jié)束為起始時間，每小時留取靜脈端灌注液及少量組織，采 用 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）試劑盒測定灌注液中IL-1α、IL-4、IL-6、 腫 瘤 壞 死 因 子（tumor necrosis factor，TNF）-α、單核細(xì)胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP）-1、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的水平。

1.6 研究內(nèi)容

比較兩組供肺外觀及D/W比值；分析兩組供肺功能和代謝狀態(tài)，包括肺靜脈血氧分壓、肺動脈壓及乳酸水平；觀察兩組供肺形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，包括病理學(xué)結(jié)果及細(xì)胞凋亡情況；比較兩組供肺炎癥標(biāo)志物水平，包括MCP-1、IL-6、IL-4、TNF-α、IL-1α及iNOS。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同組不同時間點比較采用配對t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組供肺外觀及供肺組織D/W比值比較

A組供肺可見全肺明顯水腫，順應(yīng)性差，氣道內(nèi)涌出大量水腫液（圖2A）；而B組供肺未見明顯水腫，順應(yīng)性較好（圖2B）。與A組比較，B組供肺組織D/W比值較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2C）。

圖2 兩組供肺外觀及供肺組織D/W比值比較Figure 2 Appearance of donor lung and comparison of D/W ratio of donor lung tissues between two groups

2.2 兩組供肺功能及代謝狀態(tài)比較

兩組肺靜脈血氧分壓均在灌注2 h時達(dá)到最高，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖3A）。B組肺動脈壓升高速度較A組慢，灌注結(jié)束時B組肺動脈壓較A組降低（P＜0.05，圖3B）；灌注結(jié)束時，B組灌注液中乳酸水平較A組下降（P＜0.05，圖3C）。

圖3 兩組肺靜脈血氧分壓、肺動脈壓及乳酸水平比較Figure 3 Comparison of pulmonary vein partial pressure of oxygen, pulmonary artery pressure and lactic acid level between two groups

2.3 兩組供肺形態(tài)學(xué)分析

HE染色結(jié)果顯示，A組肺泡結(jié)構(gòu)大量破壞，細(xì)胞數(shù)量稀少（圖4A），B組肺泡結(jié)構(gòu)相對正常，未見明顯細(xì)胞水腫（圖4B）。TUNEL染色結(jié)果顯示，A組供肺細(xì)胞陽性反應(yīng)較強，細(xì)胞凋亡較多（圖4C），而B組供肺未見明顯細(xì)胞凋亡現(xiàn)象（圖4D）。

圖4 兩組供肺的病理學(xué)表現(xiàn)及細(xì)胞凋亡情況Figure 4 Pathological findings and cell apoptosis of donor lung in two groups

2.4 兩組供肺炎癥標(biāo)志物水平比較

與灌注1 h比較，兩組灌注4 h后MCP-1、IL-6水平均升高，IL-4均降低（均為P＜0.05）。TNF-α、IL-1α和iNOS變化無統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＞0.05）。兩組間各指標(biāo)在不同時間點的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＞0.05，圖5）。

圖5 兩組供肺炎癥標(biāo)志物水平比較Figure 5 Comparison of inflammation marker levels of donor lung between two groups

3 討 論

DCD供器官的利用一直是器官移植領(lǐng)域的難點，循環(huán)衰竭所致熱缺血不僅會導(dǎo)致熱缺血損傷，還會增加器官對缺血-再灌注損傷的易感性[4]，在肺移植中尤為明顯。雖然EVLP的應(yīng)用使DCD肺移植成為可能[16-17]，但仍存在原發(fā)性移植物失功發(fā)生率高等問題[18-19]。本實驗發(fā)現(xiàn)向灌注液中加入IL-10，可改善心臟死亡大鼠EVLP后供肺的功能。與A組比較，B組供肺外觀和組織形態(tài)明顯較好，乳酸含量較低，表明供肺組織細(xì)胞代謝狀態(tài)更好；D/W比值較高，說明供肺組織損傷較小[20]。

一直以來認(rèn)為IL-10可通過抑制過度的炎癥反應(yīng)，上調(diào)先天性免疫，促進(jìn)組織修復(fù)，減少組織損傷，在感染和炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮維持組織穩(wěn)態(tài)的重要作用[21-23]。在體內(nèi)，IL-10可通過抑制促炎因子和抗原提呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）以及其他途徑對髓系細(xì)胞起抑制作用。IL-10還可通過直接抑制記憶性輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）17和Th2，促進(jìn) Foxp3+調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg），減輕炎癥反應(yīng)和組織損傷[24-25]。IL-10信號通路受損與炎癥性疾病相關(guān)，在感染期間通常伴有免疫異常。相反，IL-10水平升高或失調(diào)可能導(dǎo)致慢性感染。在某些情況下，IL-10具有免疫刺激功能，如提高肥大細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞的活性。也有研究認(rèn)為IL-10可通過提高組織細(xì)胞對髓系細(xì)胞來源細(xì)胞因子的敏感性促進(jìn)細(xì)胞凋亡[26]。研究表明，IL-10改善EVLP后供肺的功能與先天性免疫無關(guān)[11]。本實驗中，兩組灌注液中促進(jìn)髓系細(xì)胞分化、增殖的IL-4和MCP-1，促炎因子IL-1α、iNOS、TNF-α，調(diào)節(jié)自體免疫的IL-6水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明IL-10對先天性免疫無影響。TUNEL染色結(jié)果顯示，灌注液中添加IL-10可以減輕肺泡細(xì)胞凋亡，表明IL-10可能是通過直接抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用。也有研究證實IL-10可通過抑制核因子（nuclear factor，NF）-κB通路減輕腦梗死后的神經(jīng)元損傷[27]。綜上所述，在EVLP系統(tǒng)中，IL-10對DCD供肺的利用有積極作用，可能與IL-10抑制供肺組織細(xì)胞凋亡有關(guān)，但其作用機制仍需進(jìn)一步研究。今后將繼續(xù)研究其作用機制，為增加DCD供肺的利用率提供方向，進(jìn)一步擴(kuò)大供體庫。