劉冬戀,郭秋鴻,夏陽(yáng)淼,周葉,李佳

(1.成都醫(yī)學(xué)院四川養(yǎng)老與老年健康協(xié)同創(chuàng)新中心,成都 610500;2.三六三醫(yī)院病案與統(tǒng)計(jì)科,成都 610041)

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變和生活方式的變化,高尿酸血癥的發(fā)生率逐年增高,其對(duì)健康的影響也越來越受到人們的重視。高尿酸血癥與心血管疾病、腎病、糖尿病、高血壓等疾病密切相關(guān)[1-2]。導(dǎo)致尿酸升高的原因主要是尿酸生成過多或尿酸排泄減少,90%的高尿酸血癥與腎尿酸排泄減少有關(guān)[3]。高尿酸血癥也是慢性腎疾病發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4]。因此,建立穩(wěn)固的慢性高尿酸血癥腎損害動(dòng)物模型,對(duì)發(fā)現(xiàn)有助于延緩慢性高尿酸血癥腎損害進(jìn)展的新方法,具有重要的臨床意義。

人類由于缺乏尿酸酶,所以尿酸是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物,但是其它大多數(shù)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的尿酸酶可將尿酸降解為尿囊素而隨尿液排出,故而大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)血尿酸值較低,建立高尿酸血癥的動(dòng)物模型非常困難[5]。同時(shí),目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)公認(rèn)的慢性高尿酸血癥腎損害的動(dòng)物模型。本研究參考了文獻(xiàn)報(bào)道的四種制造慢性高尿酸血癥腎損害動(dòng)物模型的方法,通過每周眼眶取血的方式,動(dòng)態(tài)的觀察大鼠體重、血清中的尿酸、肌酐、尿素氮等生化指標(biāo),然后對(duì)腎進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,考察和評(píng)價(jià)建立持續(xù)穩(wěn)定的慢性高尿酸血癥腎損害動(dòng)物模型的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只5～6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠,體重(220±10)g,成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供【SCXK(川)2020-030】。飼養(yǎng)于成都醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心【SYXK(川)2020-196】。每只大鼠分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境為室溫(22±2)℃、濕度50～60%、12 h光照/12 h黑暗交替。飼喂期間普通大鼠飼料(批號(hào):20200901),購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。所有操作均符合成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(編號(hào):2020007)。

1.1.2 主要試劑與儀器

氧嗪酸鉀(批號(hào):H2017151)、酵母浸膏(批號(hào):K1914028)、腺嘌呤磷酸鹽(批號(hào):D1402001)均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;羧甲基纖維素鈉(批號(hào):20190626)購(gòu)自成都金山化學(xué)試劑有限公司;肌酐試劑盒(批號(hào):20200907)、尿素氮試劑盒(批號(hào):20200904)、尿酸試劑盒(批號(hào):20200907)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。HE染色試劑盒(批號(hào):20200829)、尿酸鹽染色試劑盒(Gomori六胺銀法)(批號(hào):20201202)、中性樹膠(批號(hào):330A023)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

Centrifuge 5415D小型臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)eppendorf公司),CP225D精密分析天平(德國(guó)sartorious公司),Varioskan Flash酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司),BX63正置熒光顯微鏡顯微鏡(日本Olympus公司),Leica RM 2016超薄切片機(jī)(美國(guó)feica公司),Specord 50 Plus紫外分光光度計(jì)(德國(guó)耶拿分析儀器股份公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模方法

將40只大鼠隨機(jī)分為5組(每組8只),分別為正常組、A、B、C、D組,具體分組及造模情況見表1。所有動(dòng)物適應(yīng)生活環(huán)境,自由進(jìn)食和飲水,1周后開始實(shí)驗(yàn)。每周眼眶取血1次,各組造模時(shí)間為5周。

表1 動(dòng)物分組及造模方法統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table of animal grouping and modeling methods

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)及處理

采血前12 h禁食不禁水,每周用眼眶取血方法,每只取血0.5 mL,然后37℃水浴30 min,3000 r/min離心15 min,取血清100μL。按照尿酸、肌酐和尿素氮試劑盒的說明書,采用紫外分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀測(cè)定大鼠血清中尿酸、肌酐和尿素氮的水平。

1.2.3 大鼠腎的病理組織學(xué)檢查

大鼠處死后,取全腎,稱重,計(jì)算腎體比。右腎用生理鹽水清洗后,浸泡在10%中性甲醛溶液中固定,然后進(jìn)行常規(guī)脫水,石蠟包埋,HE染色。左腎浸泡在無(wú)水乙醇中固定,按照尿酸鹽染色方式進(jìn)行染色,然后在400倍物鏡視野下,隨機(jī)選擇l0個(gè)無(wú)腎小球只有腎小管的視野,按照馮學(xué)軒等[10]的尿酸鹽結(jié)晶評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腎小管尿酸鹽結(jié)晶情況進(jìn)行半定量測(cè)定。利用BX63正置熒光顯微鏡拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重變化

除C、D兩組外,其余各組大鼠的體重隨飼喂時(shí)間增加均呈緩慢增加的趨勢(shì)。與正常組相比,在第3周時(shí),A和C組大鼠體重明顯降低(P<0.05,P<0.01);在第4周時(shí),A和C組大鼠體重較正常組均極顯著降低(P<0.01);在第5周時(shí),C和D組大鼠體重較正常組均極顯著降低(P<0.01),說明在不同時(shí)間點(diǎn),A、C和D三種方法制造慢性高尿酸血癥腎損害模型均會(huì)降低大鼠的體重,而C種方法能穩(wěn)定的降低大鼠的體重(見表2)。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重的變化(g)Table 2 Changes of body weight of rats in each group at different time points(g)

2.2 各組大鼠雙腎重與體重的比值

單從雙腎重量比較,C組大鼠與其余各組并無(wú)區(qū)別,但C組大鼠雙腎重與體重的比值與正常組相比極顯著升高(P<0.01),其原因是由于C組大鼠體重降低引起的(見圖1)。

圖1 各組大鼠雙腎重與體重的比值Figure 1 Ratio of kidney weight to body weight of rats in each group

2.3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中尿酸水平的變化

結(jié)果見表3。除正常組外,模型組各組大鼠的血清中尿酸水平隨飼喂時(shí)間增加均呈先上升后下降的趨勢(shì)。與正常組相比,在第1和2周時(shí),A、B、C和D組大鼠血清中尿酸水平顯著升高(分別為P<0.05,P<0.01);在第3周時(shí),C和D組大鼠血清中尿酸水平較正常組顯著升高(分別為P<0.05,P<0.01);在第4周時(shí),C組大鼠血清中尿酸水平較正常組極顯著升高(P<0.01),在第5周時(shí),C組大鼠血清中尿酸水平較正常組顯著升高(P<0.05)。說明在前1～2周時(shí),模型組各組大鼠能顯著升高血清中尿酸水平,但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),模型組各組大鼠血清中尿酸水平均會(huì)降低,只有C組在第5周時(shí),仍和正常組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中尿酸水平的變化(μmol/L)Table 3 Changes of serum uric acid level in rats of each group at different time points(μmol/L)

2.4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中尿素氮水平的變化

結(jié)果見表4。與正常組相比,在第1周和第2周時(shí),C組大鼠血清中尿素氮水平顯著升高(P<0.05);在第3周時(shí),B、C和D組大鼠血清中尿素氮水平較正常組極顯著升高(P<0.05);在第4和5周時(shí),C組大鼠血清中尿素氮水平較正常組極顯著升高(P<0.05),說明C種方法制造的慢性高尿酸血癥腎損害模型會(huì)升高大鼠血清中的尿素氮水平,并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)保持穩(wěn)定。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中尿素氮水平的變化(mmol/L)Table 4 Changes of serum urea nitrogen level in rats of each group at different time points(mmol/L)

2.5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中肌酐水平的變化

結(jié)果見表5。與正常組相比,在第2周時(shí),A和C組大鼠血清中肌酐水平顯著升高(分別為P<0.05,P<0.01);在第3周時(shí),B和C組大鼠血清中肌酐水平較正常組極顯著升高(P<0.01);在第4和5周時(shí),C和D組大鼠血清中肌酐水平較正常組極顯著升高(P<0.01),說明C和D種方法制造的慢性高尿酸血癥腎損害模型會(huì)升高大鼠血清中的肌酐水平,并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)保持穩(wěn)定。

表5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中肌酐水平的變化(μmol/L)Table 5 Changes of serum creatinine level in rats of each group at different time points(μmol/L)

2.6 各組大鼠形態(tài)觀察

結(jié)果見圖2。正常組大鼠腎顏色呈暗紅色,表面光滑,模型組各組大鼠腎顏色均發(fā)黃,以C和D組尤為明顯,且B、C和D組腎外觀表面呈細(xì)顆粒狀。對(duì)腎進(jìn)行剖面觀察,發(fā)現(xiàn)正常組腎皮質(zhì)呈紅褐色,腎髓質(zhì)呈淡紅色,A組腎皮質(zhì)呈淡紅色,腎髓質(zhì)顏色較正常組更深;C組腎皮質(zhì)呈淡黃色,腎髓質(zhì)呈纖維狀。

圖2 各組大鼠腎及剖面形態(tài)Figure 2 Kidney and sectional morphology of rats in each group

2.7 各組大鼠組織病理學(xué)結(jié)果

結(jié)果見圖3。正常組大鼠腎小球大小正常,腎小管結(jié)構(gòu)完整清晰。各模型組大鼠均可見腎損傷,表現(xiàn)為腎小管變性、擴(kuò)張,部分腎小管有炎細(xì)胞浸潤(rùn),腎小球系膜增生。其中B和D組腎小管炎細(xì)胞浸潤(rùn)較為嚴(yán)重,C組腎小管有炎細(xì)胞浸潤(rùn),腎小管普遍變性擴(kuò)張。

圖3 各組大鼠腎HE染色病理切片Note.Black arrow.Renal tubular dilatation.Blue arrow.Inflammatory cell infiltration.Figure 3 Pathological sections of kidney in each group

2.8 各組大鼠腎小管尿酸鹽結(jié)晶情況

正常組和A組腎小管內(nèi)未見尿酸鹽結(jié)晶沉積,B、C和D模型組均可見尿酸鹽結(jié)晶沉積。與正常組相比,B、C和D組的尿酸鹽結(jié)晶評(píng)分均極顯著升高(P<0.01)(見圖4)。

圖4 各組大鼠腎小管尿酸鹽結(jié)晶沉積情況Figure 4 Urate crystal deposition in renal tubules of rats in each group

3 討論

尿酸是嘌呤代謝的產(chǎn)物,在腎近端小管中受過濾、重吸收和分泌的影響。高尿酸對(duì)腎小球的損害機(jī)制是使腎小球靜水壓升高,進(jìn)而導(dǎo)致腎小球肥大和硬化[11]。高尿酸所致腎小管損傷的機(jī)制之一是Na+-K+-ATP酶信號(hào)傳導(dǎo)的損傷,進(jìn)而引發(fā)炎癥、自噬和線粒體功能障礙,導(dǎo)致腎小管細(xì)胞損傷[12]。同時(shí),高尿酸可促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),上調(diào)雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、激活Caspase-1和促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)成熟或者分泌,從而導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞脫離、腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化[13]。高血清尿酸水平使患者易于形成尿酸鹽結(jié)晶,而尿酸鹽結(jié)晶通過激活腎NF-κB和MAPK等信號(hào)通路觸發(fā)炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)多種促纖維化和促炎性趨化因子的產(chǎn)生和釋放,導(dǎo)致氧化應(yīng)激和腎近端小管細(xì)胞受損[14]。損傷后的近端小管細(xì)胞,在細(xì)胞周期的G2/M階段發(fā)生阻滯,促進(jìn)促纖維化細(xì)胞因子的分泌,最終導(dǎo)致腎纖維化[15]?？傊?高尿酸血癥會(huì)導(dǎo)致腎小球和腎小管細(xì)胞損傷,最終導(dǎo)致腎纖維化。

在本實(shí)驗(yàn)4種造模方案中,涉及了3種藥品,氧嗪酸鉀是尿酸酶抑制劑,能抑制嚙齒類動(dòng)物的尿酸酶活性[16]。腺嘌呤是一種尿酸的前體,能轉(zhuǎn)化為黃嘌呤沉積在腎小管,同時(shí)導(dǎo)致自由基氧化和脂質(zhì)的過度產(chǎn)生,進(jìn)而導(dǎo)致腎損傷[17]。酵母浸膏增加大鼠的嘌呤攝入。因此,3種藥品可以通過增加尿酸來源,抑制尿酸酶活性來建立慢性高尿酸血癥腎損害模型。在本實(shí)驗(yàn)的4種造模方案中,A和B兩種方法是通過飼喂制造慢性高尿酸血癥腎損害模型,此2種方法能短暫時(shí)間內(nèi)升高大鼠血清尿酸、肌酐和尿素氮水平,但不能保持穩(wěn)定。D種方法能升高造模后大鼠血清尿酸水平,并維持到第3周,同時(shí)升高大鼠血清肌酐水平(4～5周),但并不能使大鼠血清尿素氮水平的持續(xù)升高,病理切片和尿酸鹽結(jié)晶半定量分析顯示其腎的損傷也不如C組。綜合來說,通過飼喂的方式不如灌胃制造慢性高尿酸血癥腎損害模型的效果好,其原因可能是飼喂的方式并不能保證所有的飼料被大鼠吃掉,有可能啃食過程中造成浪費(fèi)。

同樣用灌胃方法,還有文獻(xiàn)報(bào)道用150 mg/kg腺嘌呤聯(lián)合250 mg/kg乙胺丁醇持續(xù)21 d制造慢性高尿酸血癥模型,此模型中血清尿酸、肌酐、尿素氮均明顯升高,且出現(xiàn)腎尿酸鹽結(jié)晶沉積,大量腎小管變性、壞死,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變,其腎的病理改變與本模型的結(jié)果類似[10]。但是乙胺丁醇會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制腎小管分泌尿酸,導(dǎo)致腎受損,因此采用乙胺丁醇造模不符合高尿酸血癥腎損害的臨床發(fā)病機(jī)制[18]。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)利用以100 mg/kg腺嘌呤聯(lián)合1500 mg/kg氧嗪酸鉀,早晚各灌胃1次的方式制造慢性高尿酸血癥腎損害模型,成模后大鼠體重減輕,雙腎重與體重的比值升高,血清尿酸、肌酐和尿素氮均持續(xù)升高,腎皮質(zhì)呈淡黃色,腎髓質(zhì)呈纖維化,病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腎有一定程度的損傷。此方法無(wú)論從血生化還是病理組織學(xué)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)均有較好的成模型,該模型的建立為研究慢性高尿酸血癥腎損害的藥物篩選和開發(fā)有著極其重要的意義。