鄭 濤 曹 琪 朱 梅 喬之怡

(天津農學院水產學院, 天津市水產生態(tài)與養(yǎng)殖重點實驗室, 天津 300384)

隨著全球水體富營養(yǎng)化水平的逐漸提高, 由于藻類大量繁殖造成的藍藻水華問題成為淡水生態(tài)系統(tǒng)的共同威脅。全世界大約85%的淡水藍藻水華由微囊藻占優(yōu)勢[1], 而且還有加重的趨勢, 因為近年來的全球變暖可能會加劇不同水域中微囊藻暴發(fā)的頻率、持續(xù)時間和泛濫程度[2]。

目前, 世界上已發(fā)現的微囊藻共有50多種。傳統(tǒng)形態(tài)學分類根據微囊藻的群體形態(tài)、群體外膠被特征、細胞排列方式和氣囊特點等來分種。然而, 在不同條件下微囊藻的群體形態(tài)可能會有很大變化[3], 這種現象使微囊藻的分類變得困難, 因此,也有學者認為現有微囊藻僅存一種, 即將銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、挪氏微囊藻(Microcystis novacekii)、魚害微囊藻(Microcystisichthyoblabe)、綠色微囊藻(Microcystisviridis)和惠氏微囊藻(Microcystiswesenbergii)統(tǒng)稱為銅綠微囊藻[4]。微囊藻可產生多種有害次生代謝物, 其中最為常見的微囊藻毒素(MCs), 可對肝、腸、腦、腎、肺、心和生殖系統(tǒng)造成不可逆損傷[5,6]。微囊藻形態(tài)多變, 僅靠形態(tài)難以對有毒無毒藻株進行區(qū)分。也正由于微囊藻的廣泛分布和其帶來危害的嚴重性, 微囊藻的遺傳特性得到了廣泛的研究[7,8]。

諸多證據表明地理隔離是微生物遺傳分化的重要力量[9—11]。一般認為水系隔離較強就有更高的遺傳多樣性, 但是Zhu等[12]應用ITS作為遺傳標記發(fā)現, 在對一個孤立的和超富營養(yǎng)化池塘進行的連續(xù)監(jiān)測中, 微囊藻種群內具有較高的遺傳多樣性。Huo等[7]應用高通量測序的方法也在中國北方某水庫中發(fā)現微囊藻的多樣性極高, 這一結果證實了同一水系中微囊藻的多樣性也會有所不同。所以利用多樣性較高的分子遺傳標記廣泛對各水系進行研究, 才有可能較清楚的解釋微囊藻變異與地理因素的關系, 可是相關研究較少報道, 所以地理因素對微囊藻遺傳多樣性的影響變得更加深遠復雜[13]。這需要用更合適的方式進一步評估微囊藻種群之間相似性及分析遺傳多樣性形成中進化力量的作用。

采用高通量測序方法研究微囊藻的遺傳多樣性與環(huán)境因素之間的關系已被證明是可靠的[7]。這種方法可以獲取較多的信息, 但數據分析工作專業(yè)性強, 消耗時間長, 難以在短時間內進行種群結構和多樣性研究。單基因序列多樣性分析技術也被應用于微囊藻上, 研究發(fā)現重組能在很大程度上促進微囊藻的自然遺傳多樣性, 并強調了基因交換對微囊藻種群遺傳結構的潛在重要性[14], 如常用的序列有ITS[15]和cpcBA-IGS[16]等。目前, 與全基因組測序一樣, 多位點序列分型的方法常被用在對地理距離較遠的種群中, 以充分評價地理因素在微囊藻精細遺傳結構發(fā)育中的作用, 其中管家基因已被證明是有效的遺傳標記, 這也使推斷出決定和限制微囊藻種內遺傳多樣性的其他進化因素成為可能[17,18]。

多位點序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)是近年來分子生物學研究中發(fā)展較快的方法之一。MLST技術最初是在1998年為腦膜炎奈瑟菌(Neisseria itidis)研發(fā)的, 目的是解決不同實驗室之間的分子分類重復率低的問題[19]。MLST一般檢測6—10個管家基因中400—600 bp的核苷酸序列。每個位點的序列根據被發(fā)現的時間分配一個等位基因數, 每個菌株的等位基因數按指定的順序排列為其等位譜, 即菌株的序列類型(Sequence type,ST)。因此, 每個ST代表一組核苷酸序列信息。通過比較ST, 可以發(fā)現菌株之間的相關性, 即親緣關系較近的菌株有相同的ST, 或者只有少數不同的ST基因位點, 而親緣關系較遠的菌株則至少有3個或3個以上不同的ST基因位點。由于其高分辨率,在國際菌株研究中經常被用來確定流行病菌抗原的來源[20]。大量研究表明, MLST是一種介于在單基因和全基因組測序之間有足夠的遺傳信息且較為簡便快速的分析方法[21,22]。目前缺乏更精細的微囊藻種內的分類依據, 從DNA分子多樣性有可能篩選到合適的分類標記, MLST可以有更精細的分辨率, 有成為分類分子標記的潛在可能性。但目前為止, 僅有少數學者將MLST應用于藍藻遺傳多樣性的研究, 同時在他們的研究中提出應用MLST研究微囊藻應建立更加豐富的數據庫[17,18]。

于橋水庫曾是天津唯一的飲用水源地。近年來, 微囊藻在夏季的庫中占絕對優(yōu)勢且組成復雜[23]。研究其種群結構具有對微囊藻藻華的發(fā)生進行監(jiān)測和控制等特殊的生態(tài)意義[7]。雖然之前于橋的研究已經包括了水庫的水化指標[24,25]、藍藻生態(tài)模型建立[26]和其他內容。但這些研究都是基于傳統(tǒng)的計數和理化指標的測定, 而微囊藻群體形態(tài)特征高度可變, 甚至有學者對微囊藻屬種水平的分類提出異議[1]。

本研究利用多位點序列分型分析技術對天津于橋水庫的10株微囊藻株的7個管家基因進行分析,并與20個鄱陽湖序列型和237個日本湖泊序列型(STs)進行比較, 在研究我國北方水庫型水體中微囊藻的基因型組成變化和遺傳多樣性的基礎上, 進一步探究地理隔離與種內進化在與微囊藻MLST多樣性的關系。

1 材料與方法

1.1 微囊藻藻株的分離和培養(yǎng)

2018年7月20日分別在于橋水庫的放水洞、庫中、庫東、庫西、庫南、庫北和峰山7個站位取樣50 mL等比例混合后, 24h內帶回實驗室用經典毛細管法, 在滅菌CT[27]培養(yǎng)基中單克隆培養(yǎng)微囊藻藻株, 培養(yǎng)溫度25℃, 光照強度25 μmol protons/(s·m2),晝夜比12h∶12h。微囊藻藻株純化后移至含有無菌CT培養(yǎng)基的5 mL玻璃試管中。

1.2 16S rDNA、cpcBA和mcyE基因的檢測

毒素基因的檢測采用mcyE片段, 退火溫度為55℃, 其余條件與管家基因相同[18]。16S rDNA基因PCR程序為: 94℃預變性5min, 94℃變性30s,54℃退火30s, 72℃延伸1min 30s, 此3個過程為30個循環(huán), 最后72℃終延伸5min。cpcBA基因PCR程序為: 94℃預變性2min, 94℃變性30s, 55℃退火30s,72℃延伸30s, 此3個過程為35個循環(huán), 最后72℃終延伸5min?；驒z測的引物序列如表1所示。

1.3 MLST基因的檢測

表1顯示本研究使用的7個MLST管家基因, 包括ftsZ、glnA、gltX、gyrB、pgi、recA和tpi[17,18]。每個基因座都為單拷貝形式存在, 使用全細胞PCR對目的片段進行擴增。PCR擴增體系在柳滿森等[17]的實驗基礎上做出改變, 將總體積改為25 μL,反應條件為: 94℃預變性3min, 94℃變性60s, 60℃退火30s, 72℃延伸30s, 此3個過程為35個循環(huán), 最后72℃延伸5min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 然后經TIANquick Maxi Purification Kit(Tiangen)純化DNA, 并用pEASY-T1 cloning kits(TransGen)回收, 之后挑取單克隆進行測序, 利用N C B I下載相關基因序列, 構建局部基因庫。MLST對每個位點及不同的等位基因都分配了一個隨機數, 7個等位基因的唯一組合明確定義了一個藻株類型序列(ST)。

表1 分別用于MLST和mcyE基因、16S rDNA基因和cpcBA基因的PCR引物序列Tab. 1 PCR primer sequence used in MLST and PCR primer sequence of mcyE gene, 16S rRNA gene and cpcBA gene

1.4 七個管家基因的重組分析

從GenBank中選取MicrocystisPCC 7806作為參考親本株系。使用Sim Plot 3.5進行潛在重組事件的相似性檢測[28], 窗口長度為20 bp, 每步為20 bp。將統(tǒng)計數據導出后, 在Excel中對數據進行作圖分析。

1.5 種群遺傳和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用DNAsp[29]分析DNA遺傳多樣性指數, 具體計算公式如下:,基于Tajima’sD和Fu and Li’sD[30]檢驗核苷多樣性。系統(tǒng)發(fā)育分析采用Fasconcat-g軟件, 按照ftsZ-glnAgltX-gyrB-pgi-recA-tpi的序列順序連接7個管家基因, 然后在MEGA X軟件中對連接順序進行對齊,使用jModeltest對模型進行推斷, 計算參數。用IQTREE建立最大似然樹。

2 結果

2.1 基于MLST的序列差異和系統(tǒng)分析

本研究從10株微囊藻中分別擴增得到得到了7個MLST基因片段, 將本實驗得到的MLST測序結果與前文提到的構建的MLST本地基因庫進行比較, 得到10個新的ST型(ST258-ST267)。如表2所示, 每個ST對應唯一的微囊藻藻株。

表2 于橋水庫10株微囊藻的MLST序列及相應的等位基因數目Tab. 2 MLST sequences and numbers of 10 strains of Microcystis from Yuqiao Reservoir

2.2 mcyE基因檢測及16S rDNA和cpcBA基因的系統(tǒng)分析

本研究藻株的mcyE基因檢測結果均為陰性,說明它們產出微囊藻毒素的幾率較低。分別將得到的10株微囊藻的16S rDNA基因和cpcBA基因片段添加進GenBank數據庫中, 構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。2個系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結構均顯示本研究的10株藻株均位于微囊藻屬的分支上, 證明它們均為微囊藻屬。圖1A為16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹, 將10株藻分為3組, TJAU1單獨一組, TJAU2、3、5、9、10聚在一起, 同時TJAU4、6、7、8聚在一起; 在圖1B中, 除藻株TJAU8外, 其他9藻株緊密聚集在一起。

圖1 基于藍藻16S rDNA和cpcBA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA and cpcBA of Cyanobacteria

2.3 基因重組分析

以標準微囊藻株PCC 7806作為參考株系, 使用Simplot重組分析工具對得到的7組MLST基因片段進行了基因重組分析, 如圖2所示:ftsZ的序列相似性達到100%,recA的序列相似性則多在95%以上,且突變頻率均勻, 說明ftsZ與recA序列不存在重組的可能。glnA、gltX、gyrB、pgi與tpi序列檢測顯示, 序列相似性多在95%以下且檢測到不同程度的重組信號。

圖2 重組的檢測Fig. 2 Detection of recombination

2.4 基因多樣性

在刪除MLST序列兩端的多余序列后, 在任何位點的序列中都沒有發(fā)現插入或刪除, 因此可以對序列進行對齊。DNAsp軟件計算的遺傳多樣性指數如表3所示。本研究從10株藻中獲得了10個STs。等位基因的數量從gyrB的14個到pgi的39個不等?？偤塑账岫鄻有云骄禐?.883%, 其中gltX最高為2.616%,tpi最低為1.106%。本試驗所測于橋水庫的MLST基因片段長度在409—451 bp, 平均遺傳多樣性H=0.938, Tajima’sD、Fu、Li’sD*均未拒絕中性遺傳多樣性的原假設。

表3 微囊藻藻株基因多樣性指數Tab. 3 Genetic diversity index of Microcystis strains

2.5 進化分析

為了緩沖重組對進化結果的影響, 將總長度為2992 bp的7個MLST序列串聯起來[31]。采用JModeltest軟件進行分層似然比檢驗和多位點序列進化分析發(fā)現, 最優(yōu)模型為GTR + F + G4, 四個堿基的頻率分別為0.2842、0.2267、0.245和0.2441。替代模型的速率矩陣為R(d)[C–G]=1.8512, R(e)[C–T]=6.1697, R(f) =1.0000。以于橋水庫10個STs、鄱陽湖20個STs和日本湖泊237個STs為基礎的MLST系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。ST1-ST237為日本湖泊的序列類型, ST238-ST257為鄱陽湖的序列類型, ST258-ST267為于橋水庫的序列類型。結果表明, 藻株之間的親緣關系得到了很好的解釋, 系統(tǒng)發(fā)育樹形成明顯分枝, 其中于橋水庫的微囊藻全部聚集于一個簇。

圖3 利用于橋水庫(●)、鄱陽湖(▲)和日本湖泊微囊藻屬的STs進行系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 3 Phylogenetic analysis was performed on STs of Microcystis strains from Yuqiao Reservoir (●),Poyang Lake (▲) and Japanese lakes

3 討論

應用基于7個管家基因的多位點序列分型技術(MLST)對分離自于橋水庫的10株微囊藻的序列類型進行分析, 結果發(fā)現, 在所有試驗的藻株中未發(fā)現完全相同的基因型, 與前人關于STs很少同時出現在2個以上的位置的研究結果相似[17,18]。這表明了于橋水庫微囊藻存在廣泛的遺傳多樣性。

本研究采取無差別隨機取樣方式獲取了10株微囊藻藻株, PCR檢測產微囊藻毒素mcyE基因, 結果均為陰性。由此推測在于橋水庫中產毒素藻株總體比例偏低。這與王捷等[32]在我國北方另一水體, 汾河太原區(qū)段的研究中提出的微囊藻產毒素能力偏弱是一致的。有研究揭示許多種類的細菌具有降解微囊藻毒素的能力[33], 微囊藻產毒株的競爭能力在北方水體中可能受到了水溫和氣候, 甚至水體細菌等因素的影響而整體偏弱。

基于分子生物學的微囊藻種群時空分布調查已經成為了解微囊藻群體遺傳規(guī)律和追蹤水華發(fā)生過程的常規(guī)手段[34]。統(tǒng)計結果顯示, 于橋水庫微囊藻具有較高的遺傳多樣性。平均基因多樣性H=0.938, 略低于鄱陽湖的微囊藻基因多樣性(H=0.986)[17]和日本湖泊的微囊藻基因多樣性(H=0.951)[18], 但遠遠高于大腸桿菌(H=0.47)[19]和枯草芽孢桿菌的基因多樣性(H=0.44)[35]。對微囊藻的高遺傳多樣性的一種解釋是基因可能存在重組, 通過基因重組, 可產生大量的遺傳變異, 遺傳多樣性區(qū)域的增加與重組率的增加相關[36]。本研究結果顯示7個管家基因中有5個可能發(fā)生了重組。另一種對高遺傳多樣性的解釋是, 微囊藻包含幾個生態(tài)上不同的種群或生態(tài)型, 這與劉滿森等[17]的研究結果相近?？紤]到生態(tài)分化與遺傳分化的關系, 一個物種如果有更多的生態(tài)型, 其遺傳多樣性就會保持得更高[11]。從于橋水庫中已分離出10種不同的STs,表明于橋水庫水體環(huán)境條件可能并不穩(wěn)定[37,38], 對于微生物來說, 四季水環(huán)境的波動造成了精細的生態(tài)位差異, 而水體中共存的微囊藻基因型是環(huán)境波動條件下的競爭結果, 這與孫千千等[39]得出的溫度是驅動季節(jié)演替的主要因素和風引起的遷移是影響微囊藻群落空間分布的重要因素的結果一致。

ML樹顯示, 在大的空間尺度上于橋水庫的序列類型聚在一起, 這可能是由于于橋水庫中藻株種源結構較為一致或是生態(tài)上不同的種群經過反復的選擇性清除, 從而造成基因組中多數基因位點高度一致[11]。結果還顯示, 基于16S基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中TJAU1與其他8個藻株相距較遠?；赾pcBA基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中TJAU8距離其他9個藻株較遠。有證據表明, 一些微生物種群可能保持了大量的精細基因型和表型多樣性, 因此這2株藻可能進化成為不同的基因亞型[40]。結合中性檢驗的結果, 說明遺傳漂變可能是同一位點遺傳多樣性高的主要原因。雖然基于16S rDNA與cpcBA基因構建的進化樹都表明本實驗所用的10株藻株為微囊藻屬, 然而, 在本實驗中cpcBA與16S rRNA的拓撲結構并不完全一致, 這也表明雖然這些基因相對保守, 但系統(tǒng)發(fā)育不一致仍然存在, 不能排除同源重組增強了微囊藻的種群優(yōu)勢形成[41]。在基于16S rDNA和cpcBA基因的系統(tǒng)發(fā)育拓撲結構中,并沒有顯示出大空間尺度上明顯的地理分布格局,這說明地理隔離可能不是影響微囊藻種群遺傳的最重要因素。MLST構建的進化樹對于橋地區(qū)的序列進行了區(qū)分, 表明在小生境內產生了一些具有小區(qū)域特征的變異, 這與Huo等[7]的研究結果相似。于橋水庫微囊藻類遺傳多樣性高, 可能是由于微囊藻包含多種不同的生態(tài)類型, 遺傳差異往往伴隨著生境的差異。如果一個物種存在更多的生態(tài)類型,那么該物種將保持更高的遺傳多樣性, 隨著時間的推移, 每個生態(tài)型都有其基于基因序列的分支[42]。在微囊藻的系統(tǒng)發(fā)育樹上觀察到許多不同的分支,這表明每個分支可能代表一個獨特的生態(tài)型。在后續(xù)構建更龐大的MLST數據庫的研究中還需要與具體藻株所處環(huán)境進行分析, 結合藻類生理研究對北方水體中微囊藻廣泛的遺傳多樣性形成機制進行進一步的探討。

4 結論

結果表明, 于橋水庫存在多種不同的微囊藻的基因型。本研究認為中國北方地區(qū)微囊藻的遺傳多樣性較大, 這在以往的研究中很少受到關注。將單基因分析與MLST方法進行比較, 可以發(fā)現單基因系統(tǒng)發(fā)育拓撲結構是不完整的, 這說明MLST可以提供更詳細的信息。本文推測, 于橋水庫微囊藻受遺傳漂變和小生境選擇的共同影響在種群發(fā)展過程中發(fā)生了一些基因的亞型分化。后續(xù)對微囊藻MLST的研究中需要更加關注環(huán)境因素的潛在影響。