岳華梅 阮 瑞 曹 宏 周 莉 蔣 偉 李 雙 李創(chuàng)舉

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430223; 2. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 3. 重慶市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 重慶 400020)

巖原鯉(Procypris rabaudi), 隸屬鯉形目, 鯉科,鯉亞科, 原鯉屬, 是我國(guó)特有的重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。其主要分布于長(zhǎng)江上游干流、支流及金沙江中上游,是一種棲居于巖石縫間的底層魚(yú), 以四川境內(nèi)嘉陵江和岷江分布較多[1]。巖原鯉成魚(yú)為雜食偏肉食性魚(yú)類, 主要攝食底棲動(dòng)物, 如淡水殼菜、蜆、小螺等軟體動(dòng)物和搖蚊幼蟲(chóng)、蜉蝣目和毛翅目幼蟲(chóng)等[2]。由于過(guò)度捕撈、環(huán)境污染及長(zhǎng)江上游大型水壩建立對(duì)其棲息環(huán)境的破壞, 巖原鯉野生資源銳減, 瀕臨滅絕, 現(xiàn)已被列入《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)》[3,4]。目前其資源養(yǎng)護(hù)手段主要為人工繁殖個(gè)體增殖放流。然而, 在巖原鯉人工繁殖過(guò)程中, 繁育場(chǎng)面臨著有效繁殖群體過(guò)小、近親交配和逆向選擇等問(wèn)題。因此在進(jìn)行巖原鯉人工育種時(shí)有必要對(duì)后備親魚(yú)的遺傳背景進(jìn)行分析, 以抑制養(yǎng)殖群體的種質(zhì)退化和防止因近交衰退而造成后代成活率降低和生長(zhǎng)速度減慢等。

線粒體DNA(mtDNA)呈母系遺傳, 具有較高的突變性, 突變固定后形成的多態(tài)性位點(diǎn)反映出群體遺傳特性、種群分化和種屬關(guān)系等特點(diǎn)[5,6]。線粒體控制區(qū)(Control region, 又稱D-loop)是線粒體上的一段非編碼區(qū), 位于mtDNA的tRNA-Pro 和tRNAPhe之間, 因缺乏編碼選擇壓力而比其他線粒體基因的進(jìn)化速率更快, 其堿基替換率比mtDNA的其他區(qū)域高5—10倍, 是線粒體基因組中最具多態(tài)性的片段, 已成為探討種群內(nèi)部遺傳多樣性和分子系統(tǒng)地理學(xué)的良好材料[7—9]。本研究旨在利用D-loop部分序列研究重慶地區(qū)巖原鯉人工養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性, 以期為人工繁殖中親魚(yú)的選擇, 避免近交退化及提高用于增殖放流人工繁殖群體的遺傳多樣性等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)所用175尾巖原鯉 [全長(zhǎng)(36.18±3.14) cm,體重(597.97±166.40) g] 樣本采自重慶市農(nóng)業(yè)投資集團(tuán)養(yǎng)殖基地, 其中117尾個(gè)體采自長(zhǎng)壽養(yǎng)殖基地,58尾樣本采自涪陵養(yǎng)殖基地。分別取鰭條樣本, 采用95%乙醇固定保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序

根據(jù)NCBI所下載的巖原鯉D-loop序列信息, 采用Primer premier 5.0軟件進(jìn)行特異引物設(shè)計(jì), 上游引物mtD-F: 5′-GGAAAACCACCCCTTATGGTA-3′; 下游引物mtD-R: 5′-TTACACGTTCTTGAG TCCTCC-3′。采用高鹽法提取基因組DNA后, 分別利用上下游引物對(duì)所有樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)體系50 μL, 包括: 2×PremixTaqTM(TaKaRa), 25 μL;10 μmol/L上下游引物, 各1 μL; DNA模板, 1 μL; 滅菌超純水22 μL。PCR擴(kuò)增在Bio-Rad C1000型PCR儀上進(jìn)行, 反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性3min后, 95℃變性30s, 55℃退火35s, 72℃延伸50s, 運(yùn)行32個(gè)循環(huán), 最后72℃下延伸5min。擴(kuò)增后進(jìn)行PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序(武漢奧科生物工程有限公司)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

為確保序列的可靠性, 所有測(cè)得的DNA序列采用BioEdit[10]軟件進(jìn)行拼接并與測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì),通過(guò)BLAST (http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/) 檢索確定為目的片段。另外, 從NCBI網(wǎng)站下載獲得201條巖原鯉不同單倍型的D-loop部分核酸序列, 并根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[11—13]進(jìn)行樣本來(lái)源及序列核對(duì)。所下載序列的GenBank登錄號(hào)分別為EU683674.1—EU683676.1和HQ199633.1—HQ199832.1。其中用于遺傳多樣性比較分析的巖原鯉野生樣本來(lái)源于長(zhǎng)江干流中的萬(wàn)州江段(WZ)、合江江段(HJ)、木洞江段(MD)及長(zhǎng)江支流中的蒼溪江段(CX)、唐河江段(TH)、武隆江段(WL)、通江江段(TJ)、習(xí)水河江段(XS)。另外還選取了巖原鯉北碚人工養(yǎng)殖群體(BB)同樣用于遺傳多樣性比較分析。序列比對(duì)采用MAFFT軟件進(jìn)行, 并使用Seaview軟件[14]進(jìn)行人工校正。利用DnaSP v5.0軟件[15]統(tǒng)計(jì)樣品的單倍型數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性。隨后采用Network 5.0軟件[16]構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖, 用以檢測(cè)單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系。應(yīng)用Mega 7.0軟件[17]基于Kimura 2-paramter模型計(jì)算單倍型之間的遺傳距離, 并利用MrModelTest軟件[18]篩選核苷酸替換模型, MrBayes軟件[19]進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 序列特征

通過(guò)測(cè)序, 共擴(kuò)增獲得巖原鯉D-loop 768—769 bp的DNA序列, 序列長(zhǎng)度差異來(lái)源于5個(gè)個(gè)體序列中的一個(gè)堿基T缺失。對(duì)其中692 bp的區(qū)域進(jìn)行后續(xù)序列分析, 發(fā)現(xiàn)其堿基T、C、A和G的平均含量分別為35.22%、17.86%、33.83%和17.09%, 堿基G的含量明顯低于其他3種堿基, 表現(xiàn)出典型的反G偏倚。并且A+T的平均含量為69.05%, 而G+C的平均含量為34.95%。進(jìn)一步的序列分析共檢測(cè)得到15個(gè)變異位點(diǎn), 占總分析位點(diǎn)的2.17%, 其中13個(gè)變異位點(diǎn)為序列轉(zhuǎn)換(6個(gè)A和G轉(zhuǎn)換, 7個(gè)T和C轉(zhuǎn)換),1個(gè)位點(diǎn)為A和T序列顛換, 1個(gè)位點(diǎn)為堿基T缺失(圖1)。175條序列共定義11種單倍型, 其中Hap1為主要單倍型, 所含樣本為134個(gè), 占總樣本量的76.57%。單倍型序列已上傳至NCBI, GenBank登錄號(hào)為MT119068—MT119078。

圖1 巖原鯉不同單倍型變異位點(diǎn)分布Fig. 1 The positions of variable sites in different haplotypes of P.rabaudi

2.2 遺傳距離分析

采用Network 5.0軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)連接圖,結(jié)果顯示單倍型Hap10演化速率較快, 與單倍型Hap6遺傳距離最遠(yuǎn)(圖2A)。單倍型Hap1與Hap2遺傳距離最近。進(jìn)一步的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示,11個(gè)單倍型共分為7支, 其中單倍型Hap7、Hap8、Hap9和Hap10聚為一支, 然后再與Hap11聚為一支(圖2B)。

圖2 基于D-loop序列構(gòu)建的巖原鯉不同單倍型簡(jiǎn)約網(wǎng)絡(luò)圖(A)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(B)Fig. 2 The statistical parsimony network (A) and phylogenetic tree (B) constructed based on the D-loop sequences of P. rabaudi

2.3 遺傳多樣性分析

將本研究所得175條巖原鯉D-loop部分序列與宋君[11,12]、朱成科等[13]研究中201條序列進(jìn)行遺傳多樣性比較分析。結(jié)果顯示, 所有序列分析得到的單倍型個(gè)數(shù)為49個(gè), 單倍型個(gè)數(shù)最多及最少的群體分別為木洞江段野生群體(18個(gè))及北碚人工養(yǎng)殖群體(2個(gè); 表1)。另外, 本研究中的重慶人工養(yǎng)殖群體中有兩個(gè)單倍型(Hap10和Hap11)為群體內(nèi)獨(dú)享單倍型, 其他 9個(gè)單倍型為群體間共享單倍型。遺傳多樣性最為豐富的為萬(wàn)州江段野生群體, 其核苷酸多樣性及單倍型多樣性分別為0.0147±0.0033和0.9590±0.0310, 其次為木洞江段野生群體。本研究中長(zhǎng)壽和涪陵地區(qū)巖原鯉人工養(yǎng)殖群體核苷酸多樣性分別0.0013±0.0003和0.0013±0.0004, 單倍型多樣性分別為0.4100±0.0550和0.3970±0.0820。其遺傳多樣性低于所有野生群體, 但略高于北碚人工養(yǎng)殖群體(表1)。

3 討論

3.1 巖原鯉種群遺傳多樣性

遺傳多樣性是衡量物種進(jìn)化潛力的重要指標(biāo),遺傳多樣性越高, 表明物種對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)能力更強(qiáng), 進(jìn)化潛力越大[20]。群體遺傳多樣性每損失10%, 即會(huì)對(duì)其繁殖能力、存活率和生長(zhǎng)等重要生理性狀產(chǎn)生極大的負(fù)面影響[21]。核苷酸多樣性代表了每個(gè)群體內(nèi)各個(gè)單倍型兩兩配對(duì)差異的平均值, 是一個(gè)群體的遺傳多樣性指標(biāo), 當(dāng)核苷酸多樣性指數(shù)在0.0010—0.0047時(shí), 其群體的遺傳多樣性較低[22]。在本研究中, 重慶巖原鯉人工養(yǎng)殖群體的核苷酸多樣性指數(shù)為0.0013, 顯示其遺傳多樣性較低。而8個(gè)巖原鯉野生群體中, 有5個(gè)野生群體的遺傳多樣性指數(shù)大于0.0047, 顯示出較為豐富的遺傳多樣性。另外, 重慶巖原鯉人工養(yǎng)殖群體的單倍型多樣性指數(shù)也顯著低于野生群體(表1)。根據(jù)群體單倍型多樣性和核苷酸多樣性之間的關(guān)系可將群體的擴(kuò)張事件分為4 種類型[23]: ①低單倍型多樣性和低核苷酸多樣性(Hd<0.5,π<0.5%), ②高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性; ③低單倍型多樣性和高核苷酸多樣性; ④高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性。重慶巖原鯉人工養(yǎng)殖群體遺傳多樣性類型應(yīng)屬于第①中類型, 此種類型表明群體最近發(fā)生了瓶頸效應(yīng)或由單一、少數(shù)系群發(fā)生了奠基者效應(yīng)。

表1 基于D-loop序列的巖原鯉遺傳多樣性參數(shù)Tab. 1 Parameters of the genetic diversity of P. rabaudi based on the D-loop sequences

3.2 巖原鯉的遺傳結(jié)構(gòu)分析

巖原鯉重慶人工養(yǎng)殖群體D-loop序列分析顯示其堿基G的含量明顯低于其他三種堿基, 并且平均(A+T)含量明顯高于(C+G)含量, 該結(jié)果與其他魚(yú)類中的研究結(jié)果相符[24—27]。遺傳距離的估計(jì)在分析群體間遺傳關(guān)系、預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)和指導(dǎo)親本選配等方面具有重要作用[28]。在本研究中, 重慶巖原鯉養(yǎng)殖群體單倍型Hap1所含樣本數(shù)量最多, 并且與其他單倍型之間的遺傳距離相對(duì)較近, 而單倍型Hap10與其他單倍型的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。在進(jìn)行巖原鯉人工繁育時(shí), 應(yīng)盡量選擇遺傳距離較遠(yuǎn)的個(gè)體進(jìn)行配對(duì), 并定期補(bǔ)充不同地區(qū)不同群體的個(gè)體作為后備親魚(yú), 保持其人工繁殖群體的遺傳多樣性,避免近親繁殖和瓶頸效應(yīng)。本研究所得到的巖原鯉種群遺傳結(jié)構(gòu)特征對(duì)于其人工繁育(引種、人工繁殖、雜交等)及遺傳多樣性的監(jiān)測(cè)具有重要意義。