杜開開 楊傳順 吳 凡 柳 凌 茹輝軍 吳湘香 倪朝輝 李云峰

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中上游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心, 武漢 430223)

三峽大壩及金沙江梯級電站等一系列水利工程在開發(fā)水電、防控洪災(zāi)、調(diào)控流域水量和保障航運安全等方面起到了至關(guān)重要的作用[1,2]。但高壩大量泄水可能導(dǎo)致下游河道水體出現(xiàn)總?cè)芙鈿怏w超過飽和, 致使生活在其中的魚類患?xì)馀莶∩踔了劳? 相關(guān)危害也引起了廣泛關(guān)注[3,4]。

為解析水體總?cè)芙鈿怏w(Total Dissolved Gas,TDG)過飽和對長江魚類的影響, 研究人員開展了鯽(Carassius auratusLinnaeus)[5]、胭脂魚(Myxocyprinus asiaticusBleeker)[6]、巖原鯉(Procypris rabaudiTchang)[7,8]、長薄鰍(Leptobotia elongateBleeker)[9]、齊口裂腹魚(Schizothorax prenantiTchang)[10,11]和達(dá)氏鱘(Acipenser dabryanusDumeril)[12]等幼魚在不同TDG過飽和水體中的耐受性研究。研究表明暴露在TDG過飽和水體中的幼魚均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象且死亡率均隨著飽和度的增加而增大。死亡的魚體中均有氣泡病癥狀, 主要表現(xiàn)為眼和口等部位充血腫脹, 眼球突出; 鰓、鰭條和頭等部位存在氣泡。

Liang等[13]通過研究TDG過飽和對重口裂腹魚(Schizothorax davidiSauvage)早期生活史的影響,發(fā)現(xiàn)高飽和度的TDG會縮短重口裂腹魚受精卵的孵化時間, 但在孵出的魚苗頭、卵黃囊和肛門等部位發(fā)現(xiàn)損傷。楊傳順等[14]通過對鰱(Hypophthalmichthys molitrixC. et V.)的受精卵及不同日齡的仔幼魚進行研究, 發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi), 高飽和度的TDG可提高鰱受精卵的孵化率, 縮短出膜時間; 同時發(fā)現(xiàn)TDG過飽和水體對不同日齡的魚苗均產(chǎn)生影響, 日齡小的魚苗對TDG過飽和水體的耐受性相對較高。

長江鱘(Acipenser dabryanusDumeril)為我國長江流域的珍稀特有魚類, 是國家一級重點保護野生動物, 國際自然保護聯(lián)盟(IU-CN)極危級(CR)物種。研究TDG過飽和水體對其早期生活史的影響具有重要意義。通過研究過飽和水體對長江鱘受精卵及仔稚魚的影響, 不僅能填補TDG過飽和水體對長江鱘早期資源影響的空缺, 同時也可為長江流域長江鱘的生態(tài)保護措施的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料來源

長江鱘受精卵取自長江水產(chǎn)研究所太湖試驗場, 一次性從產(chǎn)卵池的集卵箱采集約5000粒受精卵,置于充氧袋中帶至實驗場地, 用脫黏劑處理后置于水體中進行培養(yǎng), 發(fā)育至神經(jīng)胚階段時挑選出狀態(tài)健康的受精卵進行實驗; 剩余受精卵正常培養(yǎng)至孵出膜, 期間選用出膜1—2d的狀態(tài)健康的仔魚進行實驗。培養(yǎng)水體采用的是經(jīng)過曝氣的井水, 水溫為(19.5±0.5)℃, 溶解氧(DO)濃度約為7 mg/L。

稚魚是將取自長江水產(chǎn)研究所太湖試驗場的長江鱘卵, 經(jīng)過孵化及開口后, 喂養(yǎng)至稚魚階段, 為50日齡, 其體長為(8.38±0.37) cm, 體重為(2.29±0.32) g; 暫養(yǎng)3d后, 挑選出體型大小均一、體表完整和體質(zhì)健康個體進行實驗。暫養(yǎng)水采用的是經(jīng)過曝氣的井水, 水溫為(22.0±1.0)℃, 溶解氧濃度約為7 mg/L。

1.2 實驗裝置

實驗裝置包括TDG過飽和水發(fā)生裝置, 承載實驗材料的容器, 水體監(jiān)測儀器, 及生物特征觀察設(shè)備。

TDG過飽和水發(fā)生裝置(專利號ZL201710514743.4)如圖1, 主要包括水泵、蓄水池、壓力罐、空壓機和管道等部件。

圖1 TDG過飽和水發(fā)生裝置Fig. 1 Schematic of experimental system (Preparation of TDG supersaturation water)

實驗容器: 方形水池(長×寬×高: 2.5 m×1.8 m×0.8 m), 實驗水箱(長×寬×高: 130 cm×74 cm×74 cm),圓柱金屬籠(直徑×高: 15.0 cm×16.5 cm, 孔徑0.1 cm)。

水體監(jiān)測儀器: 溶解氧的測定選用美國哈希公司生產(chǎn)的HQ30D測定儀, 量程為0—200%, 精度為±1%。TDG飽和度的測定選用丹麥Oxyguard公司生產(chǎn)的Handy Polaris TGP(Total Dissolved Gas Pressure)測定儀, 量程為0—200%, 精度為±1%。

生物特征觀察設(shè)備: 選用日本的奧林巴斯公司生產(chǎn)的SZ61型解剖鏡, 對實驗生物進行觀察。

1.3 實驗方法

過飽和水體的制備先通過空壓機向壓力罐中輸入一定壓力的空氣, 待壓力穩(wěn)定后再用水泵將曝氣后的井水通過文丘里管高速射入壓力罐中,高速射入的水體與空氣的接觸面之間會形成負(fù)壓,瞬間將大量空氣卷入其中, 產(chǎn)生TDG過飽和水體。通過調(diào)控罐內(nèi)空氣壓強以及水泵的閥門, 可保證產(chǎn)生濃度穩(wěn)定的TDG高飽和水體。通過調(diào)控不同的混合比例將TDG高飽和水體與井水進行混合, 可同時調(diào)配出不同TDG飽和度的水體。

水溫調(diào)控在實驗水箱中的TDG過飽和水體調(diào)配完成后, 第一時間向方形水池中注入大量水溫恒定的井水, 同時在水池插入一根直徑為10 cm, 高35 cm的圓孔形排水管, 使水位維持在在水箱高度的一半, 然后適度調(diào)慢井水注入的速度,保持井水在池內(nèi)緩慢流通, 維持池內(nèi)水溫穩(wěn)定;此外, 本研究在水箱表面覆蓋一層保溫布, 并且不斷向保溫布表層滴灌井水, 以減弱實驗水溫的分層效應(yīng)。

排水孔設(shè)計在實驗水箱頂端兩側(cè)各設(shè)計一個排水孔, 便于水體飽和度和溶解氧等指標(biāo)的測定; 此外, 排水孔的設(shè)計可保證兩端在補充高飽和水體的同時溢出相同體積的水體, 使實驗過中水量恒定且混合均勻。

實驗過程中定時用儀器測量水體飽和度、溶解氧、水溫等指標(biāo)并且記錄下來, 并根據(jù)測量的情況及時對水體飽和度等指標(biāo)進行調(diào)控, 保證實驗過程中各指標(biāo)的相對穩(wěn)定。

暴露實驗本實驗設(shè)定4個梯度, 各實驗組TDG飽和度分別為110%、120%、130%和140%,同時選取曝氣后的井水, 作為對照組, 飽和度為90%; 每組實驗重復(fù)3次。選用挑選出的處于不同生活階段的狀態(tài)健康、規(guī)格整齊的長江鱘置于各實驗組中, 進行暴露實驗。

由于各發(fā)育階段的長江鱘的規(guī)格、大小、形態(tài)及發(fā)育條件均存在一定差異, 所以各階段實驗針對不同階段分別進行了不同的設(shè)計。其中受精卵置于金屬籠內(nèi)暴露在實驗組中, 每組50顆卵, 水溫為(19.5±0.5)℃。為避免操作對魚卵的發(fā)育造成的影響, 本實驗每隔1—2h觀察魚卵的出膜情況及死亡情況, 當(dāng)對照組完全出膜時, 停止實驗, 記錄各組卵未出膜數(shù), 來統(tǒng)計孵化率。

仔魚置于金屬籠內(nèi)并放到實驗組中暴露96h,每組30尾(除對照組外, 統(tǒng)計時部分組有1—2尾缺失), 水溫為(19.5±0.5)℃; 稚魚直接放入實驗水箱中暴露96h, 每組30尾, 水溫為(22.0±1.0)℃。仔稚魚試驗期間每隔0.5h觀察魚體狀態(tài), 每隔4h統(tǒng)計魚體死亡數(shù), 同步監(jiān)測并調(diào)節(jié)水體飽和度。當(dāng)死亡的仔稚魚統(tǒng)計完后, 第一時間在實驗室解剖鏡下觀察其體表特征然后進行解剖并觀察其血管及內(nèi)臟特征, 同時進行拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)整理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21進行統(tǒng)計分析, 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(Mean±SD)表示, 采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)并通過Duncan多重比較檢驗組間的差異顯著性,P<0.05表明組間數(shù)據(jù)具有顯著差異。通過數(shù)據(jù)擬合, 發(fā)現(xiàn)稚魚死亡率與暴露時間符合方程; 并且通過回歸方程計算不同TDG飽和度水體中的半致死時間LT50=b1/ln(0.5–b0), 其中b0和b1均為常數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 仔稚魚實驗狀態(tài)與主要特征

實驗過程中死亡的仔魚先后出現(xiàn)身體失衡, 漂浮在水面打轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。鏡檢發(fā)現(xiàn)其腹腔內(nèi)有氣泡,嚴(yán)重時會出現(xiàn)圍胸腔漲破的情況。

死亡的稚魚先后出現(xiàn)呼吸急促, 反應(yīng)敏感, 時而水底快速游動時而沉在水底的現(xiàn)象, 最后身體失衡側(cè)浮于水面, 直至死亡。鏡檢發(fā)現(xiàn)其身體體表多處, 如眼睛、口腔周圍和腹部體表出現(xiàn)局部隆起、充血現(xiàn)象, 鰭條觀察到有細(xì)小氣泡; 體內(nèi)腸道中也發(fā)現(xiàn)存在大量氣泡, 嚴(yán)重時整個魚體的腹腔都會充滿氣泡; 稚魚的血管及圍心腔等重要器官及部位處均發(fā)現(xiàn)有氣泡存在(圖2)。

圖2 仔稚魚氣泡病特征Fig. 2 Characteristics of gas bubble disease in larval and juvenile

2.2 TDG過飽和水體對長江鱘受精卵孵化的影響

圖3顯示長江鱘受精卵在不同梯度TDG過飽和水體中的孵化情況。其中對照組孵化率為(79±3)%, 140%組的孵化率為(78±2)%, 與對照組孵化率之間無顯著差異(P>0.05); 110%組的孵化率為(84±0)%, 顯著高于對照組(P<0.05); 120%和130%組的孵化率分別為(92±2)%和(91±1)%, 兩組孵化率之間無差異(P>0.05), 均顯著高于其他組(P<0.05)。

圖3 受精卵孵化率與TDG飽和度的關(guān)系(平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差,n=3)Fig. 3 Relationship between hatchability and saturation of fertilized eggs (Mean±SD, n=3)

2.3 TDG過飽和水體對長江鱘仔魚的影響

圖4和圖5顯示不同梯度TDG過飽和水體對長江鱘仔魚的影響情況。對照組未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象;110%組開始出現(xiàn)死亡的時間為32h, 在48h后停止死亡, 最終死亡率為(3.45±0.12)%; 120%組開始出現(xiàn)死亡的時間為48h, 在60h后停止死亡, 最終死亡率為(3.45±0.00)%; 130%組開始出現(xiàn)死亡的時間為48h, 在64h后停止死亡, 最終死亡率為(5.59±1.86)%,死亡率最高; 140%組開始出現(xiàn)死亡的時間為48h,在48h后停止死亡, 最終死亡率為(1.15±1.99)%, 死亡率最低。通過對各組的最終死亡率進行單因素方差分析, 發(fā)現(xiàn)不同TDG飽和度之間死亡率存在一定差異, 其中110%組與120%組、130%組之間無明顯差異(P>0.05), 110%組、120%組與140%組之間無顯著差異(P>0.05), 對照組與140%組之間無明顯差異(P>0.05), 130%組與140%組之間差異性顯著(P<0.05)。

圖4 仔魚暴露時間與死亡率的關(guān)系(平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差, n=3)Fig. 4 Relationship between time and mortality of larvae(Mean±SD, n=3)

圖5 仔魚死亡率與TDG飽和度的關(guān)系(平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差, n=3)Fig. 5 Relationship between mortality and saturation of larvae(Mean±SD, n=3)

2.4 TDG過飽和水體對長江鱘稚魚的影響

從圖6和圖7可看出, 對照組(90%)未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象; 140%組在暴露4h后即開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,88h后死亡率達(dá)到(100.00±0.00)%; 130%組在暴露8h后開始出現(xiàn)死亡, 96h后死亡率達(dá)到(83.33±2.72)%;120%組在暴露16h后開始出現(xiàn)死亡, 96h后死亡率為(60.00±6.67)%; 110%組在暴露32h左右即開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象, 96h后死亡率僅達(dá)到(53.33±13.33)%。通過對TDG飽和度和死亡率進行單因素方差分析,發(fā)現(xiàn)不同TDG飽和度之間死亡率存在一定差異, 其中110%組和120%組無顯著性差異(P>0.05); 對照組、120%組、130%組和140%組之間均相互存在顯著差異 (P<0.05)。綜上可知, 4個梯度TDG飽和度均可導(dǎo)致稚魚死亡, 且在一定范圍內(nèi), 過飽和濃度越高, 最終死亡率越高(P<0.05)。

圖6 稚魚暴露時間與死亡率的關(guān)系(平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差, n=3)Fig. 6 Relationship between time and mortality of juvenile (Mean±SD, n=3)

圖7 稚魚死亡率與TDG飽和度的關(guān)系(平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差, n=3)Fig. 7 Relationship between mortality and saturation of juvenile(Mean±SD, n=3)

通過對數(shù)據(jù)進行擬合分析, 發(fā)現(xiàn)長江鱘稚魚死亡率與暴露時間之間符合方程, 并通過計算得出各TDG飽和度下半致死時間(LT50)。如表1所示, 在TDG飽和度為110%、120%、130%和140%的水體中, 長江鱘的半致死時間分別為100.86h、79.58h、34.14h和14.49h。在一定范圍內(nèi), TDG飽和度越高, 稚魚的半致死時間越短。

表1 長江鱘稚魚在不同飽和度下的半致死時間Tab. 1 LT50 of Acipenser dabryanus juvenile in different TDG levels

3 討論

3.1 TDG過飽和對長江鱘受精卵孵化的影響

國內(nèi)外學(xué)者將不同魚類的受精卵暴露在過飽和水體中, 得出的結(jié)論不盡相同。Meekin等[15]研究發(fā)現(xiàn)在同一個孵化場內(nèi)飽和度為112%的水體中,虹鱒魚卵發(fā)生了嚴(yán)重的死亡, 但大鱗大馬哈魚受精卵卻沒有受到影響。Liang等[13]研究發(fā)現(xiàn), 過飽和水體會造成重口裂腹魚受精卵的孵化率降低。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)過飽和水體會降低胭脂魚的孵化率。楊傳順等[14]發(fā)現(xiàn)飽和度為110%水體對鰱受精卵孵化有明顯促進作用, 且出膜時間比對照組早。孫井沛等[17]發(fā)現(xiàn)過飽和水體對胭脂魚受精卵孵化有促進作用。本研究的結(jié)果表明, 水溫為19.0—20.0℃, 受精卵在對照組中孵化率為80%左右, 這和杜浩等[18]的研究的結(jié)論基本是一致的。TDG飽和度為140%的水體中的孵化率與對照組基本一致(P>0.05), 在110%、120%和130%的飽和水中的孵化率高于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明, TDG飽和度為110%、120%、130%的水體對長江鱘受精卵的孵化率有顯著促進作用, 140%的水體對其孵化率無影響。這說明在一定范圍內(nèi), TDG高飽和水體對長江鱘受精卵孵化有一定促進作用, 但是在超過一定范圍后促進作用不明顯。在水溫和鹽度都穩(wěn)定的情況下, 氧氣是魚類的胚胎發(fā)育及孵化的關(guān)鍵因素。氧氣滿足細(xì)胞的呼吸, 氧氣分壓可以影響呼吸強度。胚胎發(fā)育初期外界環(huán)境中與氧氣的分壓對于胚胎呼吸強度并沒有影響, 當(dāng)胚胎的心臟已起作用, 血液中有血紅蛋白出現(xiàn)時, 氧氣分壓的增高會增加它的耗氧量, 有充足的氧可以保證胚胎的正常生活及發(fā)育, 甚至可能有利于孵化率的提高[19]。水體飽和度增加, 溶氧含量及溶氧分壓會高于正常值,同時受精卵周邊也會附著較多氣泡, 減少氧氣傳輸?shù)耐ǖ? 氧氣和氣泡之間有可能存在一個平衡, 導(dǎo)致在一定飽和度范圍內(nèi)可促進長江鱘受精卵孵化率, 超過這個范圍對孵化影響不大。

3.2 TDG過飽和對長江鱘仔稚魚的影響

研究結(jié)果表明, 長江鱘仔稚魚在過飽和水體中均會出現(xiàn)死亡現(xiàn)象, 但是死亡率與TDG飽和度之間的規(guī)律卻不相同。暴露在TDG過飽和水體中的仔魚, 130%組的死亡率最高, 110%和120%組死亡率次之, 140%組的死亡率最低, 飽和度和死亡率之間沒有明顯相關(guān)關(guān)系; 而在一定飽和度范圍內(nèi), 長江鱘稚魚的死亡率與飽和度之間呈正相關(guān)關(guān)系, 飽和度越高, 死亡率越大。這說明不同TDG飽和度的過飽和水體均可導(dǎo)致長江鱘仔稚魚死亡, 但對仔魚影響程度較小, 且死亡率與TDG飽和度之間無顯著關(guān)聯(lián); 對稚魚影響程度較大, 在研究范圍內(nèi), 影響程度隨飽和度的增加呈增大趨勢。

筆者認(rèn)為仔稚魚出現(xiàn)這種現(xiàn)象應(yīng)該和呼吸代謝及血液循環(huán)有關(guān)。在仔魚階段魚類的呼吸器官未發(fā)育完全, 其呼吸主要通過體表皮膚、鰭褶和卵黃囊等進行呼吸[20]。此時的心血管系統(tǒng)發(fā)育不完全, 故水體中的過飽和氣體對其作用有限, 而仔魚的腹腔一般會氣泡或者氣栓, 表明其有可能通過吞食水體過飽和氣體導(dǎo)致腹腔飽滿從而餓死或者圍胸腔漲破致其死亡。

血液循環(huán)系統(tǒng)的功能, 是把外界吸收來的養(yǎng)料和氧氣輸送到體內(nèi)各個組織和器官內(nèi), 并把機體生命活動所形成的代謝產(chǎn)物運送到排泄器官[21]。通過進行解剖學(xué)觀察, 發(fā)現(xiàn)在稚魚的血管、圍心腔、腸道、鰭條、眼部、口腔和腹部體表組織發(fā)現(xiàn)氣泡, 甚至一些組織出現(xiàn)充血現(xiàn)象, 這些特征和Yuan等[22]發(fā)現(xiàn)的基本一致。有些學(xué)者[23,24]認(rèn)為暴露在TDG過飽和水體中的魚體主要通過呼吸系統(tǒng)將氣體運送至血液, 然后隨著血液循環(huán)系統(tǒng)傳至各個組織, 并在組織中富集, 導(dǎo)致組織及血管中內(nèi)外壓力失去平衡, 對組織產(chǎn)生破壞, 從而導(dǎo)致其死亡。

在本研究中, 在一定范圍內(nèi), 隨著TDG飽和度的增大, 長江鱘稚魚的死亡率越高, 其在水體中耐受的時間越短, 且半致死時間越短。這與Liu等[25]的結(jié)論基本一致, 但在相同飽和度下, 半致死時間存在一定差異。其體長為(13.4±1.3) cm的長江鱘在TDG飽和度為130%和140%的水體中的半致死時間分別為2.61h和2.23h, 本文中體長為(8.38±0.37) cm的長江鱘在TDG飽和度為130%和140%的水體中半致死時間分別為34.14h和14.49h。通過比較認(rèn)為出現(xiàn)這種情況可能與個體規(guī)格有關(guān), 規(guī)格越小, 對TDG過飽和水體的耐受性越強。Xue等[26]發(fā)現(xiàn), 在同一TDG飽和度下, 大規(guī)格的巖原鯉和齊口裂腹魚的死亡率高于小規(guī)格的個體。Fan等[27]研究發(fā)現(xiàn)在相同TDG飽和度下, 小規(guī)格的草魚的半致死時間較高, 這與筆者關(guān)于在相同TDG飽和度下, 較小規(guī)格的魚體耐受時間長的結(jié)論是相符的。同時本文中在相同TDG飽和度下, 稚魚的死亡率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于仔魚的死亡率, 說明不同發(fā)育階段的魚體對TDG過飽和水體的耐受性也會存在差異。Counihan等[28]將不同發(fā)育階段高首鱘暴露在TDG飽和度為118%和131%的水體中, 發(fā)現(xiàn)在孵化后6d內(nèi)的高首鱘, 出膜時間越久, 對氣體飽和度的忍耐性越弱, 越容易出現(xiàn)氣泡病。楊傳順等[14]將不同發(fā)育階段的鰱暴露在過飽和水體中, 也發(fā)現(xiàn)白鰱仔魚對飽和水體的耐受性較高, 日齡較大的稚幼魚對飽和水體的耐受性較低; 這與筆者的研究結(jié)果相一致。